查爾酮合成酶基因在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的作用

郭澤西，孫大運(yùn)，曲俊杰，潘鳳英，劉露露，尹玲

查爾酮合成酶基因在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的作用

郭澤西，孫大運(yùn)，曲俊杰，潘鳳英，劉露露，尹玲*

廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，南寧 530007

【目的】克隆不同抗性葡萄品種中查爾酮合成酶（chalcone synthase）基因，明確該基因在葡萄灰霉病菌（）和葡萄霜霉病菌（）侵染下的表達(dá)模式，并對(duì)CHS1進(jìn)行亞細(xì)胞定位和功能驗(yàn)證，為探究CHS1的廣譜抗病作用機(jī)理提供依據(jù)?！痉椒ā糠謩e以毛葡萄（）‘野釀二號(hào)’、歐亞種（）‘無(wú)核白’和山葡萄(）‘雙紅’葉片cDNA為模板，克隆，分析不同品種中CHS1的序列差異，并對(duì)CHS1蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析；利用qRT-PCR檢測(cè)不同葡萄品種受到灰霉病菌和霜霉病菌侵染后的表達(dá)模式；構(gòu)建表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，分別在煙草和‘無(wú)核白’組培苗葉片中進(jìn)行亞細(xì)胞定位和抗病功能驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】在不同葡萄品種中高度保守，ORF全長(zhǎng)均為1 182 bp，編碼393個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)編碼的蛋白分子量為42.92 kD，為穩(wěn)定的親水蛋白。受灰霉病菌侵染后，毛葡萄和歐亞種的表達(dá)模式變化類似，但灰霉病抗性品種‘野釀二號(hào)’中的表達(dá)水平整體顯著偏高；受霜霉病菌侵染后，山葡萄和歐亞種表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式變化，霜霉病抗性品種‘雙紅’中的表達(dá)量不斷增加，而的表達(dá)量逐漸下降。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，CHS1蛋白在細(xì)胞膜質(zhì)、細(xì)胞核中都有分布，但以細(xì)胞核定位為主。人工接種灰霉病菌和霜霉病菌后，與陰性對(duì)照相比，過(guò)表達(dá)VaCHS1的‘無(wú)核白’葉片具有更強(qiáng)的灰霉病和霜霉病抗性?！窘Y(jié)論】抗性品種中查爾酮合成酶基因的表達(dá)量比感病品種高，過(guò)表達(dá)CHS1能夠提高感病葡萄品種對(duì)灰霉病和霜霉病的抗性。

