伏馬毒素B1對豬體外成熟卵母細胞凋亡與自噬的影響

李文慧，賀依靜，姜瑤，趙紅宇，彭磊，李佳，芮榮，劇世強

伏馬毒素B1對豬體外成熟卵母細胞凋亡與自噬的影響

李文慧，賀依靜，姜瑤，趙紅宇，彭磊，李佳，芮榮，劇世強*

南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，南京 210095

【目的】探究伏馬毒素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）對豬卵母細胞體外成熟的影響及其潛在的作用機制, 為臨床有效防治FB1所致的生殖毒性損傷提供理論參考?！痉椒ā坎杉i卵丘-卵母細胞復合體（cumulus oocyte complexes, COCs）進行隨機分組，在體外成熟培養(yǎng)過程中分別用不同濃度FB1（0、10、20和30 μg·mL-1）處理44 h后，統(tǒng)計卵母細胞第一極體（first polar body, PB1）排出和激活后胚胎發(fā)育情況；通過免疫熒光染色結合共聚焦顯微鏡技術進一步檢測FB1對卵母細胞減數(shù)分裂進程和細胞骨架結構的影響；為進一步探究FB1對豬卵母細胞毒性損傷的作用機制，分別采用JC-1、Annexin V-FITC和LC3A/B熒光染色檢測各組卵母細胞內線粒體功能、早期凋亡和自噬水平，并在此基礎上，進一步通過Western blotting分析了凋亡/自噬相關蛋白的表達情況?！窘Y果】FB1處理對卵母細胞成熟具有明顯的抑制作用，PB1排出率呈濃度依賴性下降，當FB1濃度達到20 μg·mL-1以上時，PB1排出率顯著降低（＜0.01），并使卵母細胞孤雌激活后胚胎的卵裂率及囊胚率均顯著降低（＜0.01），對卵母細胞的發(fā)育潛力有一定的損傷作用。細胞周期分析結果表明，F(xiàn)B1處理還會導致減數(shù)分裂周期進程紊亂，使阻滯在生發(fā)泡破裂期（germinal vesicle breakdown，GVBD）的卵母細胞比例顯著升高（＜0.01）成功發(fā)育至第二次減數(shù)分裂中期（metaphase II，MII）細胞比例明顯下降（＜0.01），同時，卵母細胞中紡錘體異常的比例顯著升高（＜0.01）、胞膜上的微絲分布顯著減少（＜0.05）。進一步的研究結果表明，與對照組相比，F(xiàn)B1處理組卵母細胞線粒體膜電位明顯降低（＜0.05），線粒體功能受損，同時，F(xiàn)B1處理組卵母細胞早期凋亡率顯著增加（＜0.01），細胞自噬水平也顯著升高（＜0.01）。Western blotting分析結果顯示，F(xiàn)B1處理組卵母細胞中促凋亡蛋白BAX和自噬蛋白LC3A/B II的表達均顯著上調（＜0.05），抑凋亡蛋白BCL2的表達顯著下調（＜0.05），提示早期凋亡和自噬的發(fā)生?！窘Y論】FB1對豬卵母細胞體外成熟及其激活后胚胎發(fā)育具有明顯的毒性損傷作用，致使減數(shù)分裂周期阻滯，紡錘體結構紊亂、微絲分布減少和線粒體損傷，其毒性作用機制與誘導卵母細胞凋亡和自噬有關。

豬卵母細胞；伏馬毒素B1；細胞骨架；凋亡；自噬

0 引言

【研究意義】伏馬毒素是輪枝鐮刀菌（）、層生鐮刀菌（）等真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，廣泛分布于世界各地的糧食作物中，其中，玉米和以玉米為原料的制品最容易被伏馬毒素污染[1]。在目前已發(fā)現(xiàn)的28種伏馬毒素類似物中，伏馬毒素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）的污染最為廣泛，且毒性最強，對動物及人類健康造成極大的威脅[2]。近年來，關于FB1的污染及其毒性作用已成為相關領域的研究熱點?！厩叭搜芯窟M展】FB1可通過受污染的農(nóng)作物及飼料等途徑進入動物體，引起機體產(chǎn)生多種毒性，包括肝毒性[3]、腎毒性[4]、免疫毒性[5]、神經(jīng)毒性[6-7]和發(fā)育毒性[8]等，嚴重危害動物及人類健康。此外，F(xiàn)B1慢性中毒還是細胞癌變的重要誘發(fā)因素[9]，國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）還將FB1列為2B類致癌物[1]。已有研究證實FB1的毒性作用機制與擾亂鞘脂代謝、誘導氧化應激、觸發(fā)細胞凋亡、調節(jié)自噬水平密切相關[10-13]。近年來關于FB1的生殖毒性也越來越受到關注。GBORE等[14]研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加FB1會導致公豬精液質量顯著下降。HENRY等[15]證明肉雞胚胎中注射FB1后，胚胎死亡率顯著增加。還有證據(jù)表明FB1具有致母體及胚胎雙重毒性，F(xiàn)B1不僅會引起母體生殖功能損傷，還會通過胎盤屏障影響胎兒正常發(fā)育[8, 16-17]。SOMOSK?I等[18]發(fā)現(xiàn)在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中聯(lián)合使用FB1和T-2毒素處理可顯著降低囊胚發(fā)育率。由于FB1與葉酸轉運體的高親和力會導致葉酸代謝紊亂，從而引起胚胎發(fā)育期間的葉酸缺乏綜合征，導致生長遲緩和發(fā)育異常，胚胎神經(jīng)管缺陷（NTDs）等[8]。此外，新近研究結果表明FB1可影響豬顆粒細胞增殖和類固醇的產(chǎn)生，提示FB1可能對豬卵母細胞也具有潛在生殖毒性[19]?！颈狙芯壳腥朦c】然而，目前有關FB1的生殖毒性研究，主要集中在對雄性動物和妊娠期胚胎發(fā)育的毒性上，而有關FB1對雌性動物的生殖毒性研究甚少，尤其是FB1對哺乳動物卵母細胞是否具有毒性作用目前尚不明確?！緮M解決的關鍵問題】本研究旨在探討FB1對豬卵母細胞體外成熟的影響及其潛在的作用機制。本試驗以體外培養(yǎng)的豬卵母細胞為研究模型，利用免疫熒光染色、蛋白免疫印跡等方法檢測了FB1對豬卵母細胞體外成熟、發(fā)育潛力、細胞周期進程、紡錘體裝配以及微絲分布的影響，并從線粒體功能、細胞凋亡和自噬調節(jié)機制上深入探究了FB1的毒性作用，為臨床上有效防治FB1所致的生殖毒性損傷提供理論參考。

