家蠶熱休克蛋白HSP90相互作用蛋白的篩選與鑒定

龍艷碧，吳云飛，張倩，陳鵬,2，潘敏慧,2

家蠶熱休克蛋白HSP90相互作用蛋白的篩選與鑒定

龍艷碧1，吳云飛1，張倩1，陳鵬1,2，潘敏慧1,2*

1西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室，重慶 400716；2西南大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，重慶 400716

【目的】HSP90是熱休克蛋白家族的成員之一，在昆蟲的抗逆性和變態(tài)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，已有研究表明HSP90能夠促進家蠶核型多角體病毒（nucleopolyhedrovirus，BmNPV）的增殖，但作用機制尚不清楚。本研究通過鑒定BmHSP90的相互作用蛋白，為其促進BmNPV增殖的作用機制解析提供參考?！痉椒ā繕?gòu)建連接在pIZ/V5-His的BmHSP90HA真核過表達載體，在家蠶BmN-SWU1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染48 h后，感染BmNPV繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集蛋白，保留總蛋白后將這些蛋白均分兩管，進行免疫共沉淀，分別用抗HA抗體和IgG抗體釣取相互作用蛋白，對蛋白膠進行硝酸銀染色后，獲取差異條帶并做質(zhì)譜分析，將質(zhì)譜結(jié)果與信息分析結(jié)合進行候選互作蛋白篩選，并克隆鑒定互作蛋白。通過免疫熒光驗證HSP90與互作蛋白的共定位情況，并進一步采用免疫共沉淀試驗確定其是否存在相互作用關(guān)系。【結(jié)果】硝酸銀染色結(jié)果顯示，試驗組與對照組在90、70和60 kD附近處存在差異條帶，并驗證了90 kD處的差異條帶為誘餌蛋白；將另外兩條差異帶進行質(zhì)譜分析，共鑒定到7個候選相互作用蛋白，通過分析選擇其中兩個候選蛋白作后續(xù)研究，分別為Tubulin-specific chaperone E（Tbce）和Golgin subfamily A member 5（Golga5）。的最大開放閱讀框長度為1 728 bp，編碼576個氨基酸，的最大開放閱讀框長度為1 854 bp，編碼618個氨基酸；同源比對和系統(tǒng)進化樹顯示BmTbce的微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域（cytoskeleton-associated protein-glycine-rich，CAP-Gly）位于N端且在不同物種之間保守性較高，BmGolga5的跨膜區(qū)（transmembrane domain，TMD）位于C端，也較為保守；熒光共定位顯示BmHSP90與BmTbce和BmGolga5在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生共定位，并進一步通過免疫共沉淀證明BmHSP90HA和BmTbceFlag、BmHSP90HA和BmGolga5Flag具有相互作用關(guān)系?！窘Y(jié)論】經(jīng)過篩選與鑒定，在BmNPV感染家蠶細(xì)胞的過程中，與家蠶熱休克蛋白HSP90發(fā)生相互作用的蛋白為BmTbce和BmGolga5。

