小麥苗期鉛耐受性的全基因組關(guān)聯(lián)分析

職蕾，者理，孫楠楠，楊陽，Dauren Serikbay,2，賈漢忠，胡銀崗，陳亮

小麥苗期鉛耐受性的全基因組關(guān)聯(lián)分析

職蕾1，者理1，孫楠楠1，楊陽1，Dauren Serikbay1,2，賈漢忠3，胡銀崗1，陳亮1*

1西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，中國陜西楊凌 712100；2賽富林農(nóng)業(yè)技術(shù)大學(xué)，哈薩克斯坦努爾蘇丹 010011；3西北農(nóng)林科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，中國陜西楊凌 712100

【目的】隨著工業(yè)化的推進(jìn)，重金屬尤其是鉛對耕地的污染已成為世界性問題。小麥作為主要糧食作物，其健康生產(chǎn)對保障糧食安全意義重大，篩選鉛耐受性強(qiáng)和鉛低積累小麥品種、挖掘相關(guān)調(diào)控基因或QTL區(qū)間，為耐鉛種質(zhì)創(chuàng)新和揭示小麥鉛耐受性遺傳機(jī)制奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎?40 mg·kg-1的硝酸鉛溶液對102份小麥品種（系）進(jìn)行苗期脅迫試驗，以3個重復(fù)下的最大根長、根生物量和生長速率的耐鉛系數(shù)的加權(quán)隸屬函數(shù)值（值）來評價小麥對鉛的耐受性。結(jié)合小麥660K SNP芯片的335 438個高質(zhì)量SNP標(biāo)記對小麥鉛耐受性進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS），挖掘鉛耐受性候選基因。【結(jié)果】小麥品種（系）之間的鉛耐受性表現(xiàn)出豐富的變異，變異系數(shù)為44.8%—46.2%，相關(guān)系數(shù)介于0.87—0.97（＜0.001）；鉛耐受性強(qiáng)的品種呈現(xiàn)出鉛低積累特性?；蚍中徒Y(jié)果顯示SNP多態(tài)性信息含量（polymorphic information content，）為0.28—0.32，群體結(jié)構(gòu)分析將供試材料分為7個亞群；2種GWAS分析方法共檢測到20個與小麥鉛耐受性顯著關(guān)聯(lián)的SNP（≤0.001）和8個候選區(qū)間，分別分布在1B、2A、2D、3A、3B、5A和7A染色體上，單個位點(diǎn)可解釋15.33%—19.75%的表型變異，其中10個位點(diǎn)和8個候選區(qū)間在2個及以上環(huán)境被檢測到。分析穩(wěn)定檢測的顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)及區(qū)間的候選基因，發(fā)現(xiàn)其功能主要與跨膜運(yùn)輸、蛋白修飾以及氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，包括7個與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因（、、等）、2個與泛素化與去泛素化相關(guān)的候選基因（和）、3個跨膜蛋白基因（、和）和1個過氧化物酶相關(guān)的候選基因（）?！窘Y(jié)論】篩選出鉛耐受性強(qiáng)的種質(zhì)材料7份，檢測到與小麥鉛耐受性顯著關(guān)聯(lián)的20個SNP位點(diǎn)及8個候選區(qū)間，篩選出13個與小麥鉛耐受性相關(guān)的候選基因。