1 材料與方法

試驗于2019年10月至2020年10月在南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院動物生殖生物學實驗室進行。

1.1 主要試劑與儀器

伏馬毒素B1（FB1），美國sigma公司產(chǎn)品；四甲基異硫氰酸羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽（TRITC Phalloidin），翊圣生物科技公司（上海）產(chǎn)品；兔抗α-Tubulin抗體，英國Abcam公司產(chǎn)品；兔抗LC3 A/B抗體，美國CST公司產(chǎn)品；兔抗BCL-2抗體，美國Proteintech公司產(chǎn)品；兔抗BAX抗體，Bioss公司（北京）產(chǎn)品；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L），碧云天生物科技公司（上海）產(chǎn)品；TRITC標記羊抗兔IgG（H+L），華安生物科技公司（杭州）產(chǎn)品；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒，諾唯贊生物科技公司（南京）產(chǎn)品；其他試劑若無特殊標注均購自美國sigma公司。激光共聚焦熒光顯微鏡，德國Zeiss公司產(chǎn)品；電泳儀和瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司產(chǎn)品；CRY-3細胞融合儀，新芝生物科技公司（寧波）產(chǎn)品。

1.2 豬卵母細胞采集與培養(yǎng)

試驗所用豬卵巢均來自南京本地屠宰場，離體后立即置入含有青、鏈霉素的37°C無菌生理鹽水的保溫瓶中，2 h內運送至試驗室。用10 mL一次性注射器從直徑3—6 mm的卵泡中抽取卵丘-卵母細胞復合體（cumulus oocyte complexes，COCs），在體視顯微鏡下挑選胞質均勻、緊密包裹3層及3層以上卵丘細胞的COCs，用TCM 199成熟培養(yǎng)液洗3次后隨機分組放入提前平衡12 h以上的TCM 199成熟培養(yǎng)液中，于38.5°C、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行體外成熟培養(yǎng)[20]。分別在體外培養(yǎng)28 h或44 h后，用0.1%透明質酸酶消化去除卵丘細胞，收集卵母細胞進行后續(xù)試驗。

1.3 FB1處理

將FB1用二甲基亞砜溶解為5 μg·μL-1的儲存液，于-20°C保存。將收集到的COCs進行隨機分組，分別置于已添加不同濃度FB1（0，10，20和30μg·mL-1）的TCM 199成熟培養(yǎng)液中進行體外成熟培養(yǎng)，分析不同濃度FB1對豬卵母細胞體外成熟的影響。

1.4 卵母細胞激活與胚胎體外培養(yǎng)

收集各組胞質均勻、胞膜完整、且排出第一極體（first polar body，PB1）的發(fā)育至第二次減數(shù)分裂中期（metaphase II，MII）的卵母細胞進行孤雌激活。用細胞融合儀施加1.5 kV/cm的直流電壓，80 μs脈寬和1次脈沖電激活卵母細胞后，移至化學激活液（含2 mmol·L-1的6-二甲氨基嘌呤和5μg·mL-1細胞松弛素B的PZM-3胚胎培養(yǎng)液）孵育4 h進行化學輔助激活。激活后的胚胎置入提前平衡12 h以上的PZM-3胚胎培養(yǎng)液中，于38.5°C、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)168 h[21-22]。在培養(yǎng)48 h后，統(tǒng)計胚胎卵裂率，培養(yǎng)168 h后統(tǒng)計囊胚發(fā)育率。

1.5 免疫熒光染色與激光共聚焦成像

收集各組卵母細胞，用4%多聚甲醛室溫固定30 min后移入1% TritonX-100中室溫通透8 h，再用1%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）37°C封閉1 h。對于微管染色，卵母細胞與鼠抗α-tubulin- FITC單克隆抗體（1﹕200）于37°C避光孵育2 h；對于微絲染色，卵母細胞與TRITC標記的Phalloidin（1﹕100）于37°C避光孵育1 h；對于自噬染色，卵母細胞與兔抗LC3A/B抗體（1﹕100）于4°C孵育12 h后，再與TRITC標記的二抗37°C孵育1 h。最后，卵母細胞與Hoechst 33342于37°C避光染核15 min后甘油封片，置于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 線粒體膜電位（Δψm）檢測

按照線粒體膜電位檢測（JC-1）試劑盒說明書配制染色工作液，將洗滌好的卵母細胞移入提前在37°C溫育好的JC-1染色工作液中，37°C避光孵育30 min。最后用甘油封片，置于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍照。用Image J軟件分析紅、綠色熒光強度的相對比值，即得出細胞的線粒體膜電位值Δψm。

1.7 Annexin-V-FITC凋亡檢測

按照Annexin-V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書介紹的方法，將洗滌好的卵母細胞置于含10% Annexin- V-FITC染色工作液中，在37°C避光孵育20 min后，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，甘油封片，置于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察統(tǒng)計卵母細胞凋亡率。

