加味四君子湯對(duì)燙傷腸黏膜及炎癥因子的影響

許志俊，羅錦花，詹劍華，程興，黃凱

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷科，南昌 330006）

在機(jī)體遭受嚴(yán)重的打擊后往往最先引發(fā)腸道的感染。 腸道感染可能導(dǎo)致敗血癥和MODS，在這些情況下，腸源性感染被認(rèn)為是主要的死亡原因。腸道菌群與黏膜固有免疫力之間的相互作用會(huì)受到嚴(yán)重干擾。 先天性免疫失調(diào)，微生物群失調(diào)和細(xì)菌易位似乎會(huì)形成正反饋回路，共同導(dǎo)致嚴(yán)重疾病中不可控制的炎癥反應(yīng)和敗血癥等并發(fā)癥[1]。 腸道黏膜免疫屏障在機(jī)體免疫系統(tǒng)至關(guān)重要。四君子加味湯可以明顯加強(qiáng)腸道黏膜免疫，調(diào)節(jié)腸道菌群[2]。患者燒傷程度越深，面積越大，持續(xù)時(shí)間越久，引起血清炎性因子TNF-α 明顯增加[3]。 四君子湯是我國(guó)中醫(yī)經(jīng)典的補(bǔ)益劑，常用于臨床胃腸道疾病。人參、茯苓、白術(shù)和甘草組成傳統(tǒng)的四君子湯，而本研究使用黨參替代人參， 并增加黃芪和薏苡仁用來增強(qiáng)其對(duì)腸道黏膜的保護(hù)及抗炎作用。 加味四君子湯對(duì)腸道功能的保護(hù)， 可能是通過降低炎癥因子來實(shí)現(xiàn)的。 因此本實(shí)驗(yàn)在30% TSBAIII 度燙傷兔模型上， 觀察嚴(yán)重燙傷后腸道屏障功能及炎癥標(biāo)記物， 討論不同濃度的加味四君子湯對(duì)其的影響，并找到最佳療效濃度及所需時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 加味四君子湯制備 中藥：黨參300 g、白術(shù)300 g、茯苓350 g、甘草150 g、黃芪300 g、薏仁200 g，藥材來源于南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院。把中草藥一起放入藥鍋中先用0.9% NaCl 5000 mL 浸泡30 min 后，再加入0.9% NaCl 5000 mL 煮沸后小火熬60 min，濾去殘?jiān)?，可得藥?20 mL,生藥濃度為5.0 g/mL，4 ℃保存，用蒸餾水配比出不同濃度的藥液分組實(shí)驗(yàn)。

1.2 動(dòng)物分組、處理與制模

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 90 只兔， 重2.0 kg 左右，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自南昌龍平兔業(yè)有限公司，許可編碼：SCXK(jiangxi)2014-0005。隨機(jī)分5 組，每組18 只，A 組：自飲水。 B 組：傷后，給予0.9% NaCl 灌胃，10 mL/次，tid。C 組（0.2 g/mL）：傷后，給予0.2 g/mL加味四君子湯灌胃，10 mL/次，tid。 D 組（1.0 g/mL）：傷后， 給予1.0 g/mL 加味四君子湯灌胃，10 mL/次，tid。 E 組（5.0 g/mL）：傷后，給予5.0 g/mL 加味四君子湯灌胃，10 mL/次，tid。 在灌胃后第1、3、7 d各6 只用于取樣和檢測(cè)。

1.2.2 燙傷組制備 實(shí)驗(yàn)兔稱重后， 用速眠新肌松后再以水合氯醛腹腔麻醉，電動(dòng)剃須刀背部剃毛，禁食12 h。 第二天，以同樣方法麻醉實(shí)驗(yàn)兔，熱水（90～92℃）燙傷時(shí)間設(shè)置為20 s，造成30%TSBAIII度燙傷。 燙傷后給予每千克40 mL 的乳酸鈉林格抗休克，用碘伏對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行常規(guī)消毒，防止創(chuàng)面感染影響實(shí)驗(yàn)觀察。 取兔注入空氣處死， 取回腸黏膜，用0.9% NaCl 漂洗后，放入甲醛中保存，貯存于4 ℃冰箱。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察各組兔燙傷后回腸黏膜組織病理學(xué)形態(tài)變化情況。 行ELISA 檢測(cè)不同組燒傷后第1d、3d、7d 的回腸黏膜中炎癥因子：TNF-α、IL-1β、IL-10。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，用（x±s）表示。 三組及以上數(shù)據(jù)用χ2檢驗(yàn)，兩組比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組回腸黏膜病理學(xué)形態(tài)變化 燙傷前可見皮膚正常，傷后2 min 可見皮膚變紅，傷后第1 d，可見水泡形成，皮膚彈性差，傷后第3 d、7 d，見皮膚焦黃，水分基本丟失，分界清晰，硬如皮革。 可見病理學(xué)形態(tài)改變： 鏡下可見炎性細(xì)胞大量彌散在燙傷的組織附近，絨毛結(jié)構(gòu)基本被破壞，組織明顯腫脹及滲出。 A 組：回腸黏膜無明顯改變；B 組：回腸黏膜可見炎性細(xì)胞大量彌散在燙傷的組織附近，絨毛壞死，組織腫脹及滲出明顯。 給藥組療效與時(shí)間正相關(guān)，以D 組（1.0 g/mL）濃度給藥7 d 療效最好。 見圖1。