小麥；鉛耐受性；全基因組關(guān)聯(lián)分析；候選基因分析

0 引言

【研究意義】在礦石開采和能源利用過程中，重金屬會隨著以礦渣、粉塵、廢水等污染介質(zhì)進(jìn)入環(huán)境，并在大氣、水體、土壤和植物中遷移，造成嚴(yán)重的面源污染及重金屬污染[1]。每年由于重金屬污染造成的糧食產(chǎn)量損失達(dá)1 000萬t以上，導(dǎo)致直接經(jīng)濟(jì)損失超200億元[2-3]。農(nóng)業(yè)面源污染及重金屬污染已成為保障糧食安全亟待解決的問題，國家科技計劃也高度重視農(nóng)業(yè)面源及重金屬污染的綜合防治[4]。鉛作為土壤重金屬污染的主要元素之一，對動植物及人體的生理、生化等多方面均有消極影響[5-6]。鉛污染耕地、空氣、水等已引發(fā)多起群體血鉛中毒事件[7]。環(huán)境保護(hù)部和國土資源部2014年發(fā)布的《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，中國農(nóng)田土壤污染點(diǎn)位超標(biāo)率為19.4%，其中，鉛是土壤污染中風(fēng)險較高的金屬元素之一，呈現(xiàn)從西北到東南、從東北到西南逐漸升高的態(tài)勢。鉛對小麥的營養(yǎng)和生殖生長均存在不同程度的抑制作用[8-9]，而且部分小麥產(chǎn)區(qū)已面臨嚴(yán)重的鉛污染，給小麥生產(chǎn)帶來了新的挑戰(zhàn)；配合耕地土壤污染修復(fù)，在中、輕度污染耕地種植耐受性強(qiáng)、低積累的小麥品種是保障耕地效益和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)糧食的理想途徑。因此，為保障污染農(nóng)田的健康生產(chǎn)，篩選耐鉛的小麥種質(zhì)資源、挖掘鉛積累相關(guān)遺傳位點(diǎn)十分必要[10]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】根據(jù)重金屬在植物生態(tài)系統(tǒng)中的作用，可以將其分為必需金屬和非必需金屬。銅、鐵、錳、鎳和鋅等屬于必需金屬，適量的必需金屬對植物生長發(fā)育有促進(jìn)作用。而鉛、鎘、砷、汞等非必需金屬在植物中沒有已知功能，且對植物生長發(fā)育有毒害作用。在擬南芥中，、、、可以激活A(yù)TP結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)[11-13]，從而增強(qiáng)植物對鉛的耐受性；編碼含有?；o酶A結(jié)合域的蛋白質(zhì)，參與植物鉛耐受性調(diào)控[14]。在煙草和大麥中，NtCBP4（質(zhì)膜鈣調(diào)蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）和HvCBT1（Hordeun vulgare CaM結(jié)合蛋白）編碼的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過調(diào)控陽離子的非選擇性運(yùn)輸，從而使植株表現(xiàn)出對重金屬的耐受性[15-16]。全基因組關(guān)聯(lián)分析是一種檢測復(fù)雜性狀遺傳因素的有效分析方法，已廣泛用于水稻、小麥、玉米等作物重要性狀調(diào)控基因的挖掘[17-19]，并在植物鎘耐受性[20-21]以及油菜耐鉛分子機(jī)制研究[22]等方面取得了重大進(jìn)展?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鉛抑制植物的生長發(fā)育，最顯著的是抑制根系的生長[23-24]，目前，水稻、油菜及柳樹的耐鉛基因型被挖掘應(yīng)用[25-27]，但鮮有耐鉛小麥種質(zhì)篩選及其分子機(jī)制解析相關(guān)報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究參照植物鹽脅迫中采用耐鹽系數(shù)及加權(quán)隸屬函數(shù)值對耐鹽性進(jìn)行評價的方法[28-30]，依據(jù)根部2個性狀和地上部生長速率等3個性狀的耐鉛系數(shù)及加權(quán)隸屬函數(shù)值綜合評價小麥對鉛的耐受性，結(jié)合660K SNP芯片進(jìn)行基因型分析，通過GWAS分析挖掘小麥耐鉛的調(diào)控位點(diǎn)及候選基因。通過篩選小麥耐鉛種質(zhì)，挖掘小麥鉛耐受性相關(guān)遺傳位點(diǎn)及候選基因，為小麥耐鉛種質(zhì)創(chuàng)新及機(jī)理解析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用102份小麥品種（系），其中42份來自河南?。?0.19%），21份來自陜西?。?1.57%），9份來自山東?。?.80%），其余小麥品種（系）來自山西省、江蘇省、安徽省、寧夏自治區(qū)、河北省、甘肅省、北京市及國外（電子附表1）。

1.2 試驗方法及指標(biāo)測定

1.2.1 試驗方法 供試材料于2020年8—10月，在西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室光照培養(yǎng)間進(jìn)行水培試驗。分為空白對照組和鉛脅迫組，空白對照組采用純水+1/2濃度霍格蘭營養(yǎng)液，鉛脅迫組培養(yǎng)液采用濃度為140 mg·kg-1Pb(NO3)2+1/2濃度霍格蘭營養(yǎng)液[31]。培養(yǎng)方法：將種子用75%乙醇消毒5 min，再用純水清洗干凈后置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿（直徑為9 cm）上，每組處理30粒種子，2組處理分別加入純水和140 mg·kg-1Pb(NO3)2進(jìn)行萌發(fā)，3 d后挑選長出第一片葉且長勢一致的10株幼苗移入打好孔的泡沫板，進(jìn)行水培。由于正常濃度的霍格蘭營養(yǎng)液與硝酸鉛反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，降低了鉛離子脅迫濃度，所以本研究采取1/2濃度霍格蘭營養(yǎng)液進(jìn)行水培處理：空白對照組采用純水進(jìn)行培養(yǎng)，鉛脅迫組采用140 mg·kg-1Pb(NO3)2進(jìn)行培養(yǎng)，每個培養(yǎng)盒8個品種，加入3 L培養(yǎng)液，培養(yǎng)液每3天更換一次，培養(yǎng)一周后，將空白對照組的培養(yǎng)液換成1/2濃度霍格蘭營養(yǎng)液，鉛脅迫處理的培養(yǎng)液換成含有140 mg·kg-1Pb(NO3)2的1/2濃度霍格蘭營養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)至三葉期，收獲測量性狀。設(shè)3次重復(fù)試驗。