1.8 熒光強度分析

采用Image J軟件分析熒光強度，經(jīng)過相同的染色步驟和一致的共聚焦顯微鏡拍攝參數(shù)獲得卵母細胞熒光圖像，軟件分析圖片目的區(qū)域單位面積的平均熒光強度，計算所有測量值的平均值，處理組卵母細胞測量平均值與對照組卵母細胞測量平均值的比值即為相對平均值。

1.9 蛋白免疫印跡

每組收集100枚卵母細胞，經(jīng)含β-巰基乙醇的裂解液裂解后置于沸水中煮沸10 min。根據(jù)蛋白大小選用12%分離膠和4%濃縮膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品總蛋白。電泳結束后采用半干轉移法將凝膠上的蛋白轉印到PVDF膜上。經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，PVDF膜與一抗4°C孵育12 h，洗膜3次，每次10 min，接著PVDF膜與對應的二抗37°C孵育1 h，洗膜3次，每次10 min。最后，PVDF膜與ECL發(fā)光液（1﹕1配制）孵育1 min后，置于凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影并拍照。采用Image J軟件進行蛋白條帶灰度分析。

1.10 數(shù)據(jù)分析

每次試驗所用的卵母細胞均來自同一批次的卵巢，每組進行3次以上重復試驗，且每組卵母細胞不少于25枚。采用Graph Pad Prism 5.0軟件進行獨立樣本t測驗或單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）。所有試驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)± 標準誤表示。＜0.05判為差異顯著。

2 結果

2.1 不同濃度FB1對豬卵母細胞第一極體排出率的影響

為研究不同濃度FB1對卵母細胞體外成熟的影響，在TCM 199成熟培養(yǎng)液中分別添加0，10，20和30 μg·mL-1FB1，培養(yǎng)44 h后，在體視顯微鏡下觀察PB1排出情況。如圖1所示，對照組中大部分卵母細胞（74.97%3.42%）排出PB1，發(fā)育至MII期，而在不同濃度FB1處理組中，隨著FB1濃度的增加，PB1排出率呈現(xiàn)出濃度依賴性下降的趨勢，當FB1作用濃度達到20和30 μg·mL-1時，PB1排出率顯著下降至（49.882.45）%（＜0.01）和（33.203.04）%（＜0.001）。以上結果提示，F(xiàn)B1處理顯著抑制PB1排出，導致卵母細胞成熟失敗。由于20 μg·mL-1FB1處理導致卵母細胞成熟率顯著降低，具有統(tǒng)計學差異（＜0.01），且仍有部分卵母細胞可以發(fā)育到MII期，有利于激活后進一步評價胚胎發(fā)育潛力，故選取20 μg·mL-1作為后續(xù)試驗的FB1處理濃度。

A：卵母細胞體外培養(yǎng)44 h后的形態(tài)（黑色箭頭指向第一極體）；B：不同濃度FB1處理對PB1排出率的影響

2.2 FB1對卵母細胞激活后胚胎發(fā)育潛力的影響

為進一步探討FB1對豬卵母細胞發(fā)育潛力的影響，挑選出FB1處理后仍發(fā)育至MII期的卵母細胞進行孤雌激活，在PZM-3胚胎培養(yǎng)液中進行胚胎培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)48和168 h后，檢查卵裂和囊胚發(fā)育情況。如圖2所示，F(xiàn)B1處理組中有（58.732.96）%的胚胎發(fā)生了卵裂，（15.021.27）%的胚胎發(fā)育到了囊胚期，與對照組相比，卵裂率和囊胚率均顯著降低（＜0.01）。這些結果顯示，F(xiàn)B1處理還會進一步影響卵母細胞激活后胚胎的發(fā)育能力。

A：2細胞/4細胞胚胎和囊胚的形態(tài)（黑色箭頭指向卵裂的胚胎）；B：卵裂率；C：囊胚率

2.3 FB1對豬卵母細胞減數(shù)分裂進程的影響

為探究FB1處理導致卵母細胞成熟失敗的原因，我們通過免疫熒光染色與共聚集成像技術分析了FB1處理44 h后卵母細胞減數(shù)分裂周期進程的變化情況。首先，研究了豬卵母細胞成熟過程中正常細胞骨架的動態(tài)分布規(guī)律，結果如圖3所示，根據(jù)減數(shù)分裂各時期紡錘體微管及染色體的結構特征[20]，將減數(shù)分裂過程分為5個時期：生發(fā)泡期（germinal vesicle，GV）、生發(fā)泡破裂期（germinal vesicle breakdown，GVBD）、第一次減數(shù)分裂中期（metaphase I，MI）、第一次減數(shù)分裂后期-末期（anaphase-telophase I，ATI）、第二次減數(shù)分裂中期（metaphase II，MII）。在GV期，染色質呈環(huán)狀，有完整的核膜；在GVBD期，核膜破裂，染色質凝聚成染色體，微管聚集在凝聚的染色體周圍形成網(wǎng)狀結構；在MI期，同源染色體在赤道板上重組排列，與微管組裝形成典型的中期雙極紡錘體。在ATI期，通過紡錘體牽引成功分離同源染色體，微管分布在兩組染色體之間。在MII期，PB1排出，微管和重組染色體在皮質下組裝成新的減數(shù)分裂紡錘體。

細胞周期統(tǒng)計結果如圖4所示，對照組大部分卵母細胞排出PB1，發(fā)育至MII期（75.832.45）%，只有少量卵母細胞停留在GVBD期（10.831.80）%，然而FB1處理組中MII期卵母細胞比例顯著減少至（51.222.72）%（＜0.01），同時GVBD期卵母細胞比例顯著增加至（29.700.77）%（＜0.01）。綜上結果表明，F(xiàn)B1處理會擾亂豬卵母細胞減數(shù)分裂的周期進程，并使細胞成熟分裂阻滯在GVBD期。

