圓錐繡球“粉色精靈”組培快繁技術(shù)研究

王紅梅， 陳婷婷， 劉春風(fēng)， 孟紫蓮， 高 鵬

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 江蘇 句容 212400；2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 北京 100083)

圓錐繡球(HydrangeapaniculataSieb.et Zucc)是虎尾草科繡球?qū)僦参铮淙~灌木，多生于山谷、疏林或灌叢中[1]。葉片紙質(zhì)，卵形或橢圓形，長6～12 cm，對(duì)生或輪生，背脈上具毛[2]；聚傘花序尖塔形，花序極大，如‘魔幻月光’品種花序縱徑可達(dá)30 cm以上?；ㄆ?—10月，觀賞期長，從夏季一直持續(xù)到秋季[3]。圓錐繡球品種豐富，顏色可人，多數(shù)品種初花時(shí)為白色或綠色，隨著溫度和光照條件等的變化，部分品種花色可變?yōu)榧儼?、淡粉、綠粉、紅色等，因而具有極高觀賞價(jià)值[4]。圓錐繡球適應(yīng)范圍較廣，可片植、孤植和群植于庭院、公園、街道等綠地，亦可多個(gè)品種混栽更為壯觀且延長了觀賞期[5]。初秋季節(jié)，花干而不枯，巨大的花球剪下可作為室內(nèi)的裝飾點(diǎn)綴。此外，圓錐繡球還具有一定的藥用價(jià)值，其根系可入藥，用于免疫疾病的治療，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[6]；其提取物總香豆素苷對(duì)治療慢性損傷有一定作用[7]。由于圓錐繡球花序多由無性花組成，較難采用播種方法進(jìn)行繁殖，多采用無性繁殖的方法，如扦插、壓條等，但繁殖率不高，而組培可以在短期內(nèi)快速繁殖，獲得優(yōu)質(zhì)苗木[8]。

目前對(duì)于圓錐繡球的組織培養(yǎng)報(bào)道較少，陸乙卜等[9]以野生圓錐繡球的種子為試驗(yàn)材料，研究了種子離體萌發(fā)的培養(yǎng)條件。王紅梅等[10]報(bào)道了圓錐繡球‘北極熊’組培快繁體系的建立?！胺凵`”是開花較早的圓錐繡球品種，且為少有的花色可變品種，初花白色，隨著開花時(shí)間的延長、溫度及光照條件的變化，可逐漸變?yōu)榧t色，其植株粗壯，生長旺盛，是觀賞性與抗性均較好的品種。目前，“粉色精靈”組培快繁技術(shù)的研究未見相關(guān)報(bào)道[3]。本研究旨在利用莖段作為外植體，探索圓錐繡球“粉色精靈”的組培快繁技術(shù)，為利用組織培養(yǎng)的方法快速繁殖圓錐繡球健壯苗木提供一定的技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

外植體材料為圓錐繡球“粉色精靈”(Hydrangeapaniculata‘Pink Winky’)品種的當(dāng)年生幼嫩莖段，來源于江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)博園科研基地。于4—6月份的晴天中午，選擇生長健壯、無病蟲害的新生嫩梢8～10 cm，采集完后立即將其放進(jìn)裝水的燒杯中，以防嫩梢失水萎蔫，并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1材料預(yù)處理

將采集來的嫩梢進(jìn)行修剪，去掉葉片和葉柄，剪切成2 cm左右莖段，每段保留1～2個(gè)腋芽[3]，然后將莖段放入干凈的燒杯中，在洗衣液中浸泡15 min，再在流水下沖洗1.5～2 h。

1.2.2材料表面滅菌

在超凈工作臺(tái)內(nèi)將流水沖洗好的莖段用2 g/L多菌靈和0.6 g/L鏈霉素的混合溶液浸泡5～12 min，之后用無菌水沖凈[3]，然后用消毒好的鑷子每次夾取10個(gè)莖段，轉(zhuǎn)入無菌空瓶，用75%酒精處理40 s，無菌水沖洗2次，再用0.1%HgCl2處理3～10 min，無菌水沖洗3次，處理時(shí)不斷搖晃無菌瓶，使藥劑與材料充分接觸。采用雙因素完全隨機(jī)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素分別為：殺菌劑2 g/L多菌靈和0.6 g/L鏈霉素混合溶液的處理時(shí)間(0、5.0、8.0、12.0 min)，HgCl2的處理時(shí)間(3.0、5.0、7.0、10.0 min)各4個(gè)水平，共16個(gè)處理，每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種2個(gè)外植體，重復(fù)4次[3]。14 d后觀察滅菌效果，統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率和成活率。