家蠶；家蠶核型多角體病毒；HSP90；Tbce；Golga5

0 引言

【研究意義】1962年，Ritossa在制備果蠅唾液腺細(xì)胞染色體的過程中發(fā)現(xiàn)溫度驟變后果蠅的染色體會出現(xiàn)膨脹現(xiàn)象，暗示局部轉(zhuǎn)錄活性增強，他將這個現(xiàn)象稱之為熱休克反應(yīng)[1]；1974年，Tissieres等通過蛋白凝膠電泳技術(shù)和放射自顯影技術(shù)證實了熱激處理后產(chǎn)生一組新的蛋白條帶，并命名為熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）[2-3]。熱休克蛋白的功能鑒定一直成為應(yīng)激研究的重點，根據(jù)功能可將熱休克蛋白分為7類，其中分子伴侶是主要類別[4]，因分子量不同又將其分為5個主要且廣泛保守的家族——HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小熱休克蛋白（sHSP）[5-6]。HSP90作為熱休克蛋白家族的一員，是一類極為豐富且高度保守的蛋白，被定義為細(xì)胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的中心調(diào)節(jié)劑，同時也是許多病毒蛋白合成不可或缺的成分[7-9]。有研究發(fā)現(xiàn)BmHSP90參與了家蠶核型多角體病毒（nucleopolyhedrovirus，BmNPV）侵染宿主的過程，但具體的作用機制仍然未知[10]。因此，鑒定BmHSP90相互作用蛋白對解析其在病毒與宿主間的作用機制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】同熱休克蛋白其他家族一樣，HSP90與病毒有著復(fù)雜的關(guān)系，HSP90通過促進病毒顆粒進入細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、表達和病毒蛋白的穩(wěn)定以及基因組復(fù)制，在復(fù)制周期的不同階段參與病毒的復(fù)制[11]。HSP90作用的病毒涉及DNA病毒和RNA病毒兩種[12]，猿猴病毒40（simian virus 40，SV40）是一種小型雙鏈環(huán)形DNA腫瘤病毒，可編碼3種腫瘤抗原：大T、小T和17 KT，大T抗原腫瘤抑制基因p53和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤（pRB）家族蛋白使宿主細(xì)胞從G1期過渡到S期，導(dǎo)致病毒發(fā)生增殖，HSP90能與未成熟形式的大T抗原締合，有助于大T抗原形成功能成熟的結(jié)構(gòu)，從而促進病毒DNA的復(fù)制[13]。同時，HSP90還通過氨基末端伴侶結(jié)構(gòu)域和包含高酸性結(jié)構(gòu)域的中間區(qū)域與RNA病毒——流感病毒RNA聚合酶的亞基之一PB2亞基相互作用，刺激RNA聚合酶活性促進其復(fù)制[14]。近來對嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）細(xì)胞進行的大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，HSP90是與感染相關(guān)的蛋白質(zhì)，HSP90的抑制減少了病毒復(fù)制和炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)[15]，因此，HSP90在未來將可能成為抗病毒研究的靶點。HSP90的細(xì)胞功能多種多樣，對其在昆蟲領(lǐng)域作用的了解仍然有限。據(jù)報道，在棉鈴蟲（）中，HSP90在受體上游參與了蛻皮激素信號途徑介導(dǎo)的個體發(fā)育[16]；HSP90突變體的果蠅繁殖力和壽命明顯低于野生型果蠅，即使在稍微升高的溫度下，HSP90突變體種群也會滅絕，而野生型種群卻持續(xù)存在，表明HSP90是應(yīng)激反應(yīng)和信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑，有助于緩沖來自野生種群果蠅的有害變異，并且在熱應(yīng)激條件下其緩沖作用變得更加重要[17]，說明HSP90在昆蟲發(fā)育過程中參與細(xì)胞通訊和信號傳遞過程[18]。但在家蠶中通過RNA干擾沉默BmN細(xì)胞中的抑制BmNPV復(fù)制，反之的過表達上調(diào)了其增殖復(fù)制的水平[19]。說明BmHSP90能夠在家蠶細(xì)胞中促進BmNPV的復(fù)制，但BmHSP90調(diào)控病毒增殖復(fù)制的具體機制仍不清楚?！颈狙芯壳腥朦c】以家蠶對外界刺激作出快速有效應(yīng)答的先天性免疫防御系統(tǒng)為切入點，以家蠶分子伴侶HSP90作為研究對象，在BmNPV入侵家蠶細(xì)胞后，鑒定與BmHSP90直接相互作用的蛋白，從而解析宿主BmHSP90使病毒復(fù)制增加的機理?！緮M解決的關(guān)鍵問題】篩選并鑒定BmHSP90相互作用的蛋白，加強對BmNPV致病機理的了解并為病毒防控提供新的靶點，為家蠶抗病品種培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2019—2020年在西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室完成。

1.1 供試材料與主要試劑

供試材料為本實驗室建立的家蠶卵巢細(xì)胞系BmN-SWU1[20]。Taq擴增酶、SolutionⅠ連接酶和限制性內(nèi)切酶（H I、I、I、II和I）購自TaKaRa公司；引物合成和測序均由北京六合華大基因科技股份有限公司完成；DNA凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司；Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞和蛋白Marker購自全式金公司；PVDF膜、昆蟲轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司；HA、Flag標(biāo)簽單克隆抗體、Alexa Fluor 488/555標(biāo)記山羊抗小鼠/兔IgG（H+L）、蛋白磁珠和ECL顯色液購自Invitrogen公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠/兔抗體IgG（H+L）、小鼠IgG和預(yù)染Marker購自碧云天生物技術(shù)有限公司；抗熒光淬滅封片劑、DAPI染料購自Life Technologies公司。其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 基因序列的生物信息學(xué)分析

、和的克隆引物在Premier 5.0軟件設(shè)計，利用SMART網(wǎng)站（http://smart.embl-heidelberg.de/）在線預(yù)測BmTbce和BmGolga5的結(jié)構(gòu)域，根據(jù)BmTbce和BmGolga5的序列在SilkDB 3.0（https://silkdb.bioinfotoolkits.net/）和NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載不同物種中的同源序列；然后使用ClustalX 1.83和GENEDOC 3.2做初步序列比對，再在https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi- bin/ESPript.cgi在線網(wǎng)站加工；系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建使用 MEGA 6.0 軟件，在https://itol.embl.de/進行美化。

1.3 真核過表達載體構(gòu)建

以pIZ/V5-His為空載，通過PCR、酶切和連接構(gòu)建帶有HA標(biāo)簽的BmHSP90和Flag標(biāo)簽的BmTbce與BmGolga5的質(zhì)粒。所有質(zhì)粒確保序列正確再進行后續(xù)試驗，所用引物見表1。

表1 本研究所用引物

加粗表示限制性內(nèi)切酶，下劃線標(biāo)記序列代表標(biāo)簽基因序列

Bold indicates restriction endonuclease, and underlined sequence represents tag gene sequence