2.4 FB1對豬卵母細胞紡錘體結構的影響

為了探究FB1處理引起卵母細胞減數(shù)分裂阻滯在GVBD期而不能發(fā)育至MI期的原因，我們進一步檢測了FB1處理28 h后的卵母細胞紡錘體的組裝情況。如圖5所示，對照組卵母細胞的染色體聚集排列在赤道板上，兩側的微管蛋白α-tubulin裝配成典型的紡錘體結構，顯示出較低的紡錘體異常率（26.371.84）%。與對照組相比，F(xiàn)B1處理后卵母細胞紡錘體異常率顯著升高至（51.411.77）%（＜0.01），表現(xiàn)為微管結構紊亂、染色體排列不齊。這一結果表明，F(xiàn)B1處理導致MI期卵母細胞紡錘體結構異常。

2.5 FB1對豬卵母細胞微絲表達與分布的影響

通過微絲熒光染色分析了FB1處理對MI期卵母細胞微絲表達與分布的影響。結果如圖6所示，對照組和FB1處理組中卵母細胞的微絲信號均定位在細胞膜上，但與對照組卵母細胞膜上較強的微絲信號相比，F(xiàn)B1處理組卵母細胞膜上的微絲熒光信號顯著減弱（1.000.05 VS 0.740.04，＜0.05）。以上結果提示，F(xiàn)B1干擾了MI期卵母細胞胞膜上的微絲表達與分布。

藍色：染色體；綠色：微管 Blue: chromosome; green: tubulin

GV：生發(fā)泡期；GVBD：生發(fā)泡破裂期；MI：第一次減數(shù)分裂中期；ATI：第一次減數(shù)分裂后-末期；MII：第二次減數(shù)分裂中期

A：紡錘體結構和染色體排列的代表性圖像（藍色：染色體；綠色：微管）；B：紡錘體異常百分比

A：微絲分布的代表性圖像（紅色：微絲）；B：胞膜上微絲的相對平均熒光強度

2.6 FB1對豬卵母細胞線粒體膜電位的影響

試驗進一步研究了FB1對豬卵母細胞線粒體膜電位的影響。結果如圖7所示，與對照組相比，F(xiàn)B1處理組卵母細胞中的JC-信號（即紅/綠熒光強度比值）顯著降低（1.000.06 VS 0.670.02，＜0.05），指示線粒體膜電位的下降[23]。以上結果提示，F(xiàn)B1作用后，豬卵母細胞的線粒體膜電位受到損傷，發(fā)生了明顯的去極化。

2.7 FB1對豬卵母細胞早期凋亡的影響

本試驗使用Annexin V-FITC對卵母細胞進行早期凋亡染色鑒定，結果如圖8所示，與對照組相比，F(xiàn)B1處理組中卵母細胞膜上呈現(xiàn)清晰且強烈的綠色熒光信號，提示發(fā)生了早期凋亡[20]。統(tǒng)計分析顯示FB1處理組凋亡卵母細胞比例（45.74%3.79%）顯著高于對照組（15.54%1.12%，＜0.01）。蛋白免疫印跡分析結果也顯示，與對照組相比，F(xiàn)B1處理組中BAX蛋白表達顯著增加（1.000.08 VS 1.870.09，＜0.05），BCL2蛋白表達顯著下降（1.000.05 VS 0.570.09，＜0.05）。以上結果提示，F(xiàn)B1處理誘導豬卵母細胞發(fā)生了凋亡。

2.8 FB1對豬卵母細胞自噬水平的影響

為了研究FB1處理是否會導致卵母細胞自噬的發(fā)生，我們檢測了卵母細胞中自噬的生物標記LC3的表達情況。結果如圖9所示，在對照組卵母細胞胞質中僅有少量的自噬紅色熒光信號，而FB1處理組卵母細胞胞質中的紅色熒光強度顯著增加（1.000.05 VS 1.600.04，＜0.01）。接著，通過免疫印跡的方法檢測了LC3A/B蛋白的表達。結果表明，F(xiàn)B1處理組中LC3A/B II的蛋白表達水平明顯高于對照組（1.000.09 VS 2.030.26，＜0.05），提示自噬水平升高[24]。以上結果提示，F(xiàn)B1處理導致豬卵母細胞發(fā)生自噬，這可能是導致卵母細胞成熟率下降及發(fā)育能力降低的原因之一。

A：JC-1染色的代表性圖像（綠色：JC-1單體；紅色：JC-1聚集體；黃色：合并圖）；B：JC-1紅/綠信號的相對平均熒光強度

A：Annexin-V-FITC染色的代表性圖像和早期凋亡率（綠色：Annexin V熒光信號）；B：BAX和BCL2蛋白表達

A：LC3A/B染色的代表性圖像和LC3A/B信號的相對平均熒光強度（紅色：LC3熒光信號）；B：LC3A/B蛋白表達

3 討論

近年來，F(xiàn)B1污染食品和飼料已成為一個日益嚴重的問題，體內及體外研究均表明FB1會對動物生殖系統(tǒng)造成嚴重危害[16-17, 19]。但FB1是否會對動物生殖細胞直接產(chǎn)生毒性損傷，目前尚不明確。本研究以體外成熟進程中的豬卵母細胞為研究對象，結合間接免疫熒光染色、蛋白免疫印跡等試驗方法，探討了FB1對豬卵母細胞體外成熟的影響及潛在的作用機制。結果表明，F(xiàn)B1可顯著抑制豬卵母細胞體外成熟及其激活后早期胚胎發(fā)育，其毒性作用機制與誘導細胞骨架損傷、觸發(fā)凋亡和激活自噬密切相關。