查爾酮合成酶；葡萄；灰霉病菌；霜霉病菌；抗病性

0 引言

【研究意義】葡萄是我國(guó)廣泛種植的果樹(shù)，其果實(shí)可以用來(lái)鮮食、釀酒、制干和制汁等，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。國(guó)家統(tǒng)計(jì)局統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2019年我國(guó)葡萄種植面積達(dá)到72.62萬(wàn)公頃，產(chǎn)量為1 419.54萬(wàn)噸。灰霉病和霜霉病是危害葡萄生長(zhǎng)比較嚴(yán)重的兩種病害，會(huì)造成果實(shí)品質(zhì)下降，嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至絕收。生產(chǎn)上主要采用化學(xué)藥劑防治灰霉病和霜霉病，普遍存在病原菌易產(chǎn)生抗藥性，增加生產(chǎn)成本并造成一定的環(huán)境問(wèn)題。因此，培育廣譜抗病優(yōu)質(zhì)葡萄品種是葡萄育種的重點(diǎn)。將抗病品種中的查爾酮合成酶（chalcone synthase）基因轉(zhuǎn)入感病品種，提高對(duì)灰霉菌和霜霉菌的抗性，了解在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的作用機(jī)制，可為廣譜抗病品種的培育提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】類黃酮（flavonoid）是一類低分子量多酚化合物的總稱，在植物受到病原菌侵染時(shí)類黃酮合成途徑被迅速激活，進(jìn)而起到防御作用。類黃酮不僅在植物自身生理生化方面具有重要作用，例如種子的顯色反應(yīng)、逆境的抵抗[1]、抗病害[2]和信號(hào)傳導(dǎo)[3]等，在臨床上還具有防癌[4]、抗氧化[5]、抗瘧疾和抗動(dòng)脈硬化等功能。查爾酮合成酶（CHS）是類黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶，也是限速酶。研究表明，在番茄[6]、亞麻[7]、小麥[8]、煙草[9]和蘋(píng)果[10]中過(guò)表達(dá)能夠增加對(duì)蟲(chóng)害和病原菌等環(huán)境脅迫的抗性，而在彩色棉中參與植株體內(nèi)和纖維中花青素的合成與累積，在纖維色澤形成中起著關(guān)鍵作用[11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前期本課題組通過(guò)對(duì)多個(gè)葡萄品種響應(yīng)不同病原菌侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)（XM_019224647.1）的表達(dá)量在不同抗性品種響應(yīng)葡萄灰霉病菌（）和葡萄霜霉病菌（）的侵染過(guò)程中均存在顯著差異，推測(cè)該基因可能與抗病相關(guān)；DAO等研究表明，植物在紫外線或病原菌等脅迫條件下會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)，從而導(dǎo)致類黃酮和異黃酮植物抗毒素的積累，并參與水楊酸防御途徑[12-13]。因此筆者推測(cè)CHS在葡萄的抗病過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從野生毛葡萄‘野釀二號(hào)’（cv.Yeniang-2）、歐洲葡萄‘無(wú)核白’（cv.Thompson Seedless）和山葡萄‘雙紅’（cv.Shuanghong）中克隆，分析其在不同品種中的序列差異和蛋白特征，并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)該基因受灰霉病菌和霜霉病菌侵染后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)差異，通過(guò)葉片瞬時(shí)表達(dá)明確該基因的亞細(xì)胞定位和抗性功能，為培育廣譜抗病的葡萄新品種提供新的思路和策略。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年在廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 野生毛葡萄‘野釀二號(hào)’由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院組培苗公司提供；歐洲葡萄‘無(wú)核白’和山葡萄‘雙紅’來(lái)自廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地。葡萄灰霉病菌由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所惠贈(zèng)。葡萄霜霉病菌由廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室葡萄分子設(shè)計(jì)育種團(tuán)隊(duì)分離保存。

本氏煙（）和葡萄組培苗均在光照16 h、黑暗8 h，25℃生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)。

1.1.2 試劑 植物總RNA提取試劑盒Spectrum Plant Total RNA Kit購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Takara（大連）公司；高保真DNA聚合酶2×Phanta Max Master Mix、感受態(tài)細(xì)胞Fast-T1和克隆試劑盒5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；膠回收試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit和質(zhì)粒小提試劑盒TIANprep Mini Plasmid Kit購(gòu)自天根生化科技有限公司；熒光定量試劑盒LightCycle 480 SYBR GreenⅠMaster購(gòu)自廣州聚研生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1的克隆 ‘野釀二號(hào)’‘無(wú)核白’和‘雙紅’葉片總RNA提取參照Spectrum Plant Total RNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)。參照TaKaRa公司的PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成。根據(jù)NCBI上的序列（登錄號(hào)：XM_019224647.1）設(shè)計(jì)特異引物CHS1-F和CHS1-R，引物序列見(jiàn)表1。以cDNA為模板，利用2×Phanta Max Master Mix試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃ 15 s，54℃ 15 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，參照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收。回收片段參照5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit試劑盒與T載體進(jìn)行連接，37℃，連接5 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Fast-T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。具體步驟參照Fast-T1的說(shuō)明書(shū)。挑取白斑，PCR檢測(cè)，檢測(cè)的引物為CHS1-F和通用引物M13-F。質(zhì)粒的提取步驟詳見(jiàn)TIANprep Mini Plasmid Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)。將質(zhì)粒送往上海生工公司測(cè)序。將測(cè)序的結(jié)果用軟件Vector NTI Explorer進(jìn)行序列的組裝，堿基序列和氨基酸序列的比對(duì)使用DNAMAN軟件，用蛋白質(zhì)系統(tǒng)分析工具（http://web.expasy.org/protparam/）分析CHS1蛋白的理化參數(shù)。

