棗R2R3-MYB亞家族基因鑒定及其在果實(shí)發(fā)育中的表達(dá)分析

李世佳，呂紫敬，趙錦

棗R2R3-MYB亞家族基因鑒定及其在果實(shí)發(fā)育中的表達(dá)分析

李世佳，呂紫敬，趙錦*

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071000

【目的】MYB作為植物中最大的基因家族之一，在植物生長(zhǎng)、果實(shí)發(fā)育等方面具有重要作用。本研究擬鑒定棗R2R3-MYB亞家族成員，并進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析，為深入探究該類(lèi)基因在棗生長(zhǎng)發(fā)育尤其是果實(shí)發(fā)育中的功能提供參考?！痉椒ā恳詳M南芥R2R3-MYB亞家族成員為探針，利用BLAST和HMMER方法，在棗全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選R2R3-MYB亞家族成員；利用植物轉(zhuǎn)錄因子、UniProt、Gcorn plant等數(shù)據(jù)庫(kù)，采用MEGA-x、ExPASy、TBtools、PheatMap等軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析；利用轉(zhuǎn)錄組和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析該類(lèi)基因的表達(dá)，對(duì)重點(diǎn)基因進(jìn)行互作蛋白的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證。【結(jié)果】在棗全基因組范圍內(nèi)，鑒定出118個(gè)R2R3-MYB亞家族成員，均具有典型的MYB超家族結(jié)構(gòu)域，分為18個(gè)亞組，依次命名為—。理化性質(zhì)分析表明，該家族基因編碼的氨基酸數(shù)目介于200—400；95個(gè)成員定位到12條染色體上，其中4號(hào)染色體上分布最多；譜系分析表明該類(lèi)基因進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了直系和旁系同源事件。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)一些R2R3-MYB基因參與棗果實(shí)的發(fā)育過(guò)程，并進(jìn)一步篩選出了可能與果實(shí)膨大和色澤發(fā)育相關(guān)的候選基因、。并利用蛋白互作預(yù)測(cè)和酵母雙雜試驗(yàn)證明ZjMYB104和ZjMPK3存在互作?！窘Y(jié)論】鑒定出118個(gè)棗R2R3-MYB亞家族成員，結(jié)構(gòu)高度保守，分布在12條染色體上，在進(jìn)化中發(fā)生了直系和旁系同源事件，并篩選出了與果實(shí)發(fā)育密切相關(guān)的候選基因，為進(jìn)一步的功能分析提供了線(xiàn)索和參考。

棗；R2R3-MYB亞家族基因；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析；果實(shí)發(fā)育；蛋白互作

0 引言

【研究意義】v-myb禽成髓細(xì)胞瘤病毒致癌基因同源物（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog，MYB）轉(zhuǎn)錄因子家族作為植物中最大的基因家族之一[1-2]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝及抗逆脅迫等方面中具有重要作用[3]。R2R3-MYB作為MYB家族中成員最多的一類(lèi)[4-6]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演著重要角色[7]，鑒定并研究其參與的調(diào)控代謝有重要意義。棗（Mill.）屬于鼠李科棗屬植物，原產(chǎn)于中國(guó)，產(chǎn)量居干果第一位[8]，鑒定棗R2R3-MYB基因可為研究該類(lèi)基因在棗生長(zhǎng)發(fā)育中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，分析該類(lèi)基因在果實(shí)發(fā)育中的表達(dá)模式將為深入探究其調(diào)控機(jī)制提供線(xiàn)索?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，在擬南芥[9]、茄科植物[10]、梨[11]、蘋(píng)果[12]、水稻[13]和楊樹(shù)[14]等基因組中均鑒定出了MYB家族成員，均以R2R3-MYB亞家族成員數(shù)目最多。研究發(fā)現(xiàn)R2R3-MYB亞家族不僅參與植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、抗逆脅迫等生理生化活動(dòng)，而且與果實(shí)膨大、著色等果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)[15-16]。葡萄和調(diào)控下游、和的轉(zhuǎn)錄活性，影響葡萄果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育[17]。梨的啟動(dòng)子甲基化抑制的表達(dá)和花青苷的生物合成，從而影響梨果皮著色過(guò)程[18]。草莓中MYB基因隨果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育，表達(dá)量逐漸增加[19]；同時(shí)，的變異等位基因，作為一個(gè)提前的終止密碼子，編碼蛋白的C-末端，導(dǎo)致草莓果實(shí)白化[20]。蘋(píng)果中的啟動(dòng)子中微衛(wèi)星的插入導(dǎo)致蘋(píng)果果肉發(fā)育為紅色[21]。2019年，Ji等[22]已鑒定出171個(gè)棗MYB基因家族成員，其中，99個(gè)棗R2R3-MYB亞家族成員。【本研究切入點(diǎn)】雖然棗MYB基因家族已有報(bào)道，但還未見(jiàn)針對(duì)R2R3-MYB亞家族的研究，且該亞家族成員與果實(shí)發(fā)育的關(guān)系尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】鑒定棗R2R3-MYB亞家族成員，對(duì)其理化性質(zhì)、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及保守基序進(jìn)行分析，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析該類(lèi)基因在棗果發(fā)育中的表達(dá)，并利用酵母雙雜技術(shù)驗(yàn)證互作蛋白，為開(kāi)展該類(lèi)基因的功能分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行。