1.4 免疫共沉淀（Co-IP）

首先提前準(zhǔn)備好細(xì)胞密度在80%—90%的BmN- SWU1細(xì)胞，將待轉(zhuǎn)質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑按1﹕2.5（m/v）的比例轉(zhuǎn)染至細(xì)胞瓶中，即在新的EP管中先加500 μL的無抗培養(yǎng)基，再加入3 μg質(zhì)粒，最后加7.5 μL的轉(zhuǎn)染試劑，用100 μL的移液槍逐滴加入吹打混合液100下，靜置30 min，預(yù)先在培養(yǎng)瓶中先加入2 mL的無抗培養(yǎng)基，再邊搖晃培養(yǎng)瓶逐滴加入混合質(zhì)粒；27℃培養(yǎng)48 h使細(xì)胞增殖，添加BmNPV感染48 h后，收集蛋白，先用1×PBST潤洗培養(yǎng)瓶的細(xì)胞兩次，加入500 μL含PMSF（1 mmol·L-1）的IP裂解液；將細(xì)胞瓶平放在冰盒上，放置搖床裂解30 min，吹下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL的EP管中；離心10 min棄細(xì)胞碎片（4℃，12 000×）；在兩個新的1.5 mL EP管中加入protein A+G磁珠共50 μL，將離心管插入免疫磁條上，加入PBST清洗磁珠兩次；然后再加入400 μL干凈的PBST輕輕混勻后分別加入4 μL小鼠IgG抗體和標(biāo)簽抗體，旋轉(zhuǎn)混勻20 min使磁珠與抗體結(jié)合；清洗磁珠后將得到的上清蛋白分別等量加入兩個EP管中，混勻后旋轉(zhuǎn)孵育；1.5 h后用槍頭吸走液體，用PBS洗兩次后加入80 μL IP裂解液和20 μL的5×上樣緩沖液，沸水煮15 min后，將離心管放至磁力架中吸走蛋白溶液轉(zhuǎn)移到新管中，置于-20℃保存。

1.5 硝酸銀染色

根據(jù)配方制備12%的SDS-PAGE膠，將免疫共沉淀得到的樣品和蛋白Marker點入孔中，用恒流進行分離，在濃縮膠的區(qū)域每塊膠所用的電流為8 mA，待樣品跑到分離膠區(qū)域時將每塊膠的電流調(diào)整為16 mA，待藍色染料剛好要跑出即可，將凝膠取出，放入干凈的玻璃皿中，用雙蒸水清洗膠塊，重復(fù)兩次，倒掉液體，倒入固定液固定，放于水平搖床上輕輕搖晃1 h；繼續(xù)在搖床上用洗滌液進行清洗，每20 min換一次清洗液，清洗6次；加入適量增感液，增感90 s，時間要精確，注意避光；迅速倒掉增感液，加入雙蒸水，立即放回水平搖床清洗20 s，時間嚴(yán)格控制，重復(fù)3次；加入硝酸銀染色液，染色30 min，用錫箔紙將玻璃皿包著，嚴(yán)格避光；重復(fù)清洗的步驟，慢慢倒入顯影液，以白紙為背景，仔細(xì)觀察膠塊的顏色，當(dāng)條帶亮度顯影合適的時候立即加入終止液，終止顯影；在掃描儀上掃描并保存圖片，仔細(xì)觀察并找出差異帶，用干凈的小刀切取差異條帶，做好標(biāo)記至-80℃保存，最后送至華大基因公司做質(zhì)譜分析。

1.6 免疫熒光

先在24孔板鋪上細(xì)胞爬片，將可以傳代的細(xì)胞吹下，每個孔加入400 μL的細(xì)胞，待細(xì)胞全部貼壁后換液，6—9 h后待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，再按上述轉(zhuǎn)染方法將待共轉(zhuǎn)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入孔中，27℃培養(yǎng)，48 h后開始做免疫熒光；吸盡孔里的培養(yǎng)基，加入PBST涮洗2次；加入350 μL 4%多聚甲醛固定15 min使細(xì)胞保持原有的狀態(tài)；然后處理固定液，加入PBST后放至搖床上洗滌5 min，共3次；吸干洗滌的PBST后于每個孔中加入350 μL的0.1% TritonX-100打孔，室溫下放置15 min；重復(fù)洗滌步驟；徹底吸干洗滌液，再向每個孔中加入500 μL的一抗稀釋液（1﹕200），避光放置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h；回收一抗，加入PBST洗滌5 min，重復(fù)5次；向每個孔中加入500 μL的二抗和DAPI混合的稀釋液（1﹕500），放置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)40—50 min，注意要嚴(yán)格避光；在避光條件下繼續(xù)重復(fù)洗滌，在干凈的載玻片中間滴加2 μL的抗熒光猝滅劑，輕輕勾起爬片，細(xì)胞面朝下，鋪在載玻片上，指甲油密封，隨后用激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

1.7 Western blot

將免疫共沉淀釣取的樣品進行SDS-PAGE電泳，將蛋白膠的上層濃縮膠切掉，下層膠待用，然后準(zhǔn)備一張4×8格大小的聚偏二氟乙烯印跡膜（PVDF）和兩個干凈的玻璃皿，一個倒入甲醇，另一個加入雙蒸水，做好標(biāo)記，先把PVDF膜放進裝有甲醇的玻璃皿中激活20 s，迅速挑起膜放進雙蒸水中浸泡2 min；把濾紙、PVDF、蛋白膠和上層濾紙全部放到轉(zhuǎn)膜液中，開始轉(zhuǎn)膜，由下到上的順序?qū)⑥D(zhuǎn)膜液中的上述4種物品輕輕疊放，每一層之間都不能有氣泡；輕輕平放到轉(zhuǎn)移槽中，轉(zhuǎn)膜9 min；完成后用鑷子挑起PVDF膜放入膜盒中。加入現(xiàn)配的封閉液，放入上下?lián)u床搖1 h或4℃封閉過夜；之后加入一抗溶液（1﹕2 000稀釋），室溫下水平搖床孵育2 h，用TBST洗5 min，重復(fù)6次；加入二抗（1﹕4 000稀釋），繼續(xù)孵育50 min，重復(fù)洗滌，在光源較弱的環(huán)境配制顯色液，混勻后在成像儀中放置一個干凈的手套，按照膠塊的大小滴加顯色液，從一側(cè)放入PVDF膜，再在上面滴加顯色液；曝光，保存圖片。