3.1 FB1對豬卵母細胞體外成熟的影響

哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂是精密復雜的生物學過程，該過程能否正常進行直接影響到后期胚胎的發(fā)育，而PB1的順利排出是判定卵母細胞成熟的重要評估指標[25-26]。筆者的研究結果首先發(fā)現(xiàn)，當FB1劑量達20μg·mL-1以上時，卵母細胞PB1排出率被顯著抑制，激活后胚胎的卵裂與囊胚胎發(fā)育率也明顯降低，提示FB1處理不僅對卵母細胞體外成熟具有明顯抑制作用，還會進一步影響卵母細胞的發(fā)育潛力。哺乳動物卵母細胞成熟分裂包括兩次連續(xù)的減數(shù)分裂，而兩次減數(shù)分裂的順利完成與細胞骨架及細胞周期進程的精密協(xié)調密切相關[27]。本研究發(fā)現(xiàn)FB1處理會擾亂豬卵母細胞減數(shù)分裂的周期進程，并使細胞分裂阻滯在GVBD期。之前在其他多種細胞類型的研究結果也證實FB1可通過擾亂細胞周期來發(fā)揮其細胞毒性作用[28-30]。本研究結果表明FB1可誘導豬卵母細胞減數(shù)分裂周期阻滯在GVBD期，導致卵母細胞成熟失敗。

紡錘體組裝和微絲分布在減數(shù)分裂過程中至關重要，微絲肌動蛋白調節(jié)減數(shù)分裂紡錘體的遷移并啟動PB1排出進程，而微管形成紡錘體牽引著染色體排列在赤道板上，并牽引染色體發(fā)生分離，這些事件中的任何錯誤都可能導致細胞周期停止[31]。由于FB1處理導致細胞周期停滯在GVBD期，我們檢測了MI期卵母細胞的細胞骨架結構。結果發(fā)現(xiàn)FB1處理導致MI期卵母細胞紡錘體結構紊亂、微絲分布減弱。這一結果提示FB1對豬卵母細胞的紡錘體結構和微絲分布具有明顯的毒性損傷作用。ZHAO等[32]研究發(fā)現(xiàn)FB1處理可破壞和解聚人臍靜脈內皮細胞的細胞骨架結構，并改變微絲結合蛋白的mRNA表達。這些研究表明FB1可通過損傷細胞骨架系統(tǒng)進而影響細胞周期進程。細胞內的能量需求以及微管、微絲等細胞器的遷移都與線粒體密切相關，線粒體功能對于卵母細胞成熟分裂和早期胚胎發(fā)育至關重要，而線粒體膜電位是線粒體活性的重要指標，在ATP產(chǎn)生、氧化還原平衡、信號轉導和代謝過程中起著重要作用[33-34]。研究表明發(fā)育潛能越好的卵母細胞，線粒體膜電位值越高[35]。最新研究表明線粒體是FB1的重要分子靶點，誘導線粒體功能障礙是FB1毒性的一個重要作用機制[36]。ARUMUGAM等[37]在人肝癌（HepG2）細胞上的一項研究發(fā)現(xiàn)FB1處理HepG2細胞24 h后，導致線粒體膜電位顯著降低。為了進一步研究FB1潛在的毒性作用機制，我們檢測了FB1對豬卵母細胞線粒體功能的影響。結果表明，F(xiàn)B1處理后，卵母細胞線粒體膜電位顯著下降，提示FB1處理導致卵母細胞線粒體受損。

3.2 FB1對豬卵母細胞潛在的毒性作用機制

細胞凋亡是卵母細胞和胚胎質量的重要評估參數(shù)[38]。已有研究表明，線粒體在細胞凋亡中發(fā)揮核心作用，其膜電位的下降是細胞早期凋亡的標志性事件[20, 34]。多項研究表明FB1處理可誘導不同細胞系發(fā)生凋亡[13, 39-42]。通過Annexin-V染色，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)FB1處理后大量卵母細胞發(fā)生早期凋亡。促凋亡因子BAX和抑凋亡因子BCL2在調控凋亡中發(fā)揮重要作用，在線粒體介導的凋亡通路中，異常的細胞內信號導致BAX的激活，抑制BCL2的表達，誘導線粒體釋放細胞色素C，形成凋亡小體或啟動CASPASE級聯(lián)激活，導致凋亡發(fā)生[34, 43]。為進一步驗證FB1對豬卵母細胞的毒性作用機制是否與線粒體介導的凋亡有關，我們對FB1處理后卵母細胞BAX和BCL2的蛋白表達進行了檢測分析，結果發(fā)現(xiàn)，BAX蛋白表達顯著上升，而BCL2蛋白表達顯著下降，這些結果進一步表明FB1處理致使卵母細胞發(fā)生凋亡，這可能是FB1誘導卵母細胞毒性損傷的又一重要作用機制。

自噬是細胞中錯誤折疊蛋白和受損細胞器的降解過程，在多種生理過程中發(fā)揮著重要作用。正常生理狀態(tài)下，細胞的自噬能力處于基礎水平，當細胞處于應激狀態(tài)時，如能量缺乏、病原體感染或是暴露于不良環(huán)境中時，自噬水平會被迅速誘導升高以回收細胞質物質來生產(chǎn)能量，其中，自噬調節(jié)細胞死亡是自噬最重要的功能之一[44]。已有研究表明過度或長期的自噬可引發(fā)細胞毒性作用[45]。YIN等和ZHANG等[39-40]研究發(fā)現(xiàn)FB1處理可通過激活自噬誘導MARC-145腎細胞和玉米螟昆蟲血細胞自噬性細胞死亡。本研究結果顯示FB1處理組卵母細胞LC3A/B的熒光強度顯著升高，LC3A/B II的蛋白表達水平升高，提示卵母細胞自噬水平顯著升高。綜合以上結果表明FB1還可通過誘導細胞發(fā)生自噬，導致豬卵母細胞體外成熟失敗。

4 結論

本研究結果證明伏馬毒素B1處理可擾亂減數(shù)分裂周期進程，破壞細胞骨架和線粒體功能致使第一極體排出失敗，最終導致卵母細胞成熟受到抑制。伏馬毒素B1對豬卵母細胞的毒性損傷作用機制與誘導細胞凋亡與自噬密切相關。本研究結果為深入了解伏馬毒素B1的生殖毒性作用及其機制提供了試驗依據(jù)，也為臨床上有效防治伏馬毒素B1的生殖毒性損傷提供了理論參考。

[1] KAMLE M, MAHATO D K, DEVI S, LEE K E, KANG S G, KUMAR P.Fumonisins: impact on agriculture, food, and human health and their management strategies.Toxins, 2019, 11(6): 328.doi:10.3390/toxins11060328.