表1 本試驗(yàn)所用引物序列

1.2.2 病原菌培養(yǎng)及接種方法 葡萄霜霉病菌的培養(yǎng)和接種：取不同葡萄品種一年生枝條上第2—4位健康的完全伸展開(kāi)的幼嫩葉片，用無(wú)菌水清洗兩次，濾紙吸干葉片表面水分，用打孔器打取直徑為1或1.5 cm的葉盤，放入鋪有兩層濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行保濕。將實(shí)驗(yàn)室在‘赤霞’葉片上擴(kuò)繁的葡萄霜霉病菌配置成濃度為2×105/mL的孢子囊懸浮液，用移液器接種到‘野釀二號(hào)’‘無(wú)核白’和‘雙紅’的葉盤上，每個(gè)葉盤上接種35 μL。在抗性表型觀察試驗(yàn)中，每個(gè)品種接種12個(gè)葉盤。

葡萄灰霉菌病的培養(yǎng)和接種：在超凈工作臺(tái)上，將在PDA培養(yǎng)基上新活化的灰霉病菌作為接種試材。用滅過(guò)菌的打孔器在灰霉病菌菌落邊緣打下直徑0.5 cm菌塊。如霜霉病菌接種步驟中準(zhǔn)備的葉盤，葉盤中間用無(wú)菌牙簽刺一個(gè)小孔，將灰霉病菌菌塊倒扣在葉盤針刺處，使得菌絲與葉片接觸。在相對(duì)濕度90%，22℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d，觀察發(fā)病癥狀。在抗性表型觀察試驗(yàn)中，每個(gè)品種接種16個(gè)葉盤。

1.2.3的表達(dá)模式分析 取不同葡萄品種一年生枝條上第2—4位健康的幼嫩葉片，用超純水清洗兩次，濾紙吸干葉片表面水分，用打孔器打取直徑為1 cm的葉盤，放入鋪有兩層濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行保濕。葉盤均分到5個(gè)培養(yǎng)皿中，每個(gè)皿的標(biāo)記為0、6、12、24和48 h。每個(gè)品種選取長(zhǎng)勢(shì)一致的3棵植株作為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。按照1.2.2中的接種方法，分別進(jìn)行霜霉病菌和灰霉病菌接種，并分別在0、6、12、24和48 h取樣，迅速用液氮冷凍，保存于-80℃冰箱備用。

葉盤RNA提取和cDNA合成參照1.2.1。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物CHS1-qF/R，以為內(nèi)參基因（引物信息見(jiàn)表1），使用ROCHE公司的LightCycle 480進(jìn)行熒光定量PCR。每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。熒光定量反應(yīng)體系參照LightCycle 480 SYBR GreenⅠMaster說(shuō)明書(shū)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)0 h的表達(dá)量變化。采用IBM SPSS Statistics計(jì)算各組別間的差異顯著性。

1.2.4 VaCHS1的亞細(xì)胞定位 以‘雙紅’葉片cDNA為模板，使用含有Ⅰ和Ⅰ酶切位點(diǎn)的上下游引物CHS1-2F/R，利用2×Phanta Max Master Mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)使用Ⅰ和Ⅰ酶切pBI121- GFP載體；將目的基因和載體大片段回收純化后進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)PCR、酶切鑒定陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序；將構(gòu)建成功、測(cè)序正確的重組載體質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，28℃培養(yǎng)2 d；參照尹玲[14]的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法注射煙草葉片；48 h后取標(biāo)記的農(nóng)桿菌注射的煙草葉片，于激光共聚焦顯微鏡C2-ER（Nikon，Japan）下觀察GFP融合蛋白的綠色熒光位置，拍照記錄。

1.2.5 VaCHS1瞬時(shí)轉(zhuǎn)化至葡萄葉片 將pBWA(V) HS-VaCHS1GFP過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101。挑取單菌落接種到5 mL YEP培養(yǎng)基上，并加上2.5 μL的100 ng?mL-1的卡那霉素，在28℃、200 r/min的搖床上培養(yǎng)2 d。2 d后，將舊培養(yǎng)基上的菌液吸取200 μL至20 mL新鮮YEP中生長(zhǎng)。24 h后，將細(xì)菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50 mL離心管，室溫下1 500×離心4 min，用滲透緩沖液（50 mmol?L-1MES pH 5.6，2 mmol?L-1Na3PO4，0.5%蔗糖（w/v）和100 μmol?mL-1乙酰丁香酮）洗滌沉淀兩次，并將細(xì)菌懸浮液稀釋至OD600為0.2。在25℃、黑暗環(huán)境中生長(zhǎng)1—2 h，注射前輕輕搖動(dòng)離心管，使用不帶針頭的1 mL注射器注射菌液到‘無(wú)核白’葉片遠(yuǎn)軸端。滲透后，將葉片轉(zhuǎn)移到光照16 h、黑暗8 h，溫度為22℃的生長(zhǎng)室生長(zhǎng)。2 d后，分別用灰霉病菌和霜霉病菌鑒定瞬轉(zhuǎn)后葡萄葉片的抗性，同時(shí)以pBWA(V)HS-GFP空載作為對(duì)照，接種方法與1.2.2中離體葉盤類似，但是整片葉子接種時(shí)注意避開(kāi)葉片的主葉脈，同時(shí)接種點(diǎn)要與觀察到GFP熒光的注射點(diǎn)盡量保持重合。每組鑒定選取5片葉子作為生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 不同葡萄品種接種霜霉病菌和灰霉病菌的表型