1.2.2 測定指標(biāo)及測定方法 在萌發(fā)后的第3天及第9天挑選長勢一致的5株小麥，測定其地上部基部到頂部的長度作為苗高，以苗高差與對應(yīng)天數(shù)的比值作為生長速率。

水培至三葉期，收獲長勢均勻一致的5株小麥，采用直接測量法測定其最大根長，將根系全部剪下，80℃烘干至恒重，用萬分之一天平測定根系干物質(zhì)重量，取平均值計算每株小麥的根生物量。

1.3 表型數(shù)據(jù)分析

利用Excel整理最大根長、根生物量、地上部生長速率的觀測值，并分別計算耐鉛系數(shù)[32]，利用隸屬函數(shù)法將各材料3個指標(biāo)的耐鉛系數(shù)分別轉(zhuǎn)換為隸屬函數(shù)值，以某個指標(biāo)的變異系數(shù)在所有指標(biāo)變異系數(shù)中所占的比率為該指標(biāo)耐鹽系數(shù)的權(quán)重，進(jìn)而計算各材料在各重復(fù)下的加權(quán)隸屬函數(shù)值（值）[23]。

耐鉛系數(shù)=鉛脅迫測定值/對照處理測定值×100%

加權(quán)隸屬函數(shù)值（值）的計算公式如下：

(=1,2,3,…,)

=(=1,2,3,…,)

式中，X為各小麥品種（系）基于測定指標(biāo)的耐鉛系數(shù)，Xmax、Xmin分別為供試材料中X的最大值和最小值，(X)為各供試材料X的隸屬函數(shù)值，CV為各供試材料(X)為的變異系數(shù)，W表示CV在總變異中所占的比率。

用R包Lme4計算3次重復(fù)值的最優(yōu)線性無偏性值（best linear unbiased estimate，BLUE）。

廣義遺傳力計算公式如下：

其中，為遺傳方差，為基因型與環(huán)境互作方差，為環(huán)境方差，為環(huán)境數(shù)。

1.4 重金屬含量的測定

自來水沖洗樣品，洗去根系分泌物等，再用去離子水沖洗，瀝干水分，80℃烘至恒重。對樣品的地上部與根部分別進(jìn)行微波消解（Multiprep-41FC2）：稱取0.2 g（不足0.2 g則稱取全部），加入6 ml硝酸（HNO3），微波消解梯度升溫進(jìn)行消解。消解完成后，用1%硝酸定容到10 ml。樣品中的鉛（Pb）含量采用火焰/石墨烯原子吸收光譜儀（日立Z-2000）進(jìn)行測定。

1.5 群體結(jié)構(gòu)與連鎖不平衡分析

使用小麥660K SNP芯片對參試小麥材料進(jìn)行基因分型，對分型結(jié)果進(jìn)行人工質(zhì)量控制，剔除數(shù)據(jù)缺失率＞50%，雜合率大于20%和最小等位基因頻率＜0.1的SNP標(biāo)記，共獲得335 438個高質(zhì)量SNP標(biāo)記。采用Power Marker V3.25軟件分析參試材料的遺傳多樣性和多態(tài)性信息含量（polymorphic information content，），1-(P)2（P表示位點(diǎn)的第個等位變異出現(xiàn)的頻率）。從篩選的標(biāo)記中，隨機(jī)選取2 000個最小等位基因頻率大于10%，且在染色體上均勻分布的SNP，利用Structure 2.3.4軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析；參數(shù)設(shè)置為：Length of Burn-Period=10 000，MCMC Reps after Burn-in=100 000，選擇Admixture Ancestry模型和Dependent Allele Frequencies模式，令K=2—12，每個K值重復(fù)5次。以位點(diǎn)間的相關(guān)系數(shù)平方（2）衡量多態(tài)性位點(diǎn)兩兩之間的連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD），使用PopLDdecay軟件進(jìn)行A、B和D基因組的全基因組連鎖不平衡分析，計算2參數(shù)設(shè)置為：-MaxDist 30000[33-34]；LD衰減分析，將覆蓋SNP對的30 000 kb LD區(qū)間劃分為100 kb的區(qū)間，以第95百分位的2值作為閾值估測LD衰減距離[35]。