2 結(jié)果

2.1 免疫共沉淀釣取BmHSP90的相互作用候選蛋白

將轉(zhuǎn)染了pIZ-BmHSP90HA質(zhì)粒的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后感染BmNPV，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集蛋白，以HA抗體為誘餌、小鼠IgG為對照，免疫共沉淀結(jié)合銀染試驗找出差異條帶。結(jié)果顯示，與IgG組相比，IP組在大小為90、70和60 kD附近處各有一條差異條帶，如圖中箭頭所示a、b和c（圖1-A）。為了檢測誘餌蛋白是否表達，將3條差異膠切下來，分開裝入干凈的1.5 mL EP管中，加入PBS研磨至膠塊完全消失，電泳后進行免疫印跡，HA抗體作一抗孵育。結(jié)果顯示在90 kD處觀察到條帶（圖1-B），說明此處的差異帶為誘餌蛋白BmHSP90。進行3次生物學(xué)重復(fù)后確定差異帶，將其切下進行LC-MS/ MS質(zhì)譜分析。

使用NCBI數(shù)據(jù)庫以及家蠶數(shù)據(jù)庫比對質(zhì)譜分析得到的肽段，共找到7個潛在的相互作用蛋白（表2），通過分析在兩個差異帶中各選取了一個候選蛋白作為后續(xù)的研究對象，分別為BmTbce（XP_004923154）和BmGolga5（XP_012550337）。

Input組表示總蛋白樣品，IgG組表示對照組樣品，IP組表示試驗組樣品，a、b、c表示試驗組與對照組相比得出的差異帶

2.2 BmTbce和BmGolga5的克隆鑒定

以家蠶cDNA為模板，用表1的引物克隆得到Gene ID為BGIBMGA000149的，的CDS全長1 728 bp，編碼576個氨基酸，預(yù)測的蛋白分子量63.36 kD，等電點為6.27，對其結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，分析發(fā)現(xiàn)BmTbce在59—125氨基酸處含有微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CAP-Gly）。為了進一步探究BmTbce的CAP-Gly結(jié)構(gòu)域在生物進化過程中的保守性及位置，選取人（）、黑腹果蠅（）、斑馬魚（）和非洲爪蟾（）的CAP-Gly結(jié)構(gòu)域處與BmTbce的同源氨基酸進行比對發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)域非常保守（圖2）；此外，通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)Tbce在脊椎動物和無脊椎動物的不同物種中有且僅有一個CAP-Gly結(jié)構(gòu)域并且位于N端（圖3）；Gene ID為BGIBMGA010211的的CDS全長為1 854 bp，編碼618個氨基酸，預(yù)測的蛋白分子量為67.98 kD，等電點為6.59，在581—603氨基酸處含有跨膜區(qū)（TMD），與其他物種的同源氨基酸進行比對發(fā)現(xiàn)其跨膜區(qū)比較保守（圖4），系統(tǒng)進化樹顯示不同物種Golga5的跨膜區(qū)均位于C端（圖5）。以上結(jié)果顯示，Tbce和Golga5分別在不同物種中具有保守且專一的CAP-Gly結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)。

表2 BmHSP90免疫共沉淀候選蛋白

藍色框區(qū)的氨基酸殘基表示在所有比對物種中，有≥70%是一致的The amino acid residues in the blue box indicate that ≥70% of all the compared species are identical。斜紋夜蛾Spodoptera litura (XP_022828735.1)；棉鈴蟲Helicoverpa armigera (XP_021199983.1)；帝王蝶Danaus plexippus (OWR53855.1)；金鳳蝶Papilio machaon (KPJ17724.1)；家蠶Bombyx mori (XP_004923154.1)；黑腹果蠅Drosophila melanogaster (NP_610197.2)；人Homo sapiens (NP_001072983.1 )；非洲爪蟾Xenopus laevis (NP_001088530.1)；斑馬魚Danio rerio (NP_001035078.2)；蕪菁葉蜂Athalia rosae (XP_012251255.1)

棕色三角形區(qū)表示所有比對物種中CAP-Gly結(jié)構(gòu)域所在位置

2.3 BmHSP90與其潛在相互作用蛋白BmTbce和BmGolga5的亞細(xì)胞定位分析

為了分析BmHSP90與BmTbce和BmGolga5的定位情況，共轉(zhuǎn)BmHSP90HA和BmTbceFlag、BmHSP90HA和BmGolga5Flag進細(xì)胞中進行共定位觀察，如圖6所示，免疫熒光使用DAPI染料標(biāo)記細(xì)胞核并顯示為藍光，HA標(biāo)簽的熒光抗體選擇綠光，F(xiàn)lag標(biāo)簽選擇為紅光，共定位顯示BmHSP90與BmTbce和BmGolga5共定位于細(xì)胞質(zhì)中，且BmGolga5部分呈點狀分布。因此，推測BmHSP90與BmTbce和BmGolga5可能具有相互作用。