圖1 回腸黏膜病理學(xué)形態(tài)變化

2.2 加味四君子湯對(duì)回腸黏膜組織中炎癥因子TNF-α 值的影響 在同一天， 與A 組比較，B 組中的TNF-α 值顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與B 比較，第1 d D 組TNF-α 值顯著降低；在第3 d、第7 d，低、中、高劑量3 個(gè)組中的TNF-α 值均明顯下降，與C 組比較，在第1 d D 組TNF-α 值顯著降低；在第3 d、第7 d 的時(shí)間點(diǎn)，D 組和E 組中的TNF-α 值表達(dá)都顯著降低；與E 組比較，各時(shí)間點(diǎn)的D 組中的TNF-α 值都明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表1。 A 組中的第1 d、第3 d、第7 d 炎癥因子TNF-α 值基本保持同等水平， 無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在B 組，隨著時(shí)間進(jìn)展TNF-α 值逐步上升且在第7 d 達(dá)到最高；在D 組和E 組,7 d 內(nèi)伴隨用藥時(shí)間延長(zhǎng)TNF-α 值逐步降低, 第7 d 降到最低。

表1 加味四君子湯對(duì)回腸黏膜組織TNF-α 水平的影響

2.3 加味四君子湯對(duì)回腸黏膜組織中炎癥因子IL-1β 值的影響 在同一天， 與A 組比較，B 組中的IL-1β 值顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與B 組比較，第1 d D 組中的IL-1β 值顯著降低；在第3 d、第7 d，低、中、高劑量組中的IL-1β 值均下降；與C 組比較，在第1 d D 組中的IL-1β 值顯著降低，在第3 d、第7 d，D 組和E 組中的IL-1β值顯著降低；與E 組比較，同一天中的IL-1β 值，D組都顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表2。 A 組中的第1 d、第3 d、第7 d 炎癥因子IL-1β值基本保持同等水平， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 在B組，IL-1β 值逐步上升，在第7 d 達(dá)到最高峰；在D組和E 組中隨著時(shí)間進(jìn)展IL-1β 值逐漸下降且在第7 d 達(dá)到最低。

表2 加味四君子湯對(duì)回腸黏膜組織IL-1β 水平的影響

2.4 加味四君子湯對(duì)回腸黏膜組織中炎癥IL-10值的影響 在同一天， 與A 組比較，B 組的IL-10值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與B 組比較，在第1 d，D 組中IL-10 值顯著上升，在第3 d 和第7 d，C、D、E 三個(gè)組中的IL-10 值都明顯升高；與C 組比較，第1d，D 組中IL-10 值顯著上升，在第3 d、第7 d，D 組和E 組中的IL-10 值顯著上升； 與E 組比較， 同一天，D 組中IL-10 值顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。A 組中的第1 d、第3 d、第7 d 炎癥因子IL-10 值基本保持同等水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在B 組，IL-10 值逐步降低，第7 d 達(dá)到最低；在D 組和E 組IL-10 值逐步上升，第7 d 達(dá)到最峰值。