1.6 全基因組關(guān)聯(lián)分析及候選基因篩選

基于篩選到的高質(zhì)量SNP標(biāo)記，利用Tassel 5.0軟件中的Q+K混合線性模型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，顯著關(guān)聯(lián)閾值估計為-log10()=5.5（=1/N，其中N=使用的SNP數(shù)量）。此外，為了避免忽略次要位點(diǎn)的影響，還選擇閾值為3進(jìn)行后續(xù)分析。判定SNP標(biāo)記與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的顯著性，利用R語言繪制關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的曼哈頓圖和Q-Q圖[22, 25]。進(jìn)一步利用FarmCPU（fixed and random model circulating probability unification，http://zzlab.net/FarmCPU/index.html）對Tassel的Q+K混合線性模型的分析結(jié)果進(jìn)行檢驗。利用多種環(huán)境下檢測到的與鉛耐受性顯著關(guān)聯(lián)的SNP對供試材料進(jìn)行基因分型，將供試材料分為2類（僅選擇純合基因型），并使用SPSS 25的檢驗分析基因型對表型的效應(yīng)。使用R包ggplot2繪制箱線圖。利用中國春基因組數(shù)據(jù)庫（https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/）獲取與小麥鉛脅迫顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTx序列比對[36]，根據(jù)從Ensemble plants數(shù)據(jù)庫（http://plants.ensembl.org/index.html）下載基因注釋信息，對QTL物理區(qū)間內(nèi)所包含的基因進(jìn)行注釋，輔助候選基因篩選。

2 結(jié)果

2.1 小麥耐鉛種質(zhì)篩選

比較102份小麥材料在0和140 mg·kg-1鉛脅迫下生長至三葉期的最大根長、根生物量和生長速率（圖1-A—圖1-C）。正常處理下的最大根長為4.83—31.87 cm，鉛脅迫處理下的最大根長為1.70—9.87 cm，99.9%小麥材料的最大根長受到抑制，遺傳力為7.57%；正常處理和鉛脅迫處理下根生物量的范圍分別為0.0023—0.0152 g和0.002—0.094 g，68.6%小麥材料的根生物量受到抑制，遺傳力為35.54%；正常處理和鉛脅迫處理下生長速率分別為0.24—2.24 cm·d-1和0.29—1.49 cm·d-1，90.2%小麥材料的生長速率受到抑制，遺傳力為25.62%（圖1-D）。以上結(jié)果表明，大多數(shù)小麥材料的最大根長、根生物量及生長速率在鉛脅迫下均受到不同程度的抑制。

使用最大根長耐鉛系數(shù)、根生物量耐鉛系數(shù)和生長速率耐鉛系數(shù)的加權(quán)隸屬函數(shù)值（值）綜合評價各個品種的鉛耐受性。值范圍為0.029—0.342，變異系數(shù)范圍為44.80%—46.20%，遺傳力為88.9%（表1）。表明這些材料的鉛耐受性存在廣泛的遺傳變異，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)這些材料3次重復(fù)間的鉛耐受性加權(quán)隸屬函數(shù)值（值）顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)超過0.87（圖1-E）。根據(jù)各品種的值，選擇值處于前七位且大于0.3的7個小麥品種為鉛耐受性穩(wěn)定的小麥品種（表2），這7個品種分別來自河南省、陜西省、山西省、山東省等地，均為21世紀(jì)以來育成的品種。

表1 3個重復(fù)中102份小麥鉛耐受性加權(quán)隸屬函數(shù)值（D值）的統(tǒng)計分析

D1：重復(fù)1；D2：重復(fù)2；D3：重復(fù)3；D_Mean：平均值；SD：標(biāo)準(zhǔn)差；：變異系數(shù)；***表示在＜0.001水平差異顯著。下同

D1: repeat 1; D2: repeat 2; D3: repeat 3; D_Mean: D average; SD: Standard deviation;: Variable coefficient; ***Significant at＜0.001.The same as below

A—C：分別為正常處理與鉛脅迫下102份小麥的最大根長、生長速率和根生物量的分布；D：鉛脅迫對小麥品種（系）的抑制情況；E：最大根長、根生物量和生長速率3個指標(biāo)的耐鉛系數(shù)的加權(quán)隸屬函數(shù)值（D值）的頻率分布和相關(guān)性矩陣，D1、D2、D3、average分別代表重復(fù)1、重復(fù)2、重復(fù)3以及3次重復(fù)的平均值。下同

表2 102份小麥材料中篩選出的耐鉛性強(qiáng)的種質(zhì)

取值處于前10位的鉛耐受強(qiáng)性的品種和值處于后10位的鉛耐受性低的品種，對其地上部與根部的鉛含量均值進(jìn)行獨(dú)立樣本的檢驗分析（圖2），結(jié)果表明，對于根部鉛含量，小麥鉛耐受性強(qiáng)的品種顯著低于耐受性低的品種。對于地上部鉛含量，耐受性強(qiáng)的品種低于耐受性低的品種，但差異不顯著。