2.4 BmHSP90與其潛在相互作用蛋白BmTbce和BmGolga5的相互作用分析

為了進一步確定BmHSP90與BmTbce和BmGolga5是否存在相互作用，再次進行了上述轉(zhuǎn)染試驗，收集蛋白后進行正向驗證，通過免疫共沉淀步驟分別用Flag抗體和小鼠IgG抗體沉淀BmTbceFlag和BmGolga5Flag，再用HA抗體通過Western blot檢測BmHSP90HA，觀察BmHSP90是否能被BmTbce和BmGolga5沉淀下來；同理進行反向驗證時，IP組使用HA抗體和小鼠IgG抗體釣取蛋白，IB組再用Flag抗體雜交，檢測BmHSP90是否可以釣取BmTbce和BmGolga5。正向和反向的驗證結(jié)果顯示，對應(yīng)的目的蛋白都能被檢測到（圖7）。表明BmHSP90均與BmTbce和BmGolga5具有相互作用關(guān)系。

3 討論

3.1 HSP90與Golga5和Tbce的協(xié)同作用對病毒蛋白侵染宿主的影響

Golga5（Golgin-84）在其N端497個殘基包含一個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，在其C末端附近有一個跨膜結(jié)構(gòu)域，定位在高爾基體上，是一種完整的膜蛋白[21]。在真核細(xì)胞中觀察到Golga5在高爾基體堆疊側(cè)緣的管網(wǎng)結(jié)構(gòu)中含量豐富，Golga5在哺乳動物細(xì)胞高爾基體膜的組裝和維持中起著關(guān)鍵作用，在大鼠腎（NRK）細(xì)胞中的瞬時表達有助于防止由蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑引發(fā)的高爾基體分解[22-23]。外殼蛋白復(fù)合物I（COPI）是一種異聚蛋白外殼，可介導(dǎo)高爾基體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)的出芽[24]，Golga5與保守的寡聚高爾基體（COG）復(fù)合物的相互作用可能參與了高爾基體內(nèi)COPI囊泡的逆行[25]。在登革熱病毒（dengue virus）侵染宿主細(xì)胞過程中，作為一種糖基化包膜蛋白，其需要在宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工，敲低后，病毒蛋白的逆行運輸會受到損害，從而影響登革熱病毒蛋白折疊，導(dǎo)致病毒蛋白降解增加，阻礙了病毒粒子的產(chǎn)生[26-28]；在HeLa細(xì)胞中HSP90敲低會導(dǎo)致高爾基體破碎，水皰性口炎病毒（VSVG）的順行囊泡運輸受損[29]，由此可見HSP90對維持高爾基體的結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)BmHSP90與BmGolga5發(fā)生相互作用，暗示Golga5對BmNPV蛋白在家蠶宿主細(xì)胞內(nèi)的正確加工修飾和轉(zhuǎn)運具有重要意義。

藍色框區(qū)的氨基酸殘基表示在所有比對物種中，有≥75%是一致的The amino acid residues in the blue box indicate that ≥75% of all the compared species are identical。家蠶Bombyx mori (XP_021207081.1)；帝王蝶Danaus plexippus (XP_032522464.1)；斜紋夜蛾Spodoptera litura (XP_022815171.1)；玉帶鳳蝶Papilio polytes (XP_013139496.1)；黑腹果蠅Drosophila melanogaster (NP_651250.2)；埃及伊蚊Aedes aegypti (XP_021706120.1)；人 Homo sapiens (AAD09753.1)；非洲爪蟾Xenopus laevis (NP_001085841.1)；斑馬魚Danio rerio (NP_998576.1)；蕪菁葉蜂Athalia rosae (XP_012252705.1)

