赤松枯梢病生防真菌M75的篩選和鑒定1)

張銘 謝憲 梁軍 程元 張星耀 馮磊 時(shí)良

(中國林業(yè)科學(xué)研究院，北京，100091) ( 山東昆崳山森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測(cè)研究站)

松枯梢病，又名松梢枯病，是世界范圍內(nèi)在針葉樹種上分布最廣最常見的重要林木枝干病害之一。該病害的病原存在基因型的分化，在中國引起松枯梢病的病原菌是C型松球殼孢菌(Sphaeropsissapinea)[1]。松枯梢病的寄主有樟子松(Pinussylvestnis)[2]、馬尾松(Pinusmassoniana)、火炬松(Pinustaeda)、歐洲赤松(Pinussylvestris)、北美短葉松(Pinusbanksiana)、輻射松(Pinusradiata)[3]、紅松(Pinuskoraiensis)[4]等，可侵染8屬約60多種針葉樹[5]。松枯梢病導(dǎo)致的頂芽壞死、枯梢、枝干潰瘍、流脂壞死等癥狀，對(duì)松林造成了嚴(yán)重危害[6]。除上述寄主外，王婧等[7]在油松上也分離得到松枯梢病原菌；謝憲等[8]在進(jìn)行昆崳山赤松內(nèi)生真菌多樣性調(diào)查時(shí)，通過高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)赤松上也存在松枯梢病原菌侵染，進(jìn)一步證明了松枯梢病原菌的寄主范圍正逐漸擴(kuò)大。因此，現(xiàn)階段亟待尋求有效防控松枯梢病的方法。

對(duì)于松枯梢病防治的研究，主要集中在營林技術(shù)措施及化學(xué)防治方面[9]。但目前營林措施還停留在理論階段，無法為松枯梢病的防治提供實(shí)際指導(dǎo)。而長(zhǎng)期過量施用化學(xué)農(nóng)藥增加了防控成本，長(zhǎng)此以往會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性，甚至引起病害的再度流行[10]，嚴(yán)重破壞生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。近年來，生物防治被越來越多的研究者認(rèn)為是防治植物病害的最佳策略之一[11]。張麗等[12]提出，微生物防治就是要利用有益微生物，通過微生物之間的競(jìng)爭(zhēng)、抗生、寄生溶菌作用及誘導(dǎo)抗性等，抑制病原菌的存活和發(fā)展。生物防治控制時(shí)間長(zhǎng)、易于開發(fā)，可大幅節(jié)約防控成本，其可通過利用拮抗微生物及其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物達(dá)到病害防控目的，是對(duì)環(huán)境、資源都更加友好的調(diào)控手段。目前，在許多已鑒定的生防微生物中，對(duì)生防真菌木霉屬(Trichodermaspp.)的研究和應(yīng)用較多[13]。木霉屬真菌是一類普遍存在的土壤真菌，因其對(duì)植物病害的有效抑制作用,本身具有廣泛的生物利用度及高度的安全性而逐漸被研究者關(guān)注。木霉菌作為生防真菌，在對(duì)松枯梢病的生物防治方面已有報(bào)道。李寶年等[14]在對(duì)樟子松枯梢病進(jìn)行拮抗真菌篩選時(shí)，發(fā)現(xiàn)綠木霉(Trichodermaviride)對(duì)松枯梢病原菌的抑菌效果最好，病原菌被抑制率達(dá)70.9%。研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌在抑制病原的同時(shí)，也能促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)，從而促進(jìn)養(yǎng)分吸收[15]。尹大川等[16]發(fā)現(xiàn)，引進(jìn)綠色木霉菌株T43及其代謝產(chǎn)物對(duì)松枯梢病具有明顯抑制作用。Regliński et al.[17]發(fā)現(xiàn)，綠色木霉菌株灌根處理輻射松幼苗，能有效促進(jìn)其生長(zhǎng)，并增強(qiáng)寄主植物對(duì)松枯梢病原菌的系統(tǒng)抗性。本研究以松枯梢病原菌為目標(biāo)病原菌，通過對(duì)赤松林地土壤真菌的分離，篩選得到1株具有廣譜抑菌活性的森吉木霉菌株M75，為松枯梢病及其他重要林木病原菌的生物防治提供了新的生防菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在山東省煙臺(tái)市昆崳山自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，隨機(jī)采集距離赤松主干30 cm范圍內(nèi)的林地土壤，去除土壤表層雜物，采集深度約5～20 cm左右的土壤50 g，共36份，用于拮抗真菌的分離與篩選。分離得到的菌種由中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護(hù)研究所森林病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