通過(guò)室內(nèi)離體葉盤法接種鑒定發(fā)現(xiàn)，‘野釀二號(hào)’‘無(wú)核白’和‘雙紅’3個(gè)葡萄品種對(duì)霜霉病的抗性存在較大差異，如圖1所示，歐亞種‘無(wú)核白’接種5 d后，葉盤上可以觀察到明顯的白色霜霉，而山葡萄‘雙紅’和毛葡萄‘野釀二號(hào)’的葉盤表面未見(jiàn)任何發(fā)病癥狀。同樣地，利用室內(nèi)離體葉盤法對(duì)3個(gè)品種進(jìn)行灰霉病抗性鑒定，結(jié)果表明，相同面積的灰霉病菌菌塊接種相同大小的葉盤5 d后，‘無(wú)核白’表現(xiàn)出明顯的發(fā)病癥狀，病斑直徑顯著大于‘雙紅’，而‘野釀二號(hào)’葉盤上只觀察到接種前針刺的小孔。這表明，歐亞種‘無(wú)核白’對(duì)霜霉病菌和霜霉病菌均表現(xiàn)為感病，‘野釀二號(hào)’和‘雙紅’則對(duì)這兩種病原菌均有較強(qiáng)的抗性。

圖1 不同葡萄品種接種霜霉病菌和灰霉病菌后的表型

2.2 不同葡萄品種CHS的克隆和序列分析

以‘野釀二號(hào)’‘無(wú)核白’和‘雙紅’cDNA為模板，利用RT-PCR分別從3個(gè)品種中擴(kuò)增出、和的編碼區(qū)序列，全長(zhǎng)均為1 182 bp，編碼393個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)編碼的CHS1蛋白的分子量為42.92 kD，理論等電點(diǎn)為6.10，包含20種氨基酸，正電荷的氨基酸（Arg+Lys）43個(gè)，負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu）48個(gè)；不穩(wěn)定性系數(shù)為34.59，屬于穩(wěn)定蛋白，且親水性平均系數(shù)（GRAVY）為-0.064，為親水蛋白。TMHMM在線網(wǎng)站分析表明該蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域，不屬于跨膜蛋白。序列比對(duì)分析結(jié)果如圖2所示，VvCHS1和VaCHS1的氨基酸序列完全一致，VqCHS1與VvCHS1、VaCHS1只在第61位存在1個(gè)氨基酸的差異，說(shuō)明CHS1在不同品種中高度保守。

圖2 VqCHS1、VvCHS1和VaCHS1的氨基酸序列比對(duì)

2.3 不同品種受到病原菌侵染后CHS1的表達(dá)模式分析

用打孔器在‘野釀二號(hào)’和‘無(wú)核白’的嫩葉上打取葉盤，直徑0.5 cm灰霉病菌菌塊進(jìn)行侵染，并在侵染后0、6、12、24和48 h分別收集葉盤用于的熒光定量分析。結(jié)果如圖3所示，與0h相比，灰霉病菌侵染6 h后，‘野釀二號(hào)’誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，侵染后12—24 h，表達(dá)量比6 h有所下降，而48 h又急劇上升；感病品種‘無(wú)核白’的表達(dá)模式變化雖然與之類似，但整體表達(dá)量均低于抗灰霉病的‘野釀二號(hào)’。