[2] RHEEDER J P, MARASAS W F O, VISMER H F.Production of fumonisin analogs byspecies.Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(5): 2101-2105.doi:10.1128/AEM.68.5.2101- 2105.2002.

[3] ARUMUGAM T, GHAZI T, CHUTURGOON A.Fumonisin B1epigenetically regulates PTEN expression and modulates DNA damage checkpoint regulation in HepG2 liver cells.Toxins, 2020, 12(10): 625.doi:10.3390/toxins12100625.

[4] STOEV S D, GUNDASHEVA D, ZARKOV I, MIRCHEVA T, ZAPRYANOVA D, DENEV S, MITEV Y, DASKALOV H, DUTTON M, MWANZA M, SCHNEIDER Y J.Experimental mycotoxic nephropathy in pigs provoked by a mouldy diet containing ochratoxin A and fumonisin B1.Experimental and Toxicologic Pathology, 2012, 64(7/8): 733-741.doi:10.1016/j.etp.2011.01.008.

[5] STOCKMANN-JUVALA H, ALENIUS H, SAVOLAINEN K.Effects of fumonisin B(1) on the expression of cytokines and chemokines in human dendritic cells.Food and Chemical Toxicology, 2008, 46(5): 1444-1451.doi:10.1016/j.fct.2007.12.004.

[6] Domijan A M.Fumonisin B(1): a neurotoxic mycotoxin.Arhiv za higijenu rada i toksikologiju.2012，63(4): 531-544.doi: 10.2478/ 10004-1254-63-2012-2239.

[7] GBORE F A.Brain and hypophyseal acetylcholinesterase activity of pubertal boars fed dietary fumonisin B1.Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 2010, 94(5): e123-e129.doi:10.1111/j.1439-0396.2010.00992.x.

[8] LUMSANGKUL C, CHIANG H I, LO N W, FAN Y K, JU J C.Developmental toxicity of mycotoxin fumonisin B1in animal embryogenesis: an overview.Toxins, 2019, 11(2): 114.doi:10.3390/ toxins11020114.

[9] SUN G J, WANG S K, HU X, SU J J, HUANG T R, YU J H, TANG L L, GAO W M, WANG J S.Fumonisin B1contamination of home- grown corn in high-risk areas for esophageal and liver cancer in China.Food Additives & Contaminants, 2007, 24(2): 181-185.doi:10.1080/ 02652030601013471.

[10] LIU X Y, FAN L H, YIN S T, CHEN H, HU H B.Molecular mechanisms of fumonisin B1-induced toxicities and its applications in the mechanism-based interventions.Toxicon, 2019, 167: 1-5.doi:10.1016/j.toxicon.2019.06.009.

[11] DESAI K N, SULLARDS M C, ALLEGOOD J, WANG E, SCHMELZ E M, HARTL M, HUMPF H U, LIOTTA D C, PENG Q, MERRILL A H Jr.Fumonisins and fumonisin analogs as inhibitors of ceramide synthase and inducers of apoptosis.Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids, 2002, 1585(2/3): 188-192.doi:10.1016/S1388-1981(02)00340-2.

[12] STOCKMANN-JUVALA H, MIKKOLA J, NAARALA J, LOIKKANEN J, ELOVAARA E, SAVOLAINEN K.Oxidative stress induced by fumonisin B1 in continuous human and rodent neural cell cultures.Free Radical Research, 2004, 38(9): 933-942.doi:10.1080/ 10715760412331273205.

[13] KIM S H, SINGH M P, SHARMA C, KANG S C.Fumonisin B1actuates oxidative stress-associated colonic damage via apoptosis and autophagy activation in murine model.Journal of Biochemical and Molecular Toxicology, 2018, 32(7): e22161.doi:10.1002/jbt.22161.

[14] GBORE F A.Reproductive organ weights and semen quality of pubertal boars fed dietary fumonisin B1.Animal, 2009, 3(8): 1133-1137.doi:10.1017/S1751731109004467.

[15] HENRY M H, WYATT R D.The toxicity of fumonisin B1, B2, and B3, individually and in combination, in chicken embryos.Poultry Science, 2001, 80(4): 401-407.doi:10.1093/ps/80.4.401.

[16] CORTINOVIS C, PIZZO F, SPICER L J, CALONI F.mycotoxins: effects on reproductive function in domestic animals—A review.Theriogenology, 2013, 80(6): 557-564.doi:10.1016/j.theriogenology.2013.06.018.

[17] 郭雋, 張立實, 彭雙清.鐮刀菌毒素生殖發(fā)育毒性研究進展.中國食品衛(wèi)生雜志, 2013(5): 474-478.

GUO J, ZHANG L S, PENG S Q.Review of reproductive and developmental toxicity studies oftoxins.Chinese Journal of Food Hygiene, 2013(5): 474-478.(in Chinese)

[18] SOMOSK?I B, KOVáCS M, CSEH S.Effects of T-2 and Fumonisin B1 combined treatment onmouse embryo development and blastocyst quality.Toxicology and Industrial Health, 2018, 34(5): 353-360.doi:10.1177/0748233718764039.

[19] CORTINOVIS C, CALONI F, SCHREIBER N B, SPICER L J.Effects of fumonisin B1 alone and combined with deoxynivalenol or Zearalenone on porcine granulosa cell proliferation and steroid production.Theriogenology, 2014, 81(8): 1042-1049.doi:10.1016/j.theriogenology.2014.01.027.