試驗(yàn)用培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基(PDB)。

病原菌(Sphaeropsissapinea)由中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護(hù)研究所森林病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；金黃殼囊孢(Cytosporachrysosperma)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)、栗疫菌(Cryphonectriaparasitica)、鏈格孢(Alternriasp.)、圍小叢殼菌(Glomerellacingulata)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、犁頭霉(Absidiasp.)、枯斑擬盤多毛菌(Pestalotiopsisfunerea)均由中國林業(yè)微生物保藏中心(CFCC)提供。

1.2 研究方法

采用梯度稀釋平板涂布法[18]分離土壤微生物。將每份土壤樣品取10 g置于裝有90 mL滅菌水的250 mL三角瓶中制成土壤懸浮液母液，將母液置于28 ℃搖床中160 r·min-1震蕩1 h，靜置30 min，在無菌條件下對(duì)土壤母液進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋成體積分?jǐn)?shù)為10-2、10-3、10-4的3個(gè)梯度，然后依次吸取0.1 mL涂布在PDA平板上，每個(gè)梯度做3次重復(fù)。將上述平板放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。根據(jù)形態(tài)各異的菌落進(jìn)行純化，編號(hào)并保存?zhèn)溆谩?/p>

采用平板對(duì)峙法[19]進(jìn)行拮抗真菌初篩，選取活化5 d的病原菌和拮抗真菌，用打孔器選取5 mm菌餅，分別接種在PDA平板左右兩側(cè)，菌餅圓心相距約5 cm，距培養(yǎng)皿邊緣約2 cm，菌餅中心的連線經(jīng)過平板中心。以僅接松球殼孢菌為對(duì)照。每株拮抗真菌平行重復(fù)3次。接種后的PDA平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)5 d后，測(cè)量病原菌菌落指向拮抗菌的生長(zhǎng)半徑(從菌餅圓心處開始測(cè)量)。

被測(cè)真菌抑菌率：抑菌率=(病原菌對(duì)照菌落半徑-處理菌落半徑)/病原菌對(duì)照菌落半徑×100%。

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[20]進(jìn)行拮抗真菌復(fù)篩。將初步篩選出在平板上具有一定抑菌效果的生防真菌，制備成無菌發(fā)酵濾液，進(jìn)行拮抗真菌的發(fā)酵液復(fù)篩。將初篩選出的菌株在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)5 d，用打孔器取5 mm的菌餅，接入裝有100 mL PDB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r·min-1的搖床上振蕩培養(yǎng)96 h，得到生防菌的發(fā)酵液。收集30 mL發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r·min-1的條件下離心10 min，收集上清液并使用0.45 μm微孔濾膜對(duì)所獲上清液過濾除菌，將過濾后的上清液與加熱冷卻至45～50 ℃的PDA培養(yǎng)基以1∶10的比例混合均勻并傾倒平板，待平板冷卻凝固后，在平板中央接種直徑5 mm的松枯梢病菌菌餅。以加無菌水制備成的平板接種病原菌作為對(duì)照。所有處理進(jìn)行3次重復(fù)。28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)，5 d后采用十字交叉法測(cè)量病原菌菌落的直徑大小，計(jì)算抑菌率。