1.1 棗R2R3-MYB亞家族基因的生物信息學(xué)分析

1.1.1 棗R2R3-MYB亞家族成員的鑒定 利用冬棗全基因組數(shù)據(jù)信息（JREP00000000.1），并以擬南芥R2R3-MYB亞家族成員為探針，基于局部比對(duì)算法的搜索工具（basic local alignment search tool，Blast）及HMMER（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/ hmmsearch）網(wǎng)站中馬爾科夫概率模型的方法，分別利用蛋白序列層次的相似性和蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)哟蔚耐葱?，在棗全基因組信息中搜索。將兩個(gè)來(lái)源的序列結(jié)果用植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)（Plant Transcription Factor Database，http://planttfdb.gao-lab.org/index.php）和UniProt庫(kù)（UniProt Knowledgebase，UniProtKB，https:// www.uniprot.org/）信息進(jìn)行矯正，并刪除重復(fù)及預(yù)測(cè)錯(cuò)誤序列，最終得到該亞家族成員蛋白序列，根據(jù)其染色體位置信息重新命名。同時(shí)，使用ExPASy在線(xiàn)分析軟件（https://web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測(cè)鑒定得到的蛋白等電點(diǎn)和分子量。

1.1.2 棗R2R3-MYB亞家族基因染色體定位及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 根據(jù)棗R2R3-MYB亞家族的染色體定位信息，利用TBtools工具[23]中的Gene Location Visualize功能繪制染色體定位圖。利用MEGA-X軟件，采用最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，并設(shè)置校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap重復(fù)1 000次，位點(diǎn)覆蓋范圍設(shè)置為80%。

1.1.3 棗R2R3-MYB蛋白的同源域比對(duì)、保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析 使用NCBI中CD-Search功能對(duì)棗R2R3-MYB蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對(duì)分析。用在線(xiàn)軟件MEME（http://meme-suite.org/）鑒定蛋白序列的保守基序，最大基序數(shù)量設(shè)置為10，其他參數(shù)保留默認(rèn)值。棗R2R3-MYB亞家族成員的基因結(jié)構(gòu)信息來(lái)自其基因結(jié)構(gòu)注釋文件。

1.1.4 棗R2R3-MYB重點(diǎn)基因的譜系及進(jìn)化分析 使用Gcorn植物（Gcorn plant）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.plant.osakafu-u.ac.jp/～kagiana/gcorn/p/），對(duì)棗R2R3-MYB重點(diǎn)基因進(jìn)行譜系分析，得到相應(yīng)基因的同源性信息以及進(jìn)化信息。

1.2 棗R2R3-MYB基因在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式分析

選取兩個(gè)主栽品種‘金絲小棗’和‘金魁王’為試材，采樣地點(diǎn)為河北滄縣棗樹(shù)資源圃。采樣時(shí)期將棗果從幼果到全紅分為9個(gè)時(shí)期：S1—S9，即幼果期1、幼果期2、硬核前期、硬核期、白熟期、白熟后期、1/4著色期、半紅期、全紅期，每個(gè)時(shí)期設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，采用TaKaRa Mini BEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒提取各時(shí)期樣本的RNA，微型分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，質(zhì)量合格的RNA備用。在Illumina HiSeq 2000高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，使用PheatMap繪制表達(dá)熱圖。