[20] SHI F Y, LI W H, ZHAO H Y, HE Y J, JIANG Y, NI J, ABBASI B, RUI R, JU S Q.Microcystin-LR exposure results in aberrant spindles and induces apoptosis in porcine oocytes.Theriogenology, 2020, 158: 358-367.doi:10.1016/j.theriogenology.2020.09.031.

[21] CUI P P, ABBASI B, LIN D F, RUI R, JU S Q.Aurora A inhibition disrupts chromosome condensation and spindle assembly during the first embryonic division in pigs.Reproduction in Domestic Animals, 2020, 55(5): 584-593.doi:10.1111/rda.13655.

[22] YANG C X, WANG P C, LIU S, MIAO J K, LIU X M, MIAO Y L, DU Z Q.Long noncoding RNA 2193 regulates meiosis through global epigenetic modification and cytoskeleton organization in pig oocytes.Journal of Cellular Physiology, 2020, 235(11): 8304-8318.doi:10.1002/jcp.29675.

[23] DING Z M, AHMAD M J, MENG F, CHEN F, WANG Y S, ZHAO X Z, ZHANG S X, MIAO Y L, XIONG J J, HUO L J.Triclocarban exposure affects mouse oocytematuration through inducing mitochondrial dysfunction and oxidative stress.Environmental Pollution, 2020, 262: 114271.doi:10.1016/j.envpol.2020.114271.

[24] MAN W R, GU J, WANG B, ZHANG M M, HU J Q, LIN J, SUN D, XIONG Z Y, GU X M, HAO K K, GUO B L, WEI G L, ZHANG L, SONG R, LI C Y, WANG H C, SUN D D.SHANK3co-ordinately regulates autophagy and apoptosis in myocardial infarction.Frontiers in Physiology, 2020, 11: 1082.doi:10.3389/fphys.2020.01082.

[25] REYES J M, ROSS P J.Cytoplasmic polyadenylation in mammalian oocyte maturation.Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA, 2016, 7(1): 71-89.doi:10.1002/wrna.1316.

[26] 黃向月, 熊顯榮, 韓杰, 楊顯英, 王艷, 王斌, 李鍵.KDM1A在牦牛卵泡發(fā)育過程中的表達.中國農(nóng)業(yè)科學, 2019, 52(24): 4624-4631.doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.24.016.

HUANG X Y, XIONG X R, HAN J, YANG X Y, WANG Y, WANG B, LI J.Expression pattern of KDM1A in the development of yak follicles.Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(24): 4624-4631.doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.24.016.(in Chinese)

[27] BRUNET S, MARO B.Cytoskeleton and cell cycle control during meiotic maturation of the mouse oocyte: integrating time and space.Reproduction (Cambridge, England), 2005, 130(6): 801-811.doi:10.1530/rep.1.00364.

[28] ZHANG H, ZHANG L Y, DIAO X, LI N, LIU C L.Toxicity of the mycotoxin fumonisin B1on the insect Sf9 cell line.Toxicon, 2017, 129: 20-27.doi:10.1016/j.toxicon.2017.01.018.

[29] MARIN D E, GOUZE M E, TARANU I, OSWALD I P.Fumonisin B1 alters cell cycle progression and interleukin-2 synthesis in swine peripheral blood mononuclear cells.Molecular Nutrition & Food Research, 2007, 51(11): 1406-1412.doi:10.1002/mnfr.200700131.

[30] 秦偉森.伏馬菌素FB1對人臍靜脈血管內皮細胞的毒性作用研究[D].廣州: 華南農(nóng)業(yè)大學, 2016.

QIN W S.Cellular and relevant factors of toxicity of fumonisin B1in human umbilical vein endothelial cells[D].Guangzhou: South China Agricultural University, 2016.(in Chinese)

[31] SUN S C, KIM N H.Molecular mechanisms of asymmetric division in oocytes.Microscopy and Microanalysis, 2013, 19(4): 883-897.doi:10.1017/S1431927613001566.

[32] ZHAO X, WANG Y, LIU J L, ZHANG J H, ZHANG S C, OUYANG Y, HUANG J T, PENG X Y, ZENG Z, HU Z Q.Fumonisin B1affects the biophysical properties, migration and cytoskeletal structure of human umbilical vein endothelial cells.Cell Biochemistry and Biophysics, 2020, 78(3): 375-382.doi:10.1007/s12013-020-00923-4.

[33] AL-ZUBAIDI U, LIU J, CINAR O, ROBKER R L, ADHIKARI D, CARROLL J.The spatio-temporal dynamics of mitochondrial membrane potential during oocyte maturation.Molecular Human Reproduction, 2019, 25(11): 695-705.doi:10.1093/molehr/gaz055.

[34] BOCK F J, TAIT S W G.Mitochondria as multifaceted regulators of cell death.Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2020, 21 (2): 85-100.doi:10.1038/s41580-019-0173-8.

[35] TARAZONA A, RODRíGUEZ J, RESTREPO L, OLIVERA-ANGEL M.Mitochondrial activity, distribution and segregation in bovine oocytes and in embryos produced.Reproduction in Domestic Animals, 2006, 41(1): 5-11.doi:10.1111/j.1439-0531.2006.00615.x.

[36] SHEIK ABDUL N, MARNEWICK J L.Fumonisin B1-induced mitochondrial toxicity and hepatoprotective potential of rooibos: an update.Journal of Applied Toxicology, 2020, 40(12): 1602-1613.doi:10.1002/jat.4036.

[37] ARUMUGAM T, PILLAY Y, GHAZI T, NAGIAH S, ABDUL N S, CHUTURGOON A A.Fumonisin B1-induced oxidative stress triggers Nrf2-mediated antioxidant response in human hepatocellular carcinoma (HepG2) cells.Mycotoxin Research, 2019, 35(1): 99-109.doi:10.1007/s12550-018-0335-0.