通過上述測(cè)定，獲得具有強(qiáng)抑菌效果的菌株M75，參照《真菌鑒定手冊(cè)》[21]對(duì)該菌進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)鑒定，并結(jié)合Tef1-a序列(EF1-688F(5’-CGG TCA CTT GAT CTA CAA GTG C-3’EF1-1251R(5’-CCT CGA ACT CAC CAG TAC CG-3’)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。DNA擴(kuò)增和測(cè)序體系參考Zhang et al.[22]的方法。PCR產(chǎn)物送至北京華大基因科技股份有限公司經(jīng)測(cè)序后，在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中BLAST比對(duì)分析后，通過MEGA7.0對(duì)選取同源性較高的相關(guān)菌株序列再次進(jìn)行比對(duì)分析，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)取樣1 000次進(jìn)行自展分析。

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定拮抗真菌M75發(fā)酵液對(duì)8種常見真菌：金黃殼囊孢、葡萄座腔菌、栗疫菌、鏈格孢、圍小叢殼菌、尖孢鐮刀菌、犁頭霉、枯斑擬盤多毛菌的抑菌活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010(Microsoft，USA)、SPSS 24.0(IBM，USA)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，并應(yīng)用Duncan法對(duì)不同處理組間的差異進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗真菌的初篩

將從土壤中分離得到的271株土壤真菌，與松枯梢病原菌進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，選取抑菌率前10的菌株，見表1。菌株M75在與松枯梢病原菌對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)，能有效競(jìng)爭(zhēng)平板內(nèi)的生長(zhǎng)空間，限制病原菌菌絲的生長(zhǎng)，使病原菌菌落無法向平板四周延伸(圖1B)。在培養(yǎng)5 d后，對(duì)照組的病原菌菌落正常生長(zhǎng)(圖1A)，菌落半徑為4.51 cm，而在接種菌株M75的平板上，病原菌菌落指向拮抗菌的菌落半徑僅為1.23 cm，拮抗真菌M75平板初篩抑菌率為72.65%。

表1 拮抗真菌初篩抑菌率

A為對(duì)照；B為處理(B中左側(cè)為M75菌株，右側(cè)為松枯梢病原菌)。

2.2 拮抗真菌的復(fù)篩

采用PDB培養(yǎng)基對(duì)菌株M75進(jìn)行發(fā)酵處理，獲得無菌發(fā)酵濾液。采用十字交叉法測(cè)量病原菌在添加了M75無菌發(fā)酵濾液后平板上的菌落直徑(表2、圖2)。病原菌在含有M75發(fā)酵濾液的培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)速度緩慢，菌落生長(zhǎng)受到明顯抑制。培養(yǎng)5 d后利用生長(zhǎng)速率法計(jì)算發(fā)酵液復(fù)篩抑菌率，其復(fù)篩抑菌率為78.78%。

2.3 拮抗真菌M75形態(tài)、培養(yǎng)特征

在PDA培養(yǎng)基上，M75菌株菌落呈圓形，菌落初呈白色，輪廓清晰，氣生菌絲濃密，初期為白色，絨毛絮狀，致密，后逐漸變?yōu)闇\黃色。28 ℃培養(yǎng)3 d菌落半徑為45～55 mm，5～7 d長(zhǎng)滿平板，生長(zhǎng)速率為6.7～7.5 mm·d-1。菌落不產(chǎn)生色素，但有椰子味氣體產(chǎn)生。菌株M75的形態(tài)學(xué)特征與Park et al.[23]發(fā)現(xiàn)的森吉木霉新種SFC20130926-S001及秦文韜等[24]發(fā)現(xiàn)的森吉木霉中國新紀(jì)錄種HMAS 248793基本一致。

表2 拮抗真菌發(fā)酵液復(fù)篩抑菌率

A為對(duì)照；B為處理。

圖3 M75在PDA上生長(zhǎng)14 d的菌落

2.4 拮抗真菌M75的Tef1-a序列分析

拮抗真菌M75的Tef1-a基因PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后，在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其與森吉木霉(Trichodermasongyi)TC556最為接近，相似度達(dá)98%。選取同源性較高的序列與M75構(gòu)建最大似然樹，如圖4所示，發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)發(fā)育樹上菌株M75與TrichodermasongyiTC556聚在1個(gè)分支上，支持率為96%，因此將菌株M75鑒定為森吉木霉CFCC54490。