1.2.3啟動(dòng)培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)上，對(duì)經(jīng)表面滅菌的莖段兩端直接接觸藥劑的切口稍做修剪，修剪成1 cm左右的單芽莖段，垂直接種于培養(yǎng)基上，接種深度以能固定住外植體莖段為宜。啟動(dòng)培養(yǎng)選用MS基本培養(yǎng)基，采用雙因素完全隨機(jī)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)激素的種類及濃度進(jìn)行試驗(yàn)，分別為：6-BA(0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L)和NAA(0.1、0.15、0.2、0.5 mg/L)，共16個(gè)處理，每個(gè)處理15瓶，每瓶接種2個(gè)外植體，重復(fù)4次[3]。30 d后統(tǒng)計(jì)生長狀況并計(jì)算萌芽率。

萌芽率(%)=(萌芽外植體數(shù)/接種數(shù))×100%。

1.2.4增殖培養(yǎng)

將經(jīng)過啟動(dòng)培養(yǎng)30 d的組培苗截成1.5 cm左右的帶芽莖段，將莖段下部可能接觸到培養(yǎng)基的部分葉片減掉，然后將修剪好的莖段接種到增殖培養(yǎng)基。增殖培養(yǎng)選用MS基本培養(yǎng)基，采用雙因素完全隨機(jī)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，加入不同濃度的6-BA(1.0、1.5、2.0 mg/L)和NAA(0.1、0.15、2.0 mg/L)，共9個(gè)處理，每個(gè)處理20瓶，每瓶接種2個(gè)外植體,重復(fù)3次。20 d后統(tǒng)計(jì)生長狀況并計(jì)算增殖系數(shù)。

增殖系數(shù)=總增殖芽數(shù)/原接種數(shù)[3]。

1.2.5生根培養(yǎng)

選用1/2 MS基本培養(yǎng)基，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素及水平分別為6-BA(0、0.05、0.2 mg/L)，IBA(0、0.1、0.5 mg/L)，NAA(0.05、0.1、0.5 mg/L)，共9個(gè)處理，每個(gè)處理接種40個(gè)莖段，重復(fù)3次。接種方法為：待增殖培養(yǎng)20 d左右，試管苗長到2 cm以上時(shí)[11]，將較健壯的組培苗取出，剪掉基部愈傷組織及能接觸到培養(yǎng)基的葉片，垂直接種于生根培養(yǎng)基上，每瓶接種1～2個(gè)莖段，20 d后計(jì)算生根率、平均根數(shù)和平均根長。

注：不同字母表示在0.05水平上差異顯著。 圖1 不同處理對(duì)外植體消毒效果的影響 Fig.1 Effect of different treatments on the disinfection effect of explants

1.2.6馴化與移栽

將經(jīng)過生根培養(yǎng)30～35 d，帶健壯根的組培苗在溫室進(jìn)行馴化，兩周左右后可以看見組培苗的莖段變硬，打開瓶蓋，煉苗2 d，移栽前用溫水洗凈組培苗根系周圍的培養(yǎng)基，栽入由腐殖土、蛭石、珍珠巖配比好的3種基質(zhì)中，共7個(gè)處理，每種處理30株。移栽后澆透水，用塑料薄膜覆蓋，溫度保持在25 ℃左右，空氣濕度保持在80%～90%，每天上午和下午視情況噴水2次，注意通風(fēng)透氣，30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.2.7培養(yǎng)條件

啟動(dòng)和增殖培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30 g/L[3]，生根培養(yǎng)基中蔗糖濃度為20 g/L。其余條件均為：瓊脂6.8 g/L，pH值5.8～6.2。121 ℃高壓滅菌20～25 min，培養(yǎng)室中溫度為(25±2)℃，光照強(qiáng)度保持在2 000～3 000 lx，光照時(shí)間為每天12 h[3]。

1.2.8統(tǒng)計(jì)分析

采用IBM SPSS STATISTIC 23.0單因素方差分析(ANOVA)、一般線性模型(單變量、多變量)進(jìn)行方差分析，采用Excel 2016軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的消毒效果