[38] 潘陽陽, 李秦, 崔燕, 樊江峰, 楊琨, 何俊峰, 余四九.EGF、EGFR在牦牛卵母細胞中的表達及對胚胎發(fā)育能力的作用.中國農(nóng)業(yè)科學, 2015, 48(12): 2439-2448.doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.017.

PAN Y Y, LI Q, CUI Y, FAN J F, YANG K, HE J F, YU S J.The expression of EGF and EGFR in yak oocyte and its function on development competence of embryo.Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(12): 2439-2448.doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.017.(in Chinese)

[39] YIN S T, GUO X, LI J H, FAN L H, HU H B.Fumonisin B1induces autophagic cell death via activation of ERN1-MAPK8/9/10 pathway in monkey kidney MARC-145 cells.Archives of Toxicology, 2016, 90(4): 985-996.doi:10.1007/s00204-015-1514-9.

[40] ZHANG H, DIAO X, LI N, LIU C L.FB1-induced programmed cell death in hemocytes of.Toxicon, 2018, 146: 114-119.doi:10.1016/j.toxicon.2018.02.052.

[41] KHAN R B, PHULUKDAREE A, CHUTURGOON A A.Fumonisin B1induces oxidative stress in oesophageal (SNO) cancer cells.Toxicon, 2018, 141: 104-111.doi:10.1016/j.toxicon.2017.12.041.

[42] CHEN J, YANG S H, HUANG S, YAN R, WANG M Y, CHEN S, CAI J, LONG M, LI P.Transcriptome study reveals apoptosis of porcine kidney cells induced by fumonisin B1via TNF signalling pathway.Food and Chemical Toxicology, 2020, 139: 111274.doi:10.1016/j.fct.2020.111274.

[43] D'ORSI B, MATEYKA J, PREHN J H M.Control of mitochondrial physiology and cell death by the Bcl-2 family proteins Bax and Bok.Neurochemistry International, 2017, 109: 162-170.doi:10.1016/j.neuint.2017.03.010.

[44] DENTON D, XU T Q, KUMAR S.Autophagy as a pro-death pathway.Immunology and Cell Biology, 2015, 93(1): 35-42.doi:10.1038/icb.2014.85.

[45] FULDA S, K?GEL D.Cell death by autophagy: emerging molecular mechanisms and implications for cancer therapy.Oncogene, 2015, 34 (40): 5105-5113.doi:10.1038/onc.2014.458.

Effects of FB1on Apoptosis and Autophagy of Porcine OocytesMaturation

LI WenHui, HE YiJing, JIANG Yao, ZHAO HongYu, PENG Lei, LI Jia, RUI Rong, JU ShiQiang*

College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095

【Objective】The purpose of this study was to investigate the effects of fumonisin B1(FB1) on porcine oocytematuration and its potential mechanism, so as to provide the theoretical reference for effective prevention and treatment of reproductive toxicity injury caused by FB1in the clinic.【Method】Porcine cumulus oocyte complexes (COCs) were collected and randomly divided into groups, and treated with different concentrations of FB1(0, 10, 20 and 30 μg·mL-1) for 44 h duringmaturation, respectively.Then, the first polar body (PB1) extrusion and embryo development after activation of oocytes were analyzed, and the effects of FB1on meiotic progression and cytoskeleton structure of oocytes were further detected by immunofluorescence staining and combined with confocal microscopy.In order to further explore the mechanism of FB1on toxic injury of porcine oocytes, the JC-1, Annexin V-FITC and LC3A/B fluorescence staining were used to detect mitochondrial function, early apoptosis and autophagy levels in oocytes, respectively.On this basis, the expression of apoptosis/autophagy related to proteins were further analyzed by Western blotting.【Result】FB1treatment had significant inhibitory effects on oocyte maturation, while PB1 extrusion rate decreased in a concentration-dependent manner.When the concentration of FB1reached more than 20 μg·mL-1, the PB1 extrusion was significantly decreased (＜0.01), and the cleavage rate and blastocyst rate of the embryos after oocytes parthenogenetic activation were significantly decreased (＜0.01),damaging the development potential of oocytes to a certain extent.And the cell cycle analysis showed that FB1treatment also disordered the meiotic cycle progression, resulting in a significant increase in the proportion of oocytes that arrested at germinal vesicle breakdown (GVBD) (＜0.01), and a significant decrease in the proportion of oocytes that successfully developed to the Metaphase II (MII) (＜0.01), with an increase in spindle abnormal rate (＜0.01) and a decrease in actin distribution at the plasma membrane (＜0.05).Further studies showed that, compared with control group, the mitochondrial membrane potential was significantly decreased (＜0.05), impairing mitochondrial function.At the same time, the rate of early apoptosis was obviously increased (＜0.01), and the level of autophagy was also significantly increased (＜0.01) in FB1-treated oocytes.Western blotting analysis showed that the expressions of pro-apoptotic protein BAX and autophagy protein LC3A/B II in FB1-treated oocytes were significantly up-regulated (＜0.05), and the expression of anti-apoptotic protein BCL2 was significantly down-regulated (＜0.05), indicating the occurrence of early apoptosis and autophagy.【Conclusion】FB1had obvious toxic effects on porcine oocyte maturationand embryo development after activation, resulting in meiotic cycle arrest, spindle structure disorder, actin distribution reduction and mitochondrial injury, and its toxic mechanism might be related to the induction of apoptosis and autophagy in oocytes.

porcine oocytes; fumonisin B1; cytoskeleton; apoptosis; autophagy

2021-01-29；

2021-06-17

國家自然科學基金（31972759，31572589）、南京農(nóng)業(yè)大學2019年大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練專項計劃（S20190021）、南京農(nóng)業(yè)大學“課程思政”示范項目（KCSZ2020044）

李文慧，E-mail：1065167020@qq.com。通信作者劇世強，E-mail：jusq@njau.edu.cn

（責任編輯 林鑒非）