2.2 SNP多態(tài)性及分布

根據(jù)小麥660K SNP芯片的基因分型結(jié)果，篩選出供試材料中具有多態(tài)性的SNP標(biāo)記335 438個，分布在A、B和D基因組上的SNP數(shù)目分別為124 264（37.05%）、168 168（51.13%）和43 006（12.82%），其中，B基因組的多態(tài)性最高，D基因組的多態(tài)性遠(yuǎn)低于A和B（表3）。21條染色體中，3B染色體上SNP標(biāo)記數(shù)目最多（43 683個），4D染色體上的SNP標(biāo)記數(shù)目最少（2 563個）。3個染色體組的表現(xiàn)為A（0.310）>B（0.308）>D（0.305）。

2.3 群體結(jié)構(gòu)與連鎖不平衡分析

Structure V2.3.4軟件分析結(jié)果（圖3-A）表明，在K=7時，ΔK值最大，曲線變化程度最大，表明參試材料可分為7個類群（圖3-B和圖4）。亞群Ⅰ和亞群Ⅴ分別包含6和23個品種（系），主要來自陜西省，亞群Ⅰ中包含少量甘肅省品種，亞群Ⅴ中包含少量河北省、寧夏自治區(qū)、江蘇省的品種；亞群Ⅱ包含10個品種（系），來自陜西省和河南??；亞群Ⅲ和亞群Ⅳ分別包含26和12個品種（系），主要來自河南?。粊喨孩霭?3個品種，主要來自山東省；亞群Ⅶ包含12個品種（系），來自河南省、安徽省和山東省。基于PopLDdecay對102份小麥品種（系）LD衰減距離計算的結(jié)果及前人對小麥中全基因組LD衰減距離的分析[28, 37]，將物理圖譜上前后5 Mb區(qū)間內(nèi)的位點(diǎn)認(rèn)定為一個候選位點(diǎn)。

表3 SNP標(biāo)記的分布、物理圖譜長度及其多態(tài)性

A：根部鉛含量；B：地上部鉛含量；a：耐受性強(qiáng)品種；b：耐受性低品種；*表示差異顯著（P＜0.05）

A：群體的?K值；B：群體結(jié)構(gòu)示意圖 A: Estimation of ?K value in population; B: Group structure

2.4 耐鉛相關(guān)QTL的檢測

以102份小麥品種（系）3個重復(fù)及BLUE的鉛耐受性評價值（值）和660K SNP芯片檢測到的335 438個SNP分別進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，采用Q+K混合線性模型，重復(fù)D1中檢測到14個顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分別位于2A、2D、3A、3B、5B、7A等6條染色體上，貢獻(xiàn)率為15.61%—20.89%；重復(fù)D2中檢測到11個顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分別位于2A、2D、3A、3B、7A等5條染色體上，貢獻(xiàn)率為15.62%—18.69%；重復(fù)D3中檢測到6個顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分別位于2A、3B、5A等3條染色體上，貢獻(xiàn)率為15.47%—19.39%。重復(fù)BLUE中檢測到9個顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分別位于2A、2D、7A等3條染色體上，貢獻(xiàn)率為14.97%—19.88%。總之，共檢測到20個與小麥鉛耐受性顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)（圖5和表4），貢獻(xiàn)率為15.33%—20.89%。

為了檢測Q+K混合線性模型分析的結(jié)果，進(jìn)一步利用質(zhì)控后得到的335 438個SNP標(biāo)記，運(yùn)用R包GAPIT中的FarmCPU模型對3次重復(fù)及BLUP共4個環(huán)境下小麥鉛耐受性進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，結(jié)合LD衰減距離，共找到8個與小麥鉛耐受性相關(guān)QTL區(qū)間，包含201個顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分別位于1B、2A、2D、3B、5B、7A和7D共7條染色體上（圖5和表5）。Q+K混合線性模型分析得到的20個SNP中有13個的物理位置映射到FarmCPU的結(jié)果QTL區(qū)間內(nèi)或附近，2種方法間存在良好的一致性。

圖中編號對應(yīng)電子附表1中各試驗材料的試驗編號

2.5 不同基因型表型差異分析

為檢驗不同基因型對鉛耐受性的影響，選取Q+K模型檢測到的能夠同時在2個及以上的環(huán)境中檢測到的9個SNP，根據(jù)其基因型對群體進(jìn)行分組，并采用檢驗分析不同基因型對鉛耐受性的效應(yīng)。結(jié)果表明，這9個SNP的2種單倍型間的耐受性值均存在顯著或極顯著差異（圖6）。有5個SNP（AX-109277543、AX-108894641、AX-108776369、AX-110631665、AX-109372076）能夠同時在Q+K模型和FarmCPU模型中被檢測到，對應(yīng)區(qū)間分別為2A的Pb_nwafu-2、2D的Pb_nwafu-3、3B的Pb_nwafu-4和7A的Pb_nwafu-7區(qū)間，表明這些區(qū)間可能包含調(diào)控小麥鉛耐受性的關(guān)鍵候選基因，這些SNP可用于進(jìn)一步開發(fā)小麥鉛耐受性的分子標(biāo)記。