內(nèi)源菌是導(dǎo)致組培過程污染率高的原因之一，因此需要借助一些殺菌劑進(jìn)行殺菌。多菌靈為高效低毒內(nèi)吸性殺菌劑，有內(nèi)吸治療和保護(hù)作用[12]。鏈霉素是一種抗生素，有一定抗菌作用。將外植體浸入2 g/L多菌靈和0.6 mg/L鏈霉素混合溶液中，再配合酒精與HgCl2進(jìn)行表面滅菌。外植體的消毒效果見表1。

利用SPSS軟件將百分?jǐn)?shù)資料進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，公式為：X2=ARSIN(SQPT(X1))，其中X1為需轉(zhuǎn)換的百分?jǐn)?shù)(數(shù)值范圍為0～1之間)，X2為轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)。利用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。將污染率、褐變率作圖，并在圖中以字母的形式標(biāo)出多重比較結(jié)果。由圖1可見，處理10的污染率和褐化率均最低，分別為6.25%和0.63%。此時(shí)的殺菌劑滅菌時(shí)間為8 min，HgCl2滅菌時(shí)間為5 min。當(dāng)殺菌劑滅菌時(shí)間小于8 min時(shí)滅菌效果不明顯，污染率高。當(dāng)大于8 min時(shí)污染率又會(huì)增加。當(dāng)HgCl2滅菌時(shí)間小于5 min時(shí)褐化率極低，但是污染率高，滅菌效果不明顯。當(dāng)HgCl2滅菌時(shí)間大于5 min時(shí)褐化率增高，外植體受傷嚴(yán)重。

表1 外植體的表面消毒效果Table 1 Effect of surface disinfection of explants

2.2 激素種類及濃度對(duì)腋芽萌發(fā)的影響

初代培養(yǎng)30 d后對(duì)組培苗腋芽萌發(fā)情況做統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)及極差分析結(jié)果(見表2)。

從表2可得出，在其他因素相同的條件下，激素6-BA較NAA對(duì)腋芽的萌發(fā)影響更大，處理6，即當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L，NAA濃度為0.15 mg/L時(shí)萌芽率可達(dá)100%，且生長旺盛，苗的生長情況見圖2 A～圖2 C)。通過SPSS軟件對(duì)萌芽率百分?jǐn)?shù)進(jìn)行平均根反正弦轉(zhuǎn)換后，再進(jìn)行方差分析，結(jié)果得出，6-BA濃度對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響p=0.000，小于0.05，所以處理間差異顯著；NAA濃度對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響p=0.022，小于0.05，所以處理間差異顯著。多重比較結(jié)果以字母的形式標(biāo)注在表2各水平的平均數(shù)后，其結(jié)果得出：6-BA濃度為0.5 mg/L時(shí)與其他濃度間均存在顯著差異，且該濃度萌芽率最高，說明0.5 mg/L的6-BA對(duì)芽的分化效果最好。當(dāng)NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)與其他濃度間均存在顯著差異，其萌芽率低；而其他濃度間對(duì)腋芽誘導(dǎo)的效果差異不顯著。

表2 不同生長激素配比對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響的極差分析Table 2 Range analysis of effect of different growth hormone ratio on axillary bud induction

2.3 不同濃度生長激素配比對(duì)增殖效果的影響

增殖培養(yǎng)30 d左右，對(duì)增殖效果進(jìn)行記錄并做極差分析，見表3。增殖系數(shù)是衡量植物分化能力的重要指標(biāo)，是組培過程中需要著重研究的問題。增殖系數(shù)的大小決定了擴(kuò)繁植株的數(shù)量，在組織培養(yǎng)試驗(yàn)中尤為重要。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6-BA濃度為0.1 mg/L、NAA濃度為0.15 mg/L時(shí)，叢生芽最多且苗健壯，增殖系數(shù)可達(dá)7.0，苗的生長情況見圖2 D。