紫色直線表示所有比對物種中蛋白所含跨膜區(qū)位置

圖6 熒光共定位分析 BmHSP90與BmTbce和BmGolga5的定位情況

圖7 免疫共沉淀和Western blot驗證BmHSP90與BmTbce和BmGolga5的相互作用

微管是細(xì)胞的主要組成部分之一，其在細(xì)胞分裂、細(xì)胞生長和運動、細(xì)胞內(nèi)運輸和維持細(xì)胞形狀中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[30]。微管蛋白分子伴侶E（Tbce）最初是從牛睪丸組織純化出的一種大小為60 kD的蛋白，該蛋白通過調(diào)節(jié)微管蛋白異質(zhì)二聚體的聚合而參與微管蛋白的正確折疊及折疊速率[31]。在果蠅神經(jīng)肌肉中，過表達會導(dǎo)致大量的微管形成，而敲除后會導(dǎo)致微管的功能發(fā)生紊亂，進而影響了神經(jīng)肌肉突觸的功能[32]；在果蠅中發(fā)現(xiàn)Tbce具有特殊的CAP-Gly基序，其負(fù)責(zé)在有絲分裂前期募集染色質(zhì)周圍的微管蛋白，對于紡錘體的正確組裝至關(guān)重要[33]。微管因結(jié)構(gòu)復(fù)雜而在無數(shù)的細(xì)胞功能中起到至關(guān)重要的作用，許多病毒已經(jīng)進化出利用這些結(jié)構(gòu)來幫助其復(fù)制的機制。已報道小鼠諾如病毒（mouse norovirus）在感染活細(xì)胞過程中利用微管將復(fù)制復(fù)合物從細(xì)胞外圍向復(fù)制位點即鄰近微管組織中心附近運輸，微管網(wǎng)絡(luò)的化學(xué)破壞使諾如病毒復(fù)制的位點分散在整個細(xì)胞中，并損害了病毒蛋白的產(chǎn)生[34]。感染性病毒感染通常受到細(xì)胞骨架的操控，如皰疹病毒（herpesvirus）和人類乳頭瘤病毒（human papillomavirus）利用基于微管的逆行運輸將其基因組傳遞到細(xì)胞核，隨后在生命周期的裂解階段，成熟的病毒顆粒易位到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的特定區(qū)域，導(dǎo)致二次感染[35-36]；并且熱休克反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞多極微管的形成，從而進行多極分裂，HSP90能夠促進子代BV產(chǎn)生所需的核肌動蛋白聚合從而參與桿狀病毒BV繁殖[37-38]。

3.2 家蠶HSP90與Golga5和Tbce協(xié)同作用的意義

本研究通過銀染試驗篩選了HSP90在家蠶細(xì)胞受到BmNPV感染時發(fā)生相互作用的蛋白，并采用免疫熒光和免疫共沉淀技術(shù)驗證了BmHSP90與BmTbce和BmGolga5具有相互作用關(guān)系，暗示著病毒與家蠶細(xì)胞相互作用的多樣性與復(fù)雜性。因此，筆者推測在BmNPV侵染家蠶細(xì)胞時，BmHSP90募集分子伴侶BmTbce和BmGolga5，BmGolga5是高爾基體完整性必不可少的一部分，對COPI囊泡介導(dǎo)高爾基體向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)方向的逆向運輸具有重要意義，病毒第一次入侵時，病毒蛋白可能通過大量快速的逆向運輸過程逃避宿主介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)清除，從而成功感染宿主；而參與折疊微管蛋白的BmTbce有助于逃逸的病毒蛋白借助微管軌道被運輸入核與病毒核酸進行組裝，從而導(dǎo)致二次感染，促進病毒的增殖。但這些推測還需要進一步的研究驗證。

4 結(jié)論

生物信息學(xué)分析顯示Golga5在不同物種中均含有一個C端的跨膜結(jié)構(gòu)域，BmTbce蛋白在N端含有CAP-Gly基序，進一步通過免疫熒光及免疫共沉淀驗證了BmGolga5和BmTbce分別與BmHSP90共定位于細(xì)胞質(zhì)并發(fā)生相互作用。

[1] Ritossa F.A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in.Experientia, 1962, 18: 571-573.

[2] Tissiéres A, Mitchell H K, Tracy U M.Protein synthesis in salivary glands of: Relation to chromosome puffs.Journal of Molecular Biology, 1974, 84(3): 389-398.

[3] Landais I, Pommet J M, Mita K, Nohata J, GimenezS, Fournier P, Devauchelle G, Duonor-Cerutti M, Ogliastro M.Characterization of the cDNA encoding the 90 kDa heat-shock protein in the Lepidopteraand.Gene, 2001, 271(2): 223-231.

[4] Richter K, Haslbeck M, Buchner J.The heat shock response:life on the verge of death.Molecular Cell, 2010, 40(2): 253-266.

[5] Mogk A, Bukau B.Role of sHsps in organizing cytosolic protein aggregation and disaggregation.Cell Stress and Chaperones, 2017, 22(4): 493-502.

[6] Bar-Lavan Y, Shemesh N, Ben-Zvi A.Chaperone families and interactions in metazoa.Essays in Biochemistry, 2016, 60(2): 237-253.

[7] Dalidowska I, Gazi O, Sulejczak D, Przybylski M, Bieganowski P.Heat shock protein 90 chaperones E1A early protein of adenovirus 5 and is essential for replication of the virus.International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(4): 2020.

[8] Zhang Y, Zhang Y A, Tu J.Hsp90 is required for snakehead vesiculovirus replication via stabilization the viral L protein.Journal of Virology, 2021, 95(16): e00594-21.

[9] Jing L, Buchner J.Structure, function and regulation of the Hsp90 machinery.Biomedical Journal, 2013, 36(3): 106-117.

[10] Wu P, Shang Q, Huang H, Zhang S, Zhong J, Hou Q, Guo X.Quantitative proteomics analysis provides insight into the biological role of Hsp90 in BmNPV infection in.Journal of Proteomics, 2019, 203: 103379.

[11] Tsou Y L, Lin Y W, Chang H W, Lin H Y, Shao H Y, Yu S L, Liu C C, Chitra E, Sia C, Chow Y H.Heat shock protein 90: role in enterovirus 71 entry and assembly and potential target for therapy.PLoS ONE, 2013, 8(10): e77133.

