缺血再灌注下調(diào)腦血管內(nèi)皮細胞經(jīng)典Wnt 信號通路的分子機制

曹杰，趙強，黃旭華

（1.江西省贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，贛州 341000；2.江西省贛州市赤土衛(wèi)生院內(nèi)科，贛州 341400）

腦卒中，也稱腦中風，是腦部局部受損而出現(xiàn)的血管疾病，是由血管堵塞、破裂引起腦缺氧，出現(xiàn)病變或壞死癥狀的一種疾病[1-2]。 腦卒中具有發(fā)病率高、致死致殘率高和復發(fā)率高的特點。 腦卒中是我國居民死亡和殘疾的首要原因之一， 每年大約有270 萬新發(fā)患者，且呈逐年上升趨勢[3]。 缺血性腦血管病是指局部腦組織由于供血障礙發(fā)生的變性、壞死或者一過性的功能喪失性疾病，是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一，好發(fā)于老年人群，且致殘率與病死率均較高。 引起缺血性腦血管病的原因包括動脈硬化、血管炎、先天性血管病、外傷、藥物血液病等。 臨床常見癥狀包括單側面部麻木或肢體麻木、無力、語言障礙、眩暈伴嘔吐、既往少見的嚴重頭痛、意識障礙或抽搐等。 血腦屏障高度選擇性地輸送血液中的有益物質進入大腦， 同時嚴格限制血液中的有害物質通過， 從而保持大腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定[4]。 急性缺血性腦卒中患者腦部缺血經(jīng)灌注后將破壞血腦屏障， 血液成分中炎癥因子分泌更加加重癥狀[5]。 近年來，抑制缺血再灌注導致的血腦屏障損傷已成為治療腦卒中的新思路。 深入探索缺血性腦卒中之后血腦屏障功能的分子調(diào)控機制， 開發(fā)具有應用前景的新穎蛋白或分子藥物，有利于臨床治療腦卒中。 故本研究以IL-1β、TNF-α、IL-6 處理腦血管內(nèi)皮細胞，找到引起Wnt 通路受抑的因子， 為治療腦缺血損傷研發(fā)蛋白或分子藥物提供方向。

1 材料及方法

1.1 實驗試劑與儀器 清潔雄性大鼠購自江西省動物實驗中心(重量180～210g)，ICAM-1 和VCAM-1及β-catenin、cyc-lin D1 兔抗大鼠抗體購于博奧森生物技術有限公司，PCR 試劑盒、逆轉錄試劑盒購于撫生實業(yè)有限公司。實驗所用培養(yǎng)試劑購于裕恒豐科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型構建 線栓法構建缺血再灌注小鼠模型。 刮掉小鼠頸部毛發(fā)，切開皮膚，暴露各動脈，在頸外動脈剪出小口，將線栓從頸外動脈插進血管至頸總動脈，剪斷頸外動脈，線栓掉頭插進頸內(nèi)動脈，避開翼腭動脈插入。 最后用沾有生理鹽水的無菌紗布覆蓋皮膚切開。 缺血40 min 后立即取出線栓，縫合皮膚，形成缺血再灌注模型。將模型隨機分為四組， 分別是對照組、IL-1β 組、TNF-α 組、IL-6組， 對照組不用任何藥物處理，TNF-α 組用10 nmol/L 的TNF-α 處理，IL-1β 組用10 nmol/L 的IL-1β 處理，IL-6 組用10 nmol/L 的IL-6 處理，取大鼠腦組織， 分離出腦血管內(nèi)皮細胞， 置入RPMI1640 培養(yǎng)基(100 mL/L 胎牛血清)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)情況，培養(yǎng)液一日一換，長滿至80%左右開始消化傳代。

1.2.2 蛋白印跡檢測腦組織Wnt 通路β-catenin、cyc-lin D1 表達 提取各組樣本的總蛋白并測定總蛋白濃度， 電泳、 凝膠后轉移至PVDF 膜， 放進TBST 液中封閉2 h，添加一抗(β-catenin 單克隆抗體1∶1000，cyc-lin D1 多克隆抗體1∶1000，β-actin單克隆抗體1∶1000)。孵育過夜，洗膜后添加二抗(1∶5000)孵育1 h，洗膜后用膠片曝光。

1.2.3 RT-PCR 檢測ICAM-1 及VCAM-1mRNA 水平 提取總RNA 逆轉錄。 用Primier 5.0 引物設計軟件設計ICAM-1、VCAM-1 及GADPH 引物。 PBS漂洗、裂解、離心收集上清液RNA，清洗、離心、揮干樣品加入適量DEPC 水充分沉淀后打散備用。抽提的RNA 反轉錄得到cDNA， 以cDNA 為模板擴增。根據(jù)所得的Ct 均值，通過2-ΔΔCt法計算ICAM-1及VCAM-1 相對表達量（ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=Ct實驗組-Ct對照組)。 見表1。

表1 引物序列

1.2.4 Western blot 法檢測ICAM-1 及VCAM-1 蛋白水平 提取總蛋白并測定濃度。 電泳、轉膜封閉后，分別加入一抗(1∶1000)ICAM-1 及VCAM-1,4℃孵育過夜。 加入二抗(1∶5000)ICAM-1 及VCAM-1室溫孵育,ECL 液顯色，X 片顯影、 定 影。 采用Image J 圖像分析測定Western blot 條帶灰度值，結果以目的蛋白與GADPH 灰度值的比值作為目的蛋白表達相對水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 SPSS 分析數(shù)據(jù)， Skewness 和Kurtosis 檢驗資料正態(tài)分布， 計量資料采用leneve檢驗方差齊性，以(x±s)表示。 兩組比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05 為差異顯著。Image J 處理蛋白表達量圖片，計算相對表達量。