極差分析結(jié)果顯示，6-BA的第二水平與NAA的第二水平結(jié)合對(duì)不定芽增殖的效果最好。對(duì)不同濃度生長激素配比對(duì)增殖效果影響做方差分析及多重比較，結(jié)果顯示，不同濃度6-BA對(duì)增殖的影響p=0.016，小于0.05，所以處理間差異顯著；不同濃度NAA對(duì)增殖的影響p=0.012，小于0.05，所以處理間差異顯著。多重比較結(jié)果(以字母形式標(biāo)注于表3)得出：當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)與其他濃度間差異顯著，但增殖系數(shù)最低；而6-BA濃度為1.0 mg/L和1.5 mg/L之間差異不顯著。當(dāng)NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)與其他濃度間差異顯著，而NAA 0.10 mg/L和0.15 mg/L之間差異不顯著。綜合分析，適宜圓錐繡球“粉色精靈”增殖的培養(yǎng)基為：MS+6-BA(1.0～1.5)mg/L+NAA(0.10～0.15)mg/L。

表3 不同生長激素配比對(duì)增殖效果的極差分析Table 3 Range analysis of effect of different concentrations of growth hormone on proliferation

表4 不同生長激素配比對(duì)生根效果影響的極差分析Table 4 Range analysis of effect of different concentrations of growth hormone on rooting

注：A為莖段外植體腋芽萌發(fā)；B～C為初代培養(yǎng)苗；D為增殖培養(yǎng)苗；E～F為生根培養(yǎng)苗；G～H為移栽組培苗。 圖2 圓錐繡球“粉色精靈”的組織培養(yǎng)Fig.2 Tissue culture of Hydrangea paniculata ‘Pink Winky’

2.4 不同濃度生長激素配比對(duì)生根效果的影響

增殖培養(yǎng)20 d后對(duì)生根情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)及極差分析結(jié)果見表4。

對(duì)于生根率的影響排序?yàn)椋篒BA>6-BA>NAA；對(duì)于根數(shù)的影響排序?yàn)椋篒BA>6-BA>NAA；對(duì)于根長的影響排序?yàn)椋?-BA>IBA>NAA。利用SPSS軟件對(duì)不同激素配比的生根效果進(jìn)行方差分析及多重比較，其中生根率需進(jìn)行平方根反正弦轉(zhuǎn)換后再分析。方差分析結(jié)果表明，無論是生根率、平均根數(shù)還是平均根長，6-BA、IBA、NAA的各水平間的p值均大于0.05，即各水平間差異不顯著。在試驗(yàn)所選取的激素配比范圍內(nèi)，圓錐繡球“粉色精靈”生根比較容易。但結(jié)合根的長勢以及葉片與植株的生長情況分析，未添加6-BA的處理，植物葉片枯黃；IBA不添加時(shí)，根細(xì)弱，隨著加入量增加，對(duì)根的生長有促進(jìn)作用；當(dāng)NAA濃度較低時(shí)，不易生根，濃度較高時(shí)，莖基部愈傷組織增大，并萌生出粗壯根系。所以由表4可知，當(dāng)6-BA濃度為0.05 mg/L，IBA濃度為0.1 mg/L，NAA濃度為0.2 mg/L時(shí)，3種激素相互協(xié)作，效果最好，生根率為100%，平均根長為3.12 cm，平均根數(shù)21條，根系發(fā)達(dá)，苗健壯，見圖2 E、圖2 F。

2.5 不同基質(zhì)體積配比對(duì)后期馴化移栽效果的影響

移栽之后統(tǒng)計(jì)移栽苗的成活率(見表5)，對(duì)成活率數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及多重比較。由此可得，當(dāng)基質(zhì)配比為V腐殖土∶V珍珠巖=1∶1時(shí)，成活率最高為87%，見圖2 G、圖2 H。

表5 不同基質(zhì)體積配比對(duì)后期馴化移栽效果的影響Table 5 Effects of different volume ratio of substrate on the later domestication and transplanting