2.6 小麥鉛耐受性候選基因預(yù)測

綜合Q+K混合線性模型篩選出的20個SNP以及FarmCPU篩選出的8個QTL區(qū)間，利用SNP序列檢索中國春小麥基因組數(shù)據(jù)庫，獲得其區(qū)間序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTx序列比對，結(jié)合從Ensemble Plants數(shù)據(jù)庫下載的最新小麥基因組注釋信息（IWGSC RefSeq v1.1），篩選8個QTL區(qū)間內(nèi)可能調(diào)控小麥鉛耐受性的候選基因。共篩選到13個與可能小麥鉛耐受性相關(guān)的候選基因（表6）。通過同源比對、家族分析（圖7-A）及保守結(jié)構(gòu)域分析（圖7-B），結(jié)果表明，這些候選基因的功能主要集中在氧化應(yīng)激反應(yīng)、蛋白質(zhì)修飾等途徑。

表4 GWAS檢測到的小麥鉛耐受性顯著相關(guān)SNP位點(diǎn)

BLUE：最優(yōu)線性無偏性值。下同 BLUE: best linear unbiased estimate.The same as below

*：在P<0.05水平差異顯著；**：在P<0.01水平差異極顯著

表5 FarmCPU檢測到的小麥鉛耐受性顯著相關(guān)的區(qū)間

A：ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)候選基因與擬南芥和小麥的ABCC家族的進(jìn)化樹分析；B：AtMTP3與TraesCS3B02G040900的保守結(jié)構(gòu)域分析

表6 篩選獲得候選基因信息

3 討論

3.1 小麥耐鉛性的分析

鉛是植物非必需重金屬元素，會對植物生長產(chǎn)生一系列負(fù)面效應(yīng)，包括影響光合作用、呼吸和礦物質(zhì)營養(yǎng)[38]。本研究中，鉛脅迫下多數(shù)供試材料出現(xiàn)最大根長顯著縮短、根生物量明顯減小以及生長速率變緩的現(xiàn)象，其中，根部受到的脅迫現(xiàn)象最明顯，可能是由于根部直接暴露在鉛溶液中。鉛耐受性指植物適應(yīng)和應(yīng)對鉛脅迫的能力，然而，在作物種質(zhì)資源耐鉛性鑒定和耐鉛遺傳改良的研究中，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，多數(shù)研究采用植株在脅迫環(huán)境下的生長狀況來反應(yīng)耐受性[22, 39-40]。小麥對鉛脅迫的耐受性屬于數(shù)量性狀，易受環(huán)境影響，本研究通過正常和鉛脅迫條件下測定指標(biāo)的耐鉛系數(shù)以及各個耐鉛系數(shù)組成的加權(quán)隸屬函數(shù)值值來評價小麥對鉛的耐受性[24]，可反映不同材料的綜合耐性。本研究供試材料存在廣泛的表型變異，根據(jù)耐受性值從群體中選擇了7個鉛耐受性強(qiáng)的小麥材料，可為耐鉛小麥種質(zhì)創(chuàng)新提供資源。

植物修復(fù)是目前治理重金屬污染土壤的策略之一，利用重金屬超富集植物從土壤中吸收重金屬從而實(shí)現(xiàn)重金屬污染土壤的修復(fù)[41]。對于中、輕度污染耕地，通過單一的重金屬超富集植物進(jìn)行植物修復(fù)存在不利于正常的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)效益較低等問題[42-43]，故常選擇利用超富集植物對土壤進(jìn)行修復(fù)的同時與低積累農(nóng)作物品種進(jìn)行間作的方式，目前已在玉米、大蔥等農(nóng)作物中得到了很好的應(yīng)用[44-46]。因此，急需篩選鉛低積累小麥材料，為耐鉛小麥種質(zhì)創(chuàng)新提供資源。本研究篩選的鉛耐受性強(qiáng)、鉛積累量低的小麥品種為小麥產(chǎn)區(qū)中輕度重金屬污染農(nóng)田的間作配套和健康生產(chǎn)提供了選擇。有趣的是，在本研究篩選的7個鉛耐受性品種中，最大根長耐鉛系數(shù)以及生長速率耐鉛系數(shù)的范圍分別是0.406—0.775及0.541—1.464，而根生物量耐鉛系數(shù)的變化范圍為1.190—1.809，均大于1，說明鉛有可能在抑制最大根長的同時增加了根直徑，并最終提高了根系干物質(zhì)積累量。根據(jù)對小麥耐受品種與不耐受品種地上部和根部的鉛含量測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)鉛脅迫下小麥根部富集的鉛含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于地上部富集的鉛含量，這與之前的研究結(jié)果[47]一致，耐受品種與不耐受品種地上部鉛含量的顯著差異也表明耐受性強(qiáng)的小麥品種很可能是通過限制根部對鉛離子的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或通過對鉛離子外排及解毒作用來降低鉛積累，并最終提高小麥對鉛的耐受性[10]。本研究根據(jù)耐受性系數(shù)對20個極端小麥品種的鉛含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鉛耐受性和根系、地上部的鉛積累量存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，然而，植物對重金屬離子鉛的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制比較復(fù)雜，后續(xù)還需在更大的群體中進(jìn)行驗證，明確鉛耐受性與鉛積累量的相互關(guān)系及協(xié)調(diào)機(jī)制。