用相同濃度的霜霉病菌孢子囊懸浮液接種‘雙紅’和‘無(wú)核白’的嫩葉葉盤，接種后0、6、12、24和48 h分別取樣用于表達(dá)量分析。結(jié)果如圖4所示，霜霉病菌侵染后，抗霜霉病的品種‘雙紅’中的的持續(xù)上調(diào)表達(dá)，在24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，48 h時(shí)表達(dá)量略有下降；而感病品種‘無(wú)核白’的表達(dá)量持續(xù)下降，在48 h時(shí)略有回升。

柱上不同小寫(xiě)字母表示相對(duì)表達(dá)量在0.05水平上差異顯著。圖4同Different lowercase letters on the bars indicate significant difference in the relative expression at 0.05 level.The same as Fig.4

2.4 CHS1蛋白的亞細(xì)胞定位

為了驗(yàn)證VaCHS1的亞細(xì)胞定位，將含有pBI121- VaCHS1-GFP載體的農(nóng)桿菌瞬時(shí)轉(zhuǎn)化至煙草葉片表皮細(xì)胞中，表達(dá)pBI121-GFP的煙草葉片為陰性對(duì)照，觀察融合蛋白的熒光位置。結(jié)果如圖5所示，瞬時(shí)表達(dá)pBI121-GFP的細(xì)胞，綠色熒光分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，而瞬時(shí)表達(dá)pBI121-VaCHS1-GFP的細(xì)胞，綠色熒光主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，少量分布在細(xì)胞膜。

2.5 CHS1的抗病功能驗(yàn)證

為了驗(yàn)證CHS1在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的功能，將pBWA(V)HS-GFP和pBWA(V)HS-VaCHS1- GFP分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)化感病品種‘無(wú)核白’組培苗葉片。2 d后，首先在紫外燈下觀察蛋白的表達(dá)情況，如圖6-A、6-B所示，觀察到明顯的綠色熒光，說(shuō)明pBWA (V)HS-GFP和pBWA(V)HS-VaCHS1-GFP在‘無(wú)核白’上正常表達(dá)。然后用直徑為0.5 cm的灰霉病菌菌塊和濃度為2×105孢子囊/mL的霜霉病菌菌液分別侵染瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的葉片，5 d后觀察發(fā)病情況。結(jié)果如圖6-C、6-D所示，表達(dá)VaCHS1的‘無(wú)核白’葉片接種灰霉病菌后，發(fā)病面積和嚴(yán)重程度明顯小于對(duì)照組，抗性顯著增強(qiáng)，5個(gè)重復(fù)試驗(yàn)鑒定結(jié)果表現(xiàn)一致；如圖6-E、6-F所示，對(duì)照組‘無(wú)核白’葉片接種點(diǎn)周圍可以觀察到明顯的白色霜霉菌，而過(guò)表達(dá)VaCHS1的‘無(wú)核白’葉片表現(xiàn)出較強(qiáng)的霜霉病抗性，葉片表面幾乎觀察不到病菌生長(zhǎng)，5片葉子重復(fù)表型一致。

圖4 霜霉病菌侵染‘雙紅’和‘無(wú)核白’過(guò)程CHS1的表達(dá)變化

A、E：熒光蛋白通道Fluorescent protein channel；B、F：葉綠體熒光蛋白通道Chloroplast fluorescent protein channel；C、G：明場(chǎng)Bright field；D、H：熒光蛋白通道、葉綠體熒光蛋白通道和明場(chǎng)的疊加圖Merged field