[12] Iyer K, Chand K, Mitra A, Trivedi J, Mitra D.Diversity in heat shock protein families: functional implications in virus infection with a comprehensive insight of their role in the HIV-1 life cycle.Cell Stress and Chaperones, 2021, 26(5): 743-768.

[13] Miyata Y, Yahara I.p53-independent association between SV40 large T antigen and the major cytosolic heat shock protein, HSP90.Oncogene, 2000, 19(11): 1477-1484.

[14] Momose F, Naito T, Yano K, Sugimoto S, Morikawa Y, Nagata K.Identification of Hsp90 as a stimulatory host factor involved in influenza virus RNA synthesis.The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(47): 45306-45314.

[15] Wyler E, Mosbauer K, Franke V, Diag A, Gottula L T, Arsie R, Klironomos F, Koppstein D, Honzke K, Ayoub S,.Transcriptomic profiling of SARS-CoV-2 infected human cell lines identifies HSP90 as target for COVID-19 therapy.iScience, 2021, 24(3): 102151.

[16] 張鳳霞.棉鈴蟲Hsp90、胸腺素和絲氨酸蛋白酶抑制因子在發(fā)育中的表達模式與激素調(diào)控[D].濟南: 山東大學(xué), 2010.

Zhang F X.Expression patterns and hormonal regulation of Hsp90, thymosin and serine protease inhibitors in the development of[D].Ji’nan: Shandong University, 2010.(in Chinese)

[17] Chen B, Wagner A.Hsp90 is important for fecundity, longevity, and buffering of cryptic deleterious variation in wild fly populations.BMC Evolutionary Biology, 2012, 12: 25.

[18] McClellan A J, Xia Y, Deutschbauer A M, Davis R W, Gerstein M, Frydman J.Diverse cellular functions of the Hsp90 molecular chaperone uncovered using systems approaches.Cell, 2007, 131(1): 121-135.

[19] Shang Q, Wu P, Huang H L, Zhang S L, Tang X D, Guo X J.Inhibition of heat shock protein 90 suppressesnucleopolyhedrovirus replication in.Insect Molecular Biology, 2020, 29(2): 205-213.

[20] Pan M H, Cai X J, Liu M, Lv J, Tang H, Tan J, Lu C.Establishment and characterization of an ovarian cell line of the silkworm,.Tissue and Cell, 2010, 42(1): 42-46.

[21] Bascom R A, Srinivasan S, Nussbaum R L.Identification and characterization of golgin-84, a novel Golgi integral membrane protein with a cytoplasmic coiled-coil domain.The Journal of Biological Chemistry, 1999, 274(5): 2953-2962.

[22] Satoh A, Wang Y, Malsam J, Beard M B, WARREN G.Golgin-84 is a rab1 binding partner involved in Golgi structure.Traffic, 2003, 4(3): 153-161.

[23] Diao A, Rahman D, Pappin D J, Lucocq J, Lowe M.The coiled-coil membrane protein golgin-84 is a novel rab effector required for Golgi ribbon formation.The Journal of Cell Biology, 2003, 160(2): 201-212.

[24] Pinot M, Goud B, Manneville J B.Physical aspects of COPI vesicle formation.Molecular Membrane Biology, 2010, 27(8): 428-442.

[25] Sohda M, Misumi Y, Yamamoto A, Nakamura N, Ogata S, Sakisaka S, Hirose S, Ikehara Y, Oda K.Interaction of Golgin-84 with the COG complex mediates the intra-Golgi retrograde transport.Traffic, 2010, 11(12): 1552-1566.

[26] Tongmuang N, Yasamut U, Songprakhon P, Dechtawewat T, Malakar S, Noisakran S, Yenchitsomanus P T, Limjindaporn T.Coat protein complex I facilitates dengue virus production.Virus Research, 2018, 250: 13-20.

[27] Limjindaporn T, Wongwiwat W, Noisakran S, Srisawat C, Netsawang J, Puttikhunt C, Kasinrerk W, Avirutnan P, Thiemmeca S, Sriburi R, Sittisombut N, Malasit P, Yenchitsomanus P T.Interaction of dengue virus envelope protein with endoplasmic reticulum-resident chaperones facilitates dengue virus production.Biochemical and Biophysical Research Communications, 2009, 379(2): 196-200.

[28] Howe C, Garstka M, Al-Balushi M, Ghanem E, Antoniou A N, Fritzsche S, Jankevicius G, Kontouli N, Schneeweiss C, Williams A, Elliott T, Springer S.Calreticulin-dependent recycling in the early secretory pathway mediates optimal peptide loading of MHC class I molecules.The EMBO Journal, 2009, 28(23): 3730-3744.

[29] Wu Y, Ding Y, Zheng X, Liao K.The molecular chaperone Hsp90 maintains Golgi organization and vesicular trafficking by regulating microtubule stability.Journal of Molecular Cell Biology, 2020, 12(6): 448-461.

[30] 高囡囡, 鮑嵐.微管蛋白的翻譯后修飾及功能研究.生命科學(xué), 2015, 27(3): 363-373.