3.2 小麥鉛耐受性GWAS分析

隨著高通量測序和基因芯片技術(shù)的快速發(fā)展，全基因組關(guān)聯(lián)分析成為一種快速簡便分析復(fù)雜性狀遺傳變異的方法，已經(jīng)成功應(yīng)用于多種作物基本性狀的遺傳變異研究，包括小麥品質(zhì)、水稻產(chǎn)量、大豆光合作用等性狀[25, 48]。STICH等[49]研究認(rèn)為，Q+K混合線性模型是全基因組關(guān)聯(lián)分析中降低假陽性的最好方法之一。本研究采用Q+K混合線性模型對102份供試材料的小麥鉛耐受性進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，同時，為了提高關(guān)聯(lián)分析的準(zhǔn)確率以及避免忽略微效位點(diǎn)，本研究同時還采用FarmCPU方法[50]，以驗證補(bǔ)充Q+K混合線性模型。目前，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析方法研究小麥鉛耐受性、挖掘耐性相關(guān)基因的報道比較少，本研究通過全基因組關(guān)聯(lián)分析方法共檢測到20個與鉛耐受性顯著關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)和8個關(guān)鍵QTL區(qū)間。其中，候選區(qū)間Pb_nwafu-2內(nèi)有擬南芥的同源基因（小麥2A染色體753 Mb處），該基因?qū)︺U離子進(jìn)入植物細(xì)胞的運(yùn)輸途徑具有調(diào)控作用。候選區(qū)間Pb_nwafu-7附近有擬南芥基因的同源基因（小麥7A染色體671 Mb處），該基因編碼ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與擬南芥對鉛的解毒作用[51]。因此，候選區(qū)間Pb_nwafu-2和Pb_nwafu-7可以作為小麥耐鉛分子機(jī)制研究的重點(diǎn)區(qū)間，可在此區(qū)間挖掘相關(guān)候選基因，為小麥耐鉛脅迫分子機(jī)制研究提供參考。同時，為進(jìn)一步驗證部分SNP單倍型與鉛耐受性的關(guān)系，本研究選擇了9個SNP進(jìn)行檢驗，其中，有5個SNP的2種純合基因型間的鉛耐受性存在顯著差異（＜0.05），且這5個SNP能夠在多次重復(fù)及2種關(guān)聯(lián)分析方法中檢測到，可作為小麥鉛耐受性改良的優(yōu)勢位點(diǎn)和選擇標(biāo)記。后續(xù)研究中，可依據(jù)這5個SNP標(biāo)記的位置及候選基因篩選結(jié)果，選擇2A、2D、3B、7A染色體上對應(yīng)的區(qū)間作為熱點(diǎn)區(qū)間，進(jìn)一步在更大的遺傳群體中驗證標(biāo)記的實(shí)用性，并深入分析相關(guān)候選基因的作用機(jī)制。

3.3 鉛耐受性相關(guān)候選基因預(yù)測

本研究共篩選到13個可能與小麥鉛耐受性相關(guān)的基因，位于2D、3B上的3個基因、、編碼跨膜蛋白。位于2D上的基因編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。位于1B、7A上的6個基因編碼ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC）主要通過結(jié)合和水解ATP釋放能量，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，從而實(shí)現(xiàn)包括重金屬螯合物、金屬離子在內(nèi)的多種底物的跨膜運(yùn)輸[52-53]。ABCC多藥耐藥蛋白家族（ABCC- MRP）是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一個亞家族，參與包括細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、金屬解毒、谷胱甘肽結(jié)合物轉(zhuǎn)運(yùn)在內(nèi)的多種生理過程[54]。本研究候選基因、和與擬南芥和同源性較高，且有研究表明和能夠介導(dǎo)擬南芥對鎘和汞的耐受性[55]，因此，這3個候選基因可以作為今后鉛脅迫遺傳機(jī)制的研究重點(diǎn)。位于3B染色體上的編碼金屬耐受蛋白，金屬耐受蛋白（metal tolerance protein，MTP）可以催化過渡金屬離子從胞質(zhì)外進(jìn)入亞細(xì)胞區(qū)，影響植物對重金屬的耐性和積累[56]，與擬南芥（與金屬二價陽離子耐受性相關(guān)的基因，圖7-B）具有相同的保守結(jié)構(gòu)域，該保守結(jié)構(gòu)與陽離子外排相關(guān)[57]，且根據(jù)小麥公共表達(dá)量數(shù)據(jù)庫顯示在根中表達(dá)。位于7A的基因編碼過氧化物酶，重金屬脅迫可能會導(dǎo)致小麥體內(nèi)產(chǎn)生過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），進(jìn)一步誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而影響植物對重金屬的耐性和積累[10]。位于2A、7A的2個基因、編碼分別編碼組蛋白H2A去泛素化酶和泛素結(jié)合因子，泛素和去泛素化對蛋白質(zhì)的修飾作用可以減輕重金屬對植物的毒害作用[22]。本研究篩選的候選基因編碼不同蛋白，在植物抵御重金屬脅迫中起直接或間接作用，其中、、和可以作為后續(xù)小麥耐鉛分子機(jī)制研究的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