表3 加味四君子湯對(duì)回腸黏膜組織IL-10 水平的影響

3 討論

在遭受到嚴(yán)重?zé)齻那闆r下，機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，供血的重新分布，腸道黏膜缺血導(dǎo)致黏液層形成的黏膜屏障遭到破壞，炎性標(biāo)記物會(huì)增加，腸道的免疫屏障功能同樣遭到破壞[4]。 這兩個(gè)屏障的相互作用維持了正常的腸道功能和穩(wěn)定的腸道環(huán)境。 完整的腸道屏障不僅僅可減少各種病原體的入侵，對(duì)于內(nèi)環(huán)境動(dòng)態(tài)平衡也起到不可缺失的作用[5]。 嚴(yán)重的灼傷可能會(huì)導(dǎo)致腸道炎癥因子釋放和氧化應(yīng)激， 從而導(dǎo)致腸道屏障損傷和腸道功能障礙。 在嚴(yán)重?zé)齻闹委熤?，需要采取相?yīng)療法來減輕全身炎癥反應(yīng)并控制氧化應(yīng)激的負(fù)擔(dān)[6]。 嚴(yán)重的燒傷可導(dǎo)致腸道炎癥因子釋放， 第一個(gè)損害的免疫器官大多是腸道免疫器官[7]。

四君子湯調(diào)控腸道菌群、扶植優(yōu)勢(shì)菌群、增強(qiáng)菌群多樣性和抑制致病菌群繁殖[8-9]。 而本研究中的加味四君子湯以黨參代替人參， 從中醫(yī)理論的補(bǔ)虛癥上黨參可替換人參， 并且在免疫促進(jìn)功能上黨參多糖更具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[10]。之前課題研究表明黃芪多糖可改善腸道的黏膜和增強(qiáng)腸道的免疫細(xì)胞S-IGA 分泌[11]。 薏苡仁在中藥理論中有著祛濕利水的作用，可以促進(jìn)腸道菌群的調(diào)節(jié)，加快腸道細(xì)胞的更新代謝[12]。本課題之前在嚴(yán)重燙傷大鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，各種炎癥因子上升，加味四君子湯（用藥濃度1.0 g/mL）可以減少炎癥因子釋放，抑制炎癥細(xì)胞附著腸黏膜上，從而對(duì)腸道的黏膜系統(tǒng)起到保護(hù)作用[13]。 當(dāng)前，在中藥監(jiān)管當(dāng)局的研究開發(fā)中， 關(guān)于單一中藥和單體成分的研究在增加，關(guān)于復(fù)方藥劑的研究卻很少，且不夠充分。 但是，充分發(fā)揮復(fù)方藥劑中各種藥物的協(xié)同效果正是中藥的本質(zhì)，在實(shí)際應(yīng)用中還有很多優(yōu)點(diǎn)。

腫瘤壞死因子-α 來自巨噬細(xì)胞，常隨炎癥反應(yīng)而出現(xiàn)。 梁建國(guó)[14]等人發(fā)現(xiàn)TNF-α 在燒傷后平均第1～3 d 達(dá)到高峰，對(duì)燒傷患者病情評(píng)估、演變及預(yù)后具有一定治療指導(dǎo)。 嚴(yán)重的燒傷會(huì)誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞因子的大量分泌。 在這些因素中，TNF-α 和NF-κB 被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的關(guān)鍵。 燒傷可引起 血 清 中 生 成 大 量 的IL-1β、IL-6、MCP-1 和CRP，燒傷后可引發(fā)生全身性炎癥反應(yīng)[15]。傷后IL-1β 可以與TNF-α 可以相互促進(jìn)加重反應(yīng)[16]。 IL-10 是人體不可缺失的抗炎因子之一, 對(duì)于其他的炎癥因子的合成和釋放有一定促進(jìn)作用,其還可以抑制單核或巨噬細(xì)胞抗原表達(dá)、抑制TNF-α 受體的表達(dá)及釋放、抑制免疫、 可維持促炎和抗炎因子的動(dòng)態(tài)平穩(wěn)[17-18]。

綜上所述，檢測(cè)到燙傷組中回腸黏膜的TNFα 和IL-1β 的表達(dá)水平升高，相反抗炎癥因子IL-10 表達(dá)水平下降， 說明燙傷可能刺激腸道炎癥反應(yīng)，是嚴(yán)重?zé)齻缙谀c屏障損害的機(jī)制之一。 由本實(shí)驗(yàn)可知， 加味四君子湯用藥濃度為1.0 g/mL 時(shí)TNF-α 和IL-1β 值明顯下降，IL-10 值明顯升高，并且這種效果在持續(xù)7 d 后效果更佳。也證實(shí)加味四君子湯對(duì)燒傷后引起的腸道炎癥反應(yīng)有一定的調(diào)控作用， 為尋求改善腸道功能提供新思路，而其對(duì)嚴(yán)重燙傷兔腸黏膜的作用靶點(diǎn)及相關(guān)機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究。