2 結果

2.1 各組β-catenin、cyc-lin D1 水平 較之對照組，IL-1β 組和IL-6 組的β-catenin、cyc-lin D1 水平無明顯差異(P>0.05)，TNF-α 組β-catenin、cyclin D1 水平下調(diào)(P<0.05)，TNF-α 可抑制Wnt 通路蛋白表達，見圖1、圖2。

圖1 各組β-catenin、cyc-lin 水平

圖2 各組Wnt 通路蛋白相對表達量

2.2 ICAM-1 及VCAM-1mRNA 水平 較之對照組，IL-1β 組 和IL-6 組 的CAM-1 及VCAM-1 mRNA 水平無明顯差異(P>0.05)，TNF-α 組ICAM-1 及VCAM-1 mRNA 水平上調(diào)(P<0.05)。 見圖3。2.3 ICAM-1 及VCAM-1 蛋白水平 較之對照組，IL-1β 組和IL-6 組ICAM-1 及VCAM-1 蛋白含量沒有明顯差異 (P>0.05)，TNF-α 組ICAM-1 及VCAM-1 蛋白水平上調(diào)(P<0.05)。 見圖4、圖5。

圖3 各組ICAM-1 及VCAM-1mRNA 水平

圖4 各組ICAM-1 及VCAM-1 蛋白水平

圖5 各組ICAM-1 及VCAM-1 相對表達量

3 討論

在腦缺血再灌注損傷中，PI3K/Akt 信號通路可以通過調(diào)控GSK-3β 進而影響Wnt/β-catenin 信號通路，這為深入研究PI3K/Akt 和Wnt/β-catenin信號通路在缺血性腦損傷中的協(xié)同作用機制提供重要線索。

本研究通過構建腦缺血灌注模型， 分離出大鼠腦組織，經(jīng)不同條件培養(yǎng)后檢測到的結果，表明了TNF-α 可以下調(diào)Wnt 通路信號表達，能夠引起ICAM-1 和VCAM-1 水平升高， 而IL-1β 和IL-6未有明顯影響， 說明TNF-α 是引起腦缺血灌注損傷的原因之一。

腦缺血再灌注損傷作為預后效果不佳的首要因素，其進程復雜，涉及多個病理環(huán)節(jié)，多受氧自由基和炎癥細胞影響， 炎癥因子合成及分泌引起炎癥，是導致?lián)p傷的首要因素[6]。IL-1β 作為炎癥因子具有破壞機體組織功能的作用。 IL-6 涉及體液免疫，是過敏反應首要因素。TNF-α 會導致血管損傷，加重組織液積聚程度，這三種炎癥因子對于疾病組織的修復影響較大[7]。 細胞黏附因子為膜表面蛋白，表達受機體各種反應影響，可增加細胞間黏附性，在炎癥中具有重要影響[8]。 其中ICAM-1 和VCAM-1 屬免疫球蛋白超家族黏附分子， 主要表達在血管內(nèi)皮細胞表面[9]。 一般ICAM-1 和VCAM-1 在機體組織中含量低，并不能明顯檢測到，處于低表達狀態(tài)，但當腦組織出現(xiàn)缺血狀況，局部組織缺氧致?lián)p傷，損傷的組織將分泌大量炎癥因子，炎癥因子堆積， 加重損傷程度， 并提高ICAM-1、VCAM-1 水平[10]，ICAM-1、VCAM-1 的急劇增加會促進細胞黏附， 最終同樣導致堵塞， 血液流通受阻，加重缺血狀況和損傷程度[11]，同時白細胞分泌物會導致出血癥狀，加劇局部缺血程度。 以上是造成腦缺血再灌注引起損傷的原因[12-13]。

此次研究在分子水平發(fā)現(xiàn)TNF-α 下調(diào)Wnt通路蛋白水平，并上調(diào)ICAM-1 和VCAM-1 水平，降低腦缺血疾病患者TNF-α 水平有望提高患者預后狀況。 趙德福等[14]、姚立巖等[15]、蔣月麗等[16]和陳博威等[17]的研究表明TNF-α 水平越高，大鼠腦缺血灌注損傷的程度就越大，不利于腦組織的修復，而且TNF-α 還能加重炎癥反應， 加深腦血管內(nèi)皮損傷， 進而導致血栓的形成， 不利于腦部血液循環(huán)；TNF-α 水平可以反映腦卒中患者的嚴重程度，對衡量患者預后效果具有極高的參考價值； 降低TNF-α 水平可以有效地修復腦組織的損傷。 本研究說明Wnt 通過影響TNF-α 能夠上調(diào)ICAM-1和VCAM-1 水平， 導致大鼠缺血腦組織腦屏障功能下降， 這是TNF-α 影響缺血腦損傷的一個通路機制， 了解TNF-α 引起通路蛋白水平變化的機制將對改善腦缺血癥狀有指導意義， 降低TNF-α 在組織的水平、激活Wnt 通路，將有望作為治療缺血腦卒中患者的一個研究方向。

綜 上 所 述，TNF-α 可 下 調(diào)Wnt 通 路， 上 調(diào)ICAM-1 和VCAM-1 水平，降低腦屏障功能。 降低腦缺血組織內(nèi)TNF-α、 激活Wnt 通路蛋白合成是改善缺血腦損傷的一個方向， 對于研制分子特異性藥物具有指導意義。