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

在圓錐繡球“粉色精靈”的組培試驗(yàn)中，通過數(shù)據(jù)對(duì)比得出最佳的滅菌方法為：將處理好的外植體在洗衣液中浸泡15 min，流水下沖洗1.5～2 h，2 g/L多菌靈和0.6 g/L鏈霉素浸泡8 min左右，用無菌水沖凈，將莖段放入超凈工作臺(tái)進(jìn)行表面消毒，75%酒精浸泡1 min左右，無菌水沖洗1～2次，0.1%HgCl2浸泡5 min左右，無菌水沖洗3～5次，成活率達(dá)95%。著重解決啟動(dòng)培養(yǎng)時(shí)外植體污染率極高的問題。在初代培養(yǎng)過程中，當(dāng)MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L+瓊脂6.8 g/L+蔗糖30 g/L，萌芽率達(dá)100%，組培苗健壯，葉片大。在增殖培養(yǎng)過程中，當(dāng)MS+6-BA(1.0～1.5)mg/L+NAA(0.10～0.15)mg/L+瓊脂6.8 g/L+蔗糖30 g/L，增殖系數(shù)最高可達(dá)7.0，解決了增殖培養(yǎng)中增殖系數(shù)不高等問題。生根培養(yǎng)過程，培養(yǎng)基為1/2 MS+6-BA 0.05 mg/L+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L，附加瓊脂6.8 g/L，蔗糖20 g/L，生根率達(dá)100%，根長3.12 cm。在后期馴化與移栽階段，使用V腐殖土∶V珍珠巖=1∶1，成活率可達(dá)87%。通過上述研究建立相對(duì)合適的快繁體系，降低污染率，提高繁殖率及生根率，改善組培苗生長狀況，為利用組織培養(yǎng)的方法快速繁殖圓錐繡球苗木提供技術(shù)支持。

3.2 討 論

植物組培試驗(yàn)是一個(gè)不斷嘗試的過程，在此過程中尋找對(duì)外植體的最佳滅菌藥劑、滅菌時(shí)間、滅菌方法尤為重要，是實(shí)現(xiàn)組培試驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。解決外植體污染問題是組培的首要任務(wù)。微生物是引起植物組織培養(yǎng)污染的重要原因[13]，而其小又無處不在，所以減少培養(yǎng)環(huán)境中的微生物可以大大提高組培效率[14]。外植體的滅菌是組培的關(guān)鍵，外植體的不同生長狀態(tài)，不同采集時(shí)間，表面微生物情況不同，甚至有些菌絲體已侵入組織[15]，使消毒滅菌效果差異較大。單一的藥劑滅菌很難達(dá)到較好的效果，利用抑菌劑或殺菌藥劑對(duì)材料進(jìn)行處理后，再利用酒精和HgCl2配合進(jìn)行表面消毒滅菌的效果明顯好于不使用殺菌劑的滅菌處理，但若殺菌劑浸泡時(shí)間超過一定臨界值，滅菌效果也不明顯。HgCl2浸泡時(shí)間過短，滅菌不充分，時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致外植體褐化。

在啟動(dòng)、增殖、生根培養(yǎng)過程中，尋找最合適的激素配比平衡對(duì)組培苗的生長影響顯著。在啟動(dòng)培養(yǎng)過程中，細(xì)胞分裂素6-BA對(duì)芽的誘導(dǎo)效果顯著，不過隨著濃度的升高，超過臨界值會(huì)有一定抑制作用，培養(yǎng)基中使用細(xì)胞分裂素與生長素配合，對(duì)于芽的誘導(dǎo)及高生長都有顯著的影響。增殖培養(yǎng)過程中，較高的6-BA濃度會(huì)抑制芽的伸長[16]，后期葉片會(huì)枯黃；NAA濃度過高會(huì)抑制苗的分化[17]，使基部愈傷組織膨大。后期葉片枯黃問題可添加20～25 g/L的香蕉泥來解決，在之后的組培試驗(yàn)中，可繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)研究。添加一定濃度NAA與IBA能促進(jìn)組培苗根系數(shù)量增多和根的生長[18]。IBA和NAA協(xié)同作用時(shí)，效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其中任一種激素單獨(dú)使用的效果[8]。

試管苗生長在恒溫、高濕、弱光、無菌的環(huán)境條件下[19]，因此，出瓶移栽前必須經(jīng)歷一個(gè)逐步馴化的過程。馴化時(shí)間的長短結(jié)合苗木的狀況，待試管苗莖稈明顯變硬后，再行移栽。馴化時(shí)間一般不能短于2周。移栽基質(zhì)的種類對(duì)試管苗根系的生長影響較大，試管苗根系為不定根，根與莖的疏導(dǎo)組織連通性不好，移栽基質(zhì)必須具有良好的疏松透氣性。純腐殖土基質(zhì)透氣性不好，易造成爛根；純珍珠巖基質(zhì)透氣性好，但水分流失快，一旦水分不足，苗木很容易萎蔫。因此，使用腐殖質(zhì)土和珍珠巖按照一定比例配合使用較好。