括號(hào)內(nèi)容為菌株在Genbank中的登錄號(hào)；Bootstrap次數(shù)設(shè)置為1 000，最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；分支處的數(shù)字為Bootstrap支持率；標(biāo)尺為每個(gè)核苷酸位點(diǎn)上的替換值。

2.5 拮抗真菌M75發(fā)酵濾液抑菌譜測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定生防菌株M75對(duì)金黃殼囊孢等8種常見真菌的抑菌活性見表3、圖5。結(jié)果顯示，M75對(duì)金黃殼囊孢的抑菌率最高，達(dá)94.05%；對(duì)葡萄座腔菌、栗疫菌的抑菌效果較好，抑菌率分別為82.30%、77.87%；對(duì)鏈格孢的抑菌效果一般，抑菌率為52.56%；對(duì)尖孢鐮刀菌、圍小叢殼菌、犁頭霉、枯斑擬盤多毛菌也具有一定的抑菌性，但抑菌效果不高，抑菌率分別為36.35%、29.91%、28.72%、23.53%。

表3 菌株M75發(fā)酵液對(duì)8種常見真菌的抑制率

3 結(jié)論與討論

松枯梢病是由松球殼孢菌引起的一種世界性的針葉樹種病害，因其導(dǎo)致的枯梢、樹干潰瘍、流脂、根莖腐爛、木材藍(lán)變等問題，對(duì)松樹人工林造成了嚴(yán)重的危害和損失，因此亟需尋求一種有效的防控手段。近年來，隨著生物防治理念的興起，利用微生物菌種資源防控植物病害已成為病害防控發(fā)展的新趨勢(shì)。木霉屬真菌作為一類具有廣泛應(yīng)用前景的生防真菌，越來越受國內(nèi)外學(xué)者的重點(diǎn)關(guān)注。木霉菌能通過與寄主競(jìng)爭(zhēng)營養(yǎng)和空間、誘導(dǎo)植物抗性、產(chǎn)生抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物方面抑制植物病原菌的發(fā)生與發(fā)展，同時(shí)能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及對(duì)營養(yǎng)的利用[25]。

本研究從分離自赤松林地土壤的271株真菌中，篩選得到1株對(duì)松枯梢病原菌具有顯著拮抗作用的土壤真菌M75，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及Tef1-a分子序列分析將其鑒定為森吉木霉CFCC54490。該菌株對(duì)松枯梢病原菌具有較好的抑菌作用，其平板對(duì)峙抑菌率達(dá)到72.65%，發(fā)酵濾液原液的抑菌率則達(dá)到78.78%，原因是在液體培養(yǎng)狀態(tài)下，促進(jìn)了M75菌株產(chǎn)生更多的次級(jí)代謝產(chǎn)物，從而提高了抑菌效果。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株M75不只對(duì)松枯梢病原菌具有抑制作用，對(duì)其他多種重要的林木病原真菌均具有一定的抑菌效果。M75發(fā)酵液對(duì)引起楊樹腐爛病的病原菌金黃殼囊孢抑菌率高達(dá)94.05%；對(duì)引起林木潰瘍病的葡萄座腔菌抑菌率為82.30%；對(duì)引起板栗疫病的栗疫菌抑菌率為77.87%，抑菌譜較廣，具有較大的生防潛力，可作為1株優(yōu)質(zhì)的生防菌株開展后續(xù)研究。同時(shí)，這也是木霉屬除綠色木霉、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、棘孢木霉(Trichodermaasperellum)等常見的生防木霉以外[26]，首次發(fā)現(xiàn)森吉木霉也可應(yīng)用于生物防治領(lǐng)域，擴(kuò)充了生防木霉菌微生物資源庫，為森吉木霉菌株M75的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了參考。但微生物防治在實(shí)際應(yīng)用過程中，會(huì)受到外界因素的影響，因此還需進(jìn)一步探究不同培養(yǎng)條件下森吉木霉M75的抑菌效果，另外，對(duì)其抑菌機(jī)理還需進(jìn)一步深入探究。