選擇‘金絲小棗’5個(gè)果實(shí)發(fā)育時(shí)期，幼果期、白熟前、白熟期、半紅期以及全紅期進(jìn)行代表基因和的表達(dá)驗(yàn)證取0.5 μg RNA，采用TIANGEN Fastk gDNA Dispelling RT Super Mix試劑盒合成cDNA。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒以cDNA為模板進(jìn)行表達(dá)分析。內(nèi)參基因及引物序列見(jiàn)表1。20 μL反應(yīng)體系：1 μL稀釋cDNA模板，上、下游引物各0.4 μL，Power SYBR ? Green PCR Master Mix（2×）10 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性15min；40個(gè)循環(huán)（95℃ 10s, 60℃ 20 s）。每樣品設(shè)4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分析熒光值變化曲線(xiàn)及熔解曲線(xiàn)，采用2-??CT計(jì)算表達(dá)水平。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物名稱(chēng)及序列

1.3 互作蛋白的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

利用STRING（https://string-db.org/）網(wǎng)站，以擬南芥相應(yīng)的同源蛋白為參考，對(duì)候選蛋白ZjMYB104進(jìn)行互作蛋白預(yù)測(cè)分析。同時(shí)，設(shè)計(jì)酵母雙雜交引物（表2），擴(kuò)增和全長(zhǎng)，連接pMD18-T克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，篩選得到陽(yáng)性克隆。經(jīng)測(cè)序比對(duì)后，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行酶切、連接，構(gòu)建AD+ZjMYB104::BD、AD+ZjMPK3::BD、ZjMYB104::AD+ZjMPK3::BD、ZjMYB104:: BD+ ZjMPK3:: AD的重組載體。利用LiAc法將重組載體質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，按1、10-1、10-2濃度梯度培養(yǎng)在三缺選擇性培養(yǎng)基（-Leu-Trp-His）中，觀(guān)察結(jié)果。

表2 酵母雙雜交引物名稱(chēng)及序列

2 結(jié)果

2.1 棗R2R3-MYB亞家族成員的鑒定

在棗基因組中共鑒定出118個(gè)R2R3-MYB亞家族成員，參考Ralf等的分類(lèi)方法[3]，將該亞家族進(jìn)一步分為18個(gè)亞組，參考染色體定位結(jié)果，分別命名為—（表3）。理化性質(zhì)分析表明，該亞家族成員編碼蛋白的大小和氨基酸數(shù)目差異很大，最小的蛋白ZjMYB25由160個(gè)氨基酸組成；最大的ZjMYB113由671個(gè)氨基酸組成，氨基酸數(shù)目處于200—400 aa的蛋白共89個(gè)，占比75.42%。該亞家族含有51個(gè)酸性蛋白（pH<6.5），20個(gè)中性蛋白（pH 6.5—7.5），47個(gè)堿性蛋白（pH>7.5），表明該家族蛋白功能具有多樣性。

與Ji等[22]前期研究結(jié)果相比，本研究新鑒定出21個(gè)R2R3-MYB亞家族成員，并發(fā)現(xiàn)之前鑒定的（LOC107415212）、（LOC107420595）兩個(gè)基因不具有典型的R2R3-MYB結(jié)構(gòu)域，因而被剔除。

2.2 棗R2R3-MYB亞家族成員的染色體分布

根據(jù)棗全基因組注釋信息，利用TBtools軟件繪制棗R2R3-MYB基因的染色體定位圖。將95個(gè)棗R2R3-MYB基因定位到12條染色體上（圖1），其中，4號(hào)染色體上分布最多，有14個(gè)成員（—），占基因總數(shù)的14.74%；而9號(hào)染色體上成員分布最少，僅含有4個(gè)基因（），占4.21%。同時(shí)，該家族基因在Chr1、Chr3、Chr4和Chr8上呈簇狀分布，可能與該亞家族基因的擴(kuò)張以及功能分化相關(guān)。

2.3 棗R2R3-MYB亞家族成員進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用棗R2R3-MYB亞家族成員構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2），根據(jù)蛋白序列相似性，分為18個(gè)亞組（I—XVIII）。根據(jù)基因組進(jìn)化分析，桃與棗具有較近的親緣關(guān)系[8]，本研究進(jìn)一步構(gòu)建了棗與桃R2R3-MYB亞家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，也分為18個(gè)亞組（圖3），與圖2分組結(jié)果基本一致，說(shuō)明該亞家族成員在不同物種間具有很好的保守性。