3 討論

3.1 CHS基因結(jié)構(gòu)與抗病性

類黃酮是植物重要的次生代謝產(chǎn)物，參與植物對(duì)逆境環(huán)境的抵抗[15]。CHS是類黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶，也是限速酶[16]。查爾酮合成酶基因家族是個(gè)古老的基因家族，具有高度保守性[17]。目前為止，在鹽膚木、金錢蓮、桑樹(shù)、海南龍血樹(shù)和高粱等多種植物中都已克隆得到。本研究克隆到的、和3個(gè)基因的ORF均為1 182 bp，編碼393個(gè)氨基酸，與顯齒蛇葡萄[18]中克隆得到的和巨峰葡萄中克隆得到的[19]的ORF長(zhǎng)度完全一致，說(shuō)明在同一科/屬的植物中具有高度保守性；而在草地早熟禾[17]和鹽膚木[20]中克隆得到的和的ORF長(zhǎng)度則為1 170和1 173 bp，說(shuō)明不同物種間的存在一定差異。此外，上游的啟動(dòng)子包含一些特殊元件調(diào)控自身的表達(dá)，例如銀杏啟動(dòng)子區(qū)存在紫外/藍(lán)光響應(yīng)單元、植物激素響應(yīng)單元、真菌誘導(dǎo)元件、MYB結(jié)合位點(diǎn)、TATA-box和CAAT-box等多個(gè)順式作用元件[21]；龍血樹(shù)的啟動(dòng)子區(qū)域中包含大量光應(yīng)答元件、激素應(yīng)答元件、MBY結(jié)合相關(guān)元件以及參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的富含TC的重復(fù)元件[22]；小麥啟動(dòng)子上的ABRE（脫落酸響應(yīng)原件）和茉莉酸甲酯的響應(yīng)原件被外界條件刺激（病原體侵染、創(chuàng)傷和低溫脅迫）后會(huì)誘導(dǎo)表達(dá)[8]。本研究中抗霜霉病品種‘雙紅’的VaCHS1與感病品種‘無(wú)核白’的VvCHS1之間無(wú)氨基酸差異，推測(cè)抗病性差異可能與其基因上游的啟動(dòng)子序列差異有關(guān)。

A、B：GFP和VaCHS1-GFP熒光蛋白表達(dá)Expression of fluorescent protein of GFPandVaCHS1-GFP；C、E：灰霉病菌、霜霉病菌侵染表達(dá)GFP的‘無(wú)核白’葉片B.cinerea and P.viticola infect ‘Thompson seedless’ leaves expressing GFP；D、F：灰霉病菌、霜霉病菌侵染表達(dá)VaCHS1的‘無(wú)核白’葉片B.cinerea and P.viticola infect ‘Thompson seedless’ leaves expressingVaCHS1

3.2 CHS在各種脅迫下的表達(dá)變化

的表達(dá)受到多種外界環(huán)境刺激的控制，包括紫外線、病原菌、創(chuàng)傷和生物鐘等各種生物和非生物脅迫[23]。研究表明，不同受到不同的刺激，其表達(dá)模式的變化也不盡相同。和在受到創(chuàng)傷時(shí)僅表現(xiàn)出輕微的上調(diào)表達(dá)，而則在創(chuàng)傷后8 h表達(dá)量增加5倍；與創(chuàng)傷處理相比，UV-C和霜霉病菌處理后，3個(gè)的轉(zhuǎn)錄物積累則均顯著減少[24]。而在CIAFFI等[25]的研究中發(fā)現(xiàn)，在不同基因型的葡萄品種中，3種組成型表達(dá)量存在顯著差異，但這種差異與葡萄對(duì)霜霉病的抗性并無(wú)顯著相關(guān)性，接種霜霉病菌后，在抗性較強(qiáng)品種中，霜霉病菌接種導(dǎo)致從感染的早期階段（16—24 hpi）開(kāi)始，轉(zhuǎn)錄物積累穩(wěn)定且顯著減少。上述兩項(xiàng)研究中，推測(cè)在抗性品種中表達(dá)水平的下降是由于與該基因具有相同催化底物的芪合酶表達(dá)量大幅提高，二者對(duì)底物的競(jìng)爭(zhēng)性抑制導(dǎo)致的。對(duì)霜霉病有較強(qiáng)抵抗力的黃瓜品種‘Jing Chun NO.4’受到黃瓜霜霉病菌侵染后，在25 hpi到30 hpi時(shí)表達(dá)量增加了5倍以上，隨后又迅速降低[26]。使用葡萄的寄主病原菌——葡萄霜霉病菌和非寄主病原菌——黃瓜霜霉病菌分別接種抗病葡萄‘Gloire’和感病葡萄‘Riesling’時(shí)，發(fā)現(xiàn)兩種病菌都能誘導(dǎo)的表達(dá)，但感病葡萄‘Riesling’中的表達(dá)量低于抗病葡萄‘Gloire’，值得注意的是，抗病品種中有較弱的組成型表達(dá)而在感病品種中則沒(méi)有[27]。本研究分別用灰霉病菌侵染‘野釀二號(hào)’和‘無(wú)核白’、霜霉病菌侵染‘雙紅’和‘無(wú)核白’，發(fā)現(xiàn)抗病品種‘野釀二號(hào)’‘雙紅’中和在受到病原菌侵染后都可以誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，而感病品種‘無(wú)核白’中的表達(dá)量明顯低于和，這與QIAO等[26]和KORTEKAMP[27]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明在抗病葡萄抵抗灰霉病菌和霜霉病菌侵染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