通過Q+K混合線性模型獲得20個與小麥鉛耐受性顯著關(guān)聯(lián)的遺傳位點(diǎn)，通過FarmCPU模型檢測到8個與小麥鉛耐受性顯著關(guān)聯(lián)的QTL，2種模型的分析結(jié)果在物理位置上存在較好的一致性。最終獲得13個與小麥鉛耐受性直接或間接相關(guān)的候選基因，分別編碼不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、過氧化物酶、跨膜蛋白以及泛素

與去泛素化，可能通過參與氧化應(yīng)激反應(yīng)、蛋白質(zhì)修飾等途徑來調(diào)節(jié)小麥對鉛的耐受性。

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Genome-Wide Association Analysis of Lead Tolerance in Wheat at Seedling Stage

ZHI Lei1, ZHE Li1, SUN NanNan1, YANG Yang1, Dauren Serikbay1,2, JIA HanZhong3, HU YinGang1, CHEN Liang1*

1College of Agronomy, Northwest A&F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling 712100, Shaanxi, China;2S.Seifullin Kazakh Agro Technical University, Nursultan 010011, Kazakhstan;3College of Resources and Environment, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi, China

【Objective】With the advancement of industrialization, the pollution of arable land by heavy metals, especially lead, has become a worldwide problem.Wheat is an important food crop, and its safe cultivation is critical to maintaining food security.Screening wheat varieties with strong tolerance to lead, low lead accumulation and mining relevant regulatory genes or QTL regions would lay foundation for further elucidating the genetic mechanism of lead tolerance in wheat.【Method】The tolerance to lead of 102 wheat varieties (advanced lines) were evaluated with a 140 mg·kg-1lead nitrate solution at the seedling stage, by the weighted membership function value (D Value) of the lead tolerance coefficients of maximum root length, root biomass and growth rate under three replicates, combining with the 335 438 high-quality SNPs(single nucleotide polymorphism)markers by wheat 660K SNP chip, a genome-wide association study (GWAS) for lead tolerance in wheat was conducted, to mine the candidate genes for lead tolerance in wheat.【Result】The lead among between wheat varieties (advanced lines) under different replicates showed rich variation, with the coefficient of variation of 44.8%-46.2%, and the correlation coefficient was between 0.87-0.97 (＜0.001).It was found that varieties with strong lead tolerance showed low lead accumulation characteristics.The genotyping results showed that the SNP polymorphic information content (PIC) was 0.28-0.32, the population structure analysis showed that these wheat materials could be divided into 7 subgroups; a total of 20 SNPs and 8 key chromosomal segments that were significantly associated with lead tolerance in wheat (≤0.001) were detected by two GWAS methods respectively distributed on chromosomes 1B, 2A, 2D, 3A, 3B, 5A, and 7A.A single locus explains 15.33%-19.75% of the phenotypic variation, and 10 and 8 key chromosomal segments were detected in two and more environments.Analysis of candidate genes for significant and stable association sites and intervals revealed that the functions of the candidate genes were mainly related to transmembrane transport, protein modification and oxidative stress response, including 7 genes related to transporters, including,,etc.Two genes involved in ubiquitination and deubiquitination(and), three genes encoding transmembrane proteins (,and), one gene related to peroxidase ().【Conclusion】Seven wheat materials with strong lead tolerance were screened, 20 SNPs in 8 candidate regions significantly related to lead tolerance in wheat were detected, and 13 candidate genes related to lead tolerance in wheat were finally screened.

wheat; lead tolerance; genome-wide association analysis; candidate gene analysis

2021-09-18；

2021-11-16

國家自然科學(xué)基金（31671695）、陜西省重點(diǎn)研發(fā)計劃（2020NY-045）

職蕾，E-mail：zl9711110@163.com。通信作者陳亮，E-mail：chenliang9117@qq.com

（責(zé)任編輯 李莉）