圖1 棗R2R3-MYB亞家族成員的染色體定位

表3 棗R2R3-MYB亞家族成員信息

續(xù)表3 Continued table 3

續(xù)表3 Continued table 3

圖2 棗R2R3-MYB亞家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

圖3 棗與桃R2R3-MYB亞家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

2.4 棗R2R3-MYB亞家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析

利用MEME在線(xiàn)分析軟件對(duì)棗R2R3-MYB編碼

蛋白進(jìn)行基序分析，設(shè)置最大發(fā)現(xiàn)基序數(shù)目為10，分析結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了棗R2R3-MYB亞家族間的進(jìn)化關(guān)系（圖4）。其中，motif 1和2為棗R2R3-MYB亞家族最保守的基序，除ZjMYB28ZjMYB117和ZjMYB118外，其他115個(gè)成員均含有這兩段保守基序。其次保守的基序?yàn)閙otif 3，除ZjMYB13、ZjMYB28、ZjMYB68、ZjMYB69、ZjMYB117和ZjMYB118等6個(gè)成員外，其他112個(gè)成員均含有該基序。值得注意的是，ZjMYB117和ZjMYB118均不具有以上保守的motif，但分析其同源結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它們均有典型的R2R3-MYB亞家族特征，因此最終歸為該亞家族。在該家族進(jìn)化中，motif 1、2和3結(jié)構(gòu)最為原始，可能具有最保守的功能，推測(cè)在此基礎(chǔ)上逐步進(jìn)化出其他基序，并形成了功能上的多樣化。

圖4 棗R2R3-MYB亞家族基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守基序及同源結(jié)構(gòu)域分析

蛋白同源結(jié)構(gòu)域序列特征分析發(fā)現(xiàn)，全部成員均具有一個(gè)十分保守的MYB超家族蛋白結(jié)構(gòu)域（PLN03091、PLN03212、REB1 superfamily或Myb_DNA-binding），這可能與該亞家族成員的生物學(xué)功能密切相關(guān)。118個(gè)亞家族成員中，9個(gè)成員具有1個(gè)外顯子（7.6%），16個(gè)成員具有2個(gè)外顯子（13.6%），75個(gè)成員具有3個(gè)外顯子（63.6%），12個(gè)成員具有4個(gè)外顯子（10.2%），6個(gè)成員具有更多的外顯子數(shù)目。多數(shù)成員具有3個(gè)外顯子，可能與該亞家族成員功能上的保守性相關(guān)。

綜上，無(wú)論是在保守基序、同源結(jié)構(gòu)域，還是基因結(jié)構(gòu)層面，棗R2R3-MYB亞家族成員間的特征都相對(duì)保守。但也有個(gè)別成員的基因結(jié)構(gòu)特征與其他成員存在較大差異，如和有13個(gè)外顯子，具備特殊的Alpha-man_mid superfamily結(jié)構(gòu)域以及更長(zhǎng)的氨基酸序列等，更多的外顯子數(shù)目為這兩個(gè)基因提供了更多的剪接可能，也說(shuō)明這兩個(gè)蛋白在功能上的多樣性和特殊性。

2.5 棗R2R3-MYB亞家族重點(diǎn)基因的譜系分析

選取上述6個(gè)代表性的棗R2R3-MYB成員進(jìn)行了譜系分析（圖5）。其中，棕色線(xiàn)表示隨進(jìn)化時(shí)間的變化具有不同HIs閾值的基因序列數(shù)量，藍(lán)色和綠色線(xiàn)分別表示包含這些基因的物種和科的數(shù)量。根據(jù)譜系折線(xiàn)圖中同源事件發(fā)生規(guī)律，將這6個(gè)成員分為兩組，第一組包括、、和，該組HI值在0.454—0.540，基因數(shù)和物種數(shù)都下降，說(shuō)明發(fā)生了直系同源事件；同時(shí)和HI值分別為0.498和0.482時(shí)，基因數(shù)量減少而物種數(shù)量沒(méi)有變化，表明發(fā)生了旁系同源事件。第二組包括和，該組在HI值為0.615和0.574時(shí)發(fā)生了直系同源事件。綜合看，該家族成員在進(jìn)化中，發(fā)生了直系和旁系同源事件。