CHS可以通過(guò)催化形成不同的類黃酮化合物來(lái)提高植物的抗病能力，也可通過(guò)改變植保素[26]、黃酮素[23]、抗氧化酶SOD和POD[9]等的積累以及防御酶的活性來(lái)提高防御能力。在煙草中過(guò)表達(dá)或沉默，可以顯著提高或減少煙草葉片中總黃酮、綠原酸、蕓香苷、花青素等物質(zhì)的含量[9]?？箍菸〉拿藁ㄆ贩N中表達(dá)量明顯上調(diào)后，類黃酮的含量提高從而增加其對(duì)枯萎病的抗性[28]。本研究中在感病品種‘無(wú)核白’葉片中瞬時(shí)表達(dá)VaCHS1能夠提高對(duì)灰霉病和霜霉病的抗病能力，但具體是通過(guò)何種途徑誘導(dǎo)CHS的表達(dá)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

從不同抗性的葡萄品種‘野釀二號(hào)’‘雙紅’‘無(wú)核白’中分別克隆了，該基因高度保守，主要定位于細(xì)胞核；雖然受灰霉病菌和霜霉病菌侵染后表達(dá)模式的變化不同，但抗性品種‘野釀二號(hào)’以及‘雙紅’中的整體表達(dá)水平均顯著高于感病品種‘無(wú)核白’。過(guò)表達(dá)VaCHS1可以顯著提高‘無(wú)核白’葉片對(duì)灰霉病和霜霉病的抗性，表明CHS1在葡萄抵御灰霉病和霜霉病的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

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The Role of Chalcone Synthase Gene in Grape Resistance to Gray Mold and Downy Mildew

GUO ZeXi, SUN DaYun, QU JunJie, PAN FengYing, LIU LuLu, YIN Ling*

Key Lab of Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007

【Objective】The objective of this study is to clone the chalcone synthase geneand, verify the subcellular localization and function of CHS1, and to provide a basis for exploring the broad-spectrum resistance mechanism of CHS1.【Method】genes were cloned from the leaf cDNAs of‘Yeniang-2’,‘Thompson Seedless’ and‘Shuanghong’.The differences in the nucleic acid sequence and physicochemical properties of CHS1 protein were analyzed by bioinformatics.Expression patterns ofandinfection were also detected by qRT-PCR.The expression vector was constructed, and the transient expression technology mediated bywas used to verify the subcellular localization and disease resistance function in the leaves of tobacco and ‘Thompson Seedless’ tissue culture seedlings.【Result】Theis highly conserved among different grape varieties.The full length of ORF is 1 182 bp, which encodes 393 amino acids.The predicted molecular weight of the encoded protein is 42.92 kD, which is a stable hydrophilic protein.After being infected by, the expression patterns ofand1 were similar, but the expression level of‘Yejiang-2’ was significantly higher.After being infected by,andshowed different expression pattern changes.The expression level of‘Shuanghong’ continued to increase, while the expression level ofgradually decreased.The results of subcellular localization showed that CHS1 protein is distributed in the cytoplasm and nucleus, but it is mainly localized in the nucleus.Compared with the negative control, the ‘Thompson Seedless’ leaves overexpressing VaCHS1 showed stronger resistance to gray mold and downy mildewafter artificial inoculation.【Conclusion】The expression level ofCHS1 can increase the resistance of susceptible grape varieties to gray mold and downy mildew

chalcone synthase (CHS); grape;;; disease resistance

2021-09-23；

2021-12-14

國(guó)家自然科學(xué)基金（31860493）、廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（桂科AB21076001）、“廣西八桂青年學(xué)者”專項(xiàng)、廣西農(nóng)科院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)（2021JM97，2018JZ18）

郭澤西，E-mail：1162410925@qq.com。通信作者尹玲，E-mail：779335723@qq.com

（責(zé)任編輯 岳梅）