Gao N N, Bao L.Post-translational modification and function of tubulin.Chinese Bulletin of Life Sciences, 2015, 27(3): 363-373.(in Chinese)

[31] Tian G, HUANG Y, Rommelaere H, Vandekerckhove J, Ampe C, Cowan N J.Pathway leading to correctly folded-tubulin.Cell, 1996, 86(2): 287-296.

[32] Jin S, Pan L, Liu Z, Wang Q, Xu Z, Zhang Y Q.tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation.Development, 2009, 136(9): 1571-1581.

[33] Metivier M, Gallaud E, Thomas A, Pascal A, Gagne J P, Poirier G G, Chretien D, Gibeaux R, Richard-Parpaillon L, Benaud C, Giet R.tubulin-specific chaperone E recruits tubulin around chromatin to promote mitotic spindle assembly.Current Biology, 2021, 31(4): 684-695.

[34] Hyde J L, Gillespie L K, Mackenzie J M.Mouse norovirus 1 utilizes the cytoskeleton network to establish localization of the replication complex proximal to the microtubule organizing center.Journal of Virology, 2012, 86(8): 4110-4122.

[35] DiGiuseppe S, Luszczek W, Keiffer T R, Bienkowska- Haba M, Guion L G, Sapp M J.Incoming human papillomavirus type 16 genome resides in a vesicular compartment throughout mitosis.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113(22): 6289-6294.

[36] Loftus M S, Verville N, Kedes D H.A conserved leucine zipper motif in gammaherpesvirus ORF52 is critical for distinct microtubule rearrangements.Journal of Virology, 2017, 91(17): e00304-17.

[37] Chen S, Liu M, Huang H, Li B, Zhao H, Feng X Q, Zhao H P.Heat stress-induced multiple multipolar divisions of human cancer cells.Cells, 2019, 8(8): 888.

[38] Li S, Wang Y, Hou D, Guan Z, Shen S, Peng K, Deng F, Chen X, Hu Z, Wang H, Wang M.Host factor heat-shock protein 90 contributes to baculovirus budded virus morphogenesis via facilitating nuclear actin polymerization.Virology, 2019, 535: 200-209.

Screening and identification of HSP90 interacting proteins insilkworm ()

LONG YanBi1, WU YunFei1, ZHANG Qian1, CHEN Peng1,2, PAN MinHui1,2*

1State Key Laboratory of Silkworm Genomic Biology, Southwest University, Chongqing 400716;2Key Laboratory of Sericulture Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Southwest University, Chongqing 400716

【Objective】HSP90 is a member of the heat shock protein family and plays an important role in insect resistance and metamorphosis.Studies have shown that HSP90 can promote the proliferation ofnucleopolyhedrovirus (BmNPV), but the mechanism of action is unclear.The objective of this study is to identify the interacting proteins of BmHSP90, and to provide a reference for the analysis of its mechanism of promoting BmNPV proliferation.【Method】The BmHSP90HAeukaryotic overexpression vector linked to pIZ/V5-His was constructed.After transfection in BmN-SWU1 cells for 48 h, BmNPV was infected and cultured for 48 h to collect the proteins.After the total protein was retained, the proteins were divided into two tubes and co-immunoprecipitation was performed.the interacting protein was caught with anti-HA antibody and IgG antibody, respectively, after staining the protein gel with silver nitrate, the different bands were obtained and mass spectrometry analysis was performed.the mass spectrometry results were combined with the information analysis to screen candidate interacting proteins, and then the interacting proteins were cloned and identified.The co-localization of HSP90 and the interacting protein was verified by immunofluorescence, and the co-immunoprecipitation experiment was further used to determine whether they had an interaction relationship.【Result】The results of silver nitrate staining showed that the experimental group and the control group had different bands near 90, 70 and 60 kD, and verified that the different bands at 90 kD were bait proteins.the other two different bands were analyzed by mass spectrometry, and a total of 7 candidate interacting proteins were identified.Two of the candidate proteins were selected for follow-up study through analysis, namely Tubulin-specific chaperone E (Tbce) and Golgin subfamily A member 5 (Golga5).The maximum open reading frame length of theis 1 728 bp, which encodes 576 amino acids, and the maximum open reading frame length of theis 1 854 bp, which encodes 618 amino acids.The homology alignment and phylogenetic tree showed that the microtubule binding domain of BmTbce (cytoskeleton-associated protein-glycine-rich, CAP-Gly) was located at the N-terminus and was highly conserved among different species.The transmembrane domain (TMD) of BmGolga5 was located at the C-terminus and was also conservative.The fluorescence co-localization showed that BmHSP90 co-localized with BmTbce and BmGolga5 in the cytoplasm, and it was further proved by co-immunoprecipitation that BmHSP90HAand BmTbceFlag, BmHSP90HAand BmGolga5Flaghad an interaction relationship.【Conclusion】After screening and identification, in the process of BmNPV infection ofcells, the proteins that interact with theheat shock protein HSP90 are BmTbce and BmGolga5.

; BmNPV; HSP90; Tbce; Golga5

2021-09-10；

2021-10-20

國家自然科學(xué)基金（31872427）、重慶市自然科學(xué)基金（cstc2020jscx-msxmX0045）、國家蠶桑產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-18）

龍艷碧，E-mail：1420183012@qq.com。通信作者潘敏慧，E-mail：pmh047@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）