圖5 6個(gè)棗R2R3-MYB基因譜系分析

2.6 棗R2R3-MYB基因在棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式分析

以‘金絲小棗’和‘金魁王’兩個(gè)品種不同發(fā)育時(shí)期的棗果（圖6-A）為材料，轉(zhuǎn)錄組分析篩選出有明顯差異表達(dá)的14個(gè)R2R3-MYB亞家族基因（圖6-B），這些基因在兩個(gè)品種的果實(shí)發(fā)育中呈現(xiàn)基本一致的表達(dá)趨勢(shì)。

比較基因表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，總體上可以分為兩類(lèi)，第一類(lèi)基因表達(dá)模式為前期（S1—S4）上調(diào)表達(dá)，后期（S5—S9）表達(dá)明顯下降，如、等，表明此類(lèi)基因在果實(shí)發(fā)育前期發(fā)揮作用，可能參與果實(shí)膨大過(guò)程；第二類(lèi)基因的表達(dá)模式則相反，在果實(shí)發(fā)育前期表達(dá)量很低，后期逐漸上調(diào)，如、等，而后期是果實(shí)成熟過(guò)程，說(shuō)明這些基因可能與果實(shí)成熟有關(guān)。

進(jìn)一步的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，在‘金絲小棗’果實(shí)發(fā)育前期表達(dá)量相對(duì)較高（圖6-C）；而表達(dá)模式恰好相反（圖6-D），在果實(shí)發(fā)育后期表達(dá)量較高，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果一致，也說(shuō)明可能參與調(diào)控棗果后期成熟或色澤發(fā)育。

A：棗果不同發(fā)育時(shí)期；S1：幼果期1；S2：幼果期2；S3：硬核前期；S4：硬核期；S5：白熟期；S6：白熟后期；S7：1/4著色期；S8：半紅期；S9：全紅期。B：棗果不同發(fā)育時(shí)期中差異表達(dá)的R2R3-MYB基因；C：ZjMYB104在‘金絲小棗’果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)；D：ZjMYB59在‘金絲小棗’果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

2.7 ZjMYB104互作蛋白的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

選取ZjMYB104進(jìn)行蛋白互作預(yù)測(cè)（圖7-A），結(jié)果顯示，ZjMYB104與AtMYB44具有較高的同源性，AtMYB44和AtMPK3存在互作關(guān)系，推測(cè)ZjMYB104和ZjMPK3之間也能發(fā)生互作。酵母雙雜交試驗(yàn)（圖7-B）發(fā)現(xiàn)，重組載體AD+ZjMYB104::BD和AD+ ZjMPK3::BD在三缺培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，而ZjMYB104:: AD+ZjMPK3::BD、ZjMYB104::BD+ZjMPK3::AD在三缺培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)，說(shuō)明ZjMYB104和ZjMPK3確實(shí)能發(fā)生相互作用。

3 討論

3.1 R2R3-MYB亞家族基因在不同物種之間具有保守性

在棗基因組中，Ji等[22]鑒定到了99個(gè)R2R3-MYB亞家族成員，而本研究鑒定到118個(gè)該亞家族成員。近年來(lái)，陽(yáng)桃中鑒定到100個(gè)R2R3-MYB亞家族基因[24]；梨中發(fā)現(xiàn)185個(gè)R2R3-MYB亞家族基因[11]；梅花基因組中發(fā)現(xiàn)106個(gè)R2R3-MYB基因[25]。可以看出，棗、陽(yáng)桃、梅花中該亞家族基因數(shù)目相近，但梨中數(shù)目較多，猜測(cè)可能與梨物種經(jīng)歷兩次全基因組復(fù)制事件有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)棗R2R3-MYB亞家族基因結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，這與桃、梨、梅花中的研究結(jié)果一致，說(shuō)明該亞家族基因具有較高的系統(tǒng)發(fā)育相似性。

A：ZjMYB104互作蛋白預(yù)測(cè)；B：ZjMYB104和ZjMPK3酵母雙雜試驗(yàn)

3.2 ZjMYB基因可能參與棗果實(shí)著色過(guò)程

石倩倩[26]研究發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控棗果皮花青苷的合成調(diào)控；張瓊[27]的研究也表明2個(gè)MYB基因正向調(diào)控棗果皮著色過(guò)程。本研究結(jié)果表明，、、等基因在棗果實(shí)發(fā)育前期（即膨大期）高表達(dá)，而、、等基因在果實(shí)發(fā)育后期表達(dá)上升，推測(cè)這些基因可能參與棗果實(shí)的發(fā)育過(guò)程，這與之前的研究結(jié)果一致。有研究表明，果實(shí)發(fā)育前期即膨大過(guò)程主要涉及一系列黃酮類(lèi)化合物的產(chǎn)生[28]，梨控制查爾酮合成酶基因、黃酮醇合成酶基因的表達(dá)，正調(diào)控黃酮醇的含量[29]；桃能激活黃酮類(lèi)化合物合成途徑，促進(jìn)黃酮類(lèi)化合物積累[30]；將桃與棗R2R3-MYB基因進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與序列相似性達(dá)87%，而在棗果實(shí)發(fā)育前期高表達(dá)推測(cè)部分在棗果發(fā)育前期高表達(dá)的R2R3-MYB基因可能參與黃酮類(lèi)化合物的產(chǎn)生、調(diào)控果實(shí)膨大過(guò)程。后續(xù)可進(jìn)一步研究R2R3-MYB基因與果實(shí)膨大的關(guān)系。

在草莓研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)aMPK3作為信號(hào)傳遞蛋白激酶，與FaMYB10互作調(diào)控下游果實(shí)色素等代謝基因的表達(dá)情況以及花青素含量等生理指標(biāo)，超量表達(dá)加速草莓果實(shí)著色過(guò)程[31]。在番茄中，敲除使果實(shí)變紅提前，過(guò)表達(dá)發(fā)現(xiàn)果實(shí)變紅延后[32]。而本研究中，在果實(shí)發(fā)育后期表達(dá)上升，且能與ZjMPK3發(fā)生互作，推測(cè)可能也通過(guò)一定方式參與果實(shí)著色過(guò)程，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

鑒定出118個(gè)棗R2R3-MYB亞家族成員，其結(jié)構(gòu)高度保守，篩選出了與果實(shí)發(fā)育相關(guān)的基因、，且可能通過(guò)調(diào)控花青苷的合成來(lái)調(diào)節(jié)果實(shí)著色。ZjMYB104和ZjMPK3存在互作。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究R2R3-MYB亞家族基因在棗果實(shí)發(fā)育中的功能提供了重要的參考和線(xiàn)索。

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Identification of R2R3-MYB Subfamily in Chinese Jujube and Their Expression Pattern During the Fruit Development

LI ShiJia, Lü ZiJing, ZHAO Jin*

College of Life Sciences, Hebei Agricultural University, Baoding 071000, Hebei

【Objective】As one of the largest gene families in plants, MYB family plays an important role in plant growth and fruit development.This study would identify the members of the R2R3-MYB subfamily of Chinese jujube and analyze their bioinformatics and expression patterns, aiming to provide the reference for further exploring their function in jujube growth, especially in fruit development.【Method】The R2R3-MYB genes ofwere used as probes, and this subfamily members in the jujube genome were screened out by BLAST and HMMER.Based on the Plant Transcription Factors Database, Uniprot, Gcorn Plant and other databases, R2R3-MYB genes were analyzed by MEGA-X, ExPASy, TBtools, and PheatMap.Transcriptome data and real-time quantitative PCR (qRT-PCR) were used to evaluate the expression of these genes, and the interaction proteins of key candidate proteins were predicted and verified.【Result】In this study, 118 R2R3-MYB subfamily members were identified in jujube genome, all of which had a typical MYB domain.They were divided into 18 subgroups, named-.The number of amino acids encoded by the genes ranged from 200 to 400.Among them, 95 genes were located on 12 chromosomes, and which on Chr.4 was the most widely distributed.The phylogenetic analysis showed that orthologous and paralogous events occurred during the evolution of these genes.By transcriptomic and qRT-PCR analysis, some R2R3-MYB genes were involved in the fruit development. In particular,andmight participate in fruit enlargement and color development.Protein interaction prediction and yeast two-hybrid test confirmed that ZjMYB104 and ZjMPK3 were interacted each other.【Conclusion】118 members of the R2R3-MYB subfamily members were identified and distributed on 12 chromosomes.The structure of these subfamily members was highly conservative.The orthologous and paralogous events occurred in jujube genome evolution and the candidate genes closely related to fruit development were screened out.This study provided clues and references for further functional analysis of R2R3-MYB subfamily in jujube.

Chinese jujube; R2R3-MYB subfamily; bioinformatics analysis; expression analysis; fruit development; proteins interaction

2021-06-13；

2021-08-10

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD1000607）、河北農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目（s202010086002）

李世佳，E-mail：1193326557@qq.com。通信作者趙錦，E-mail：zhaojinbd@126.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）