藜麥ZF-HD轉錄因子的全基因組鑒定及其對鹽脅迫的響應分析

時丕彪　王德領　蔣潤枝　李斌　晏軍　方迪　閆凱旋　顧閩峰

摘要：以藜麥的高質量基因組為參考，對藜麥鋅指同源異型結構域（ZF-HD）轉錄因子基因CqZF-HD進行全基因組鑒定，并利用生物信息學方法對其編碼的蛋白質理化性質、二級結構、亞細胞定位、保守結構域以及基因結構、系統(tǒng)進化關系進行了分析。同時，利用前期轉錄組測序結果分析了CqZF-HD家族基因在鹽脅迫下的表達模式。結果表明，在藜麥中共鑒定出21個ZF-HD轉錄因子，大部分定位在細胞質，二級結構以無規(guī)則卷曲為主，氨基酸序列長度68～284 aa，相對分子質量7.54×103～30.20×103，理論等電點6.01～9.54;每個ZF-HD蛋白都含有ZF或HD保守結構域，系統(tǒng)進化樹將其劃分為5個亞家族。鹽處理下表達分析結果顯示，11個CqZF-HD基因響應藜麥鹽脅迫，其中8個基因呈上調(diào)表達，3個基因呈下調(diào)表達，說明ZF-HD家族基因在參與藜麥鹽脅迫中發(fā)揮著不同的作用。

關鍵詞：藜麥;鋅指同源異型結構域（ZF-HD）;全基因組;鹽脅迫;基因表達

中圖分類號：S512.9文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2022）02-0304-08

Genome-wide identification of ZF-HD transcription factors and expression analysis of response to salt stress in quinoa

SHI Pi-biao，WANG De-ling，JIANG Run-zhi，LI Bin，YAN Jun，F(xiàn)ANG Di，YAN Kai-xuan，GU Min-feng

Abstract：Zinc finger-homeodomain （ZF-HD） proteins are plant-specific transcription factors that play important roles in plant growth， development and various stress responses. In this study， the CqZF-HD gene was identified at genome-wide level with the high-quality quinoa genome as a reference. The physicochemical properties， secondary structure， subcellular localization and conserved domains of CqZF-HDs， phylogenetic relationship and gene structure were analyzed by bioinformatics method. Meanwhile， the expression pattern of CqZF-HD family genes under salt stress was also analyzed by preliminary transcriptome sequencing results. The results showed that 21 ZF-HD transcription factors were identified in quinoa， most of which were located in the cytoplasm， the secondary structure was dominated by random coils， amino acid sequence length was 68-284 aa， relative molecular weight was 7.54×103-30.20×103， and theoretical isoelectric point was 6.01-9.54. All of the ZF-HDs were divided into five subfamilies by phylogenetic tree analysis， and each member contained conserved domains ZF or HD. The expression analysis under salt treatment showed that 11 CqZF-HDs responded to salt stress in quinoa， eight genes were up-regulated， and three genes were down-regulated. In conclusion， ZF-HD family genes play different roles in response to salt stress in quinoa.

Key words：quinoa;zinc finger-homeodomain （ZF-HD）;genome-wide;salt stress;gene expression

鋅指同源異型結構域（ZF-HD）蛋白是植物所特有的一類轉錄因子，在植物生長發(fā)育和各種脅迫反應中發(fā)揮著重要作用[1-2]。ZF-HD轉錄因子的氨基酸序列中具有保守的HD結構域（Homeodomain）和C2H2型ZF結構域（C2H2-type zinc finger domain）[3-4]。HD結構域是一種特征明確的DNA結合結構域，通過與DNA結合調(diào)控靶基因的表達水平，從而參與植物的生長發(fā)育[5]。ZF結構域廣泛存在于調(diào)控蛋白中，并與DNA結合和蛋白質互作，在植物抵御脅迫反應中起著重要作用[6-7]。ZF-HD蛋白通常以一種核心序列ATTA與特異性DNA序列結合，形成同型二聚體或異型二聚體[1]。ZF-HD家族可分為ZHD和MIF （Mini zinc finger）2個亞家族，其中MIF基因編碼ZF-HD蛋白的ZF結構域，并不編碼HD結構域[3]。

在黃頂菊中首次發(fā)現(xiàn)ZF-HD蛋白，可能是編碼C4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的調(diào)控因子[8]。隨后，在擬南芥[1]、水稻[9]、番茄[10]、大白菜[4]、棉花[11]和苦蕎[12]等植物中也發(fā)現(xiàn)了ZF-HD基因，并對其進行了基因家族鑒定及功能分析。擬南芥中有17個ZF-HD成員，它們作為轉錄因子，具有獨特的生理特性，在花的發(fā)育中起著非常重要的作用[3]。AtZHD1能夠與ERD1 （EARLY RESPONSE TO DEHYDRATION STRESS 1）啟動子特異性結合，并且其表達受干旱、鹽和脫落酸（ABA）處理誘導，NAC和AtZHD1的過表達增強了擬南芥的耐旱性[13]。AtHB33受ARF2 （Auxin response factor2）負調(diào)控，是種子萌發(fā)和主根生長所必需的[14]。OsZHD1和OsZHD2通過調(diào)控鱗狀細胞的數(shù)量和排列方式而引起水稻葉片卷曲[15];OsZHD2的過表達不僅能促進根的生長，還能增加水稻產(chǎn)量[16]。干旱、NaCl和低溫處理對番茄SlZHD18基因具有明顯的誘導作用，而熱脅迫對其沒有明顯誘導作用[10]。在響應干旱脅迫和高鹽脅迫時，葡萄VvZHD基因呈上調(diào)表達[17]。因此，ZF-HD基因不僅在植物的各個生長發(fā)育階段發(fā)揮著一定的作用，還參與了植物對鹽分等逆境脅迫的響應。

藜麥是一種新型全營養(yǎng)作物，也是未來最具潛力的農(nóng)作物之一。然而，關于藜麥ZF-HD基因的研究至今尚未見報道。隨著藜麥基因組的公布[18]，使得在全基因組范圍內(nèi)分析藜麥ZF-HD基因家族成為可能。本研究以現(xiàn)有的藜麥基因組信息為基礎，借助生物信息學手段對藜麥ZF-HD基因家族進行全基因組鑒定，并對其基因結構、系統(tǒng)進化關系以及ZF-HD蛋白的理化性質和保守結構域等進行分析，同時利用轉錄組數(shù)據(jù)探究其在鹽脅迫下的表達情況，為進一步解析ZF-HD基因家族與藜麥耐鹽性的關系及其抗性遺傳改良奠定基礎。

1材料與方法

1.1藜麥ZF-HD基因家族的鑒定和藜麥ZF-HD蛋白理化性質分析

從植物轉錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB（http：//planttfdb.gao-lab.org/）下載擬南芥AtZF-HD轉錄因子的氨基酸序列，并在藜麥基因組數(shù)據(jù)庫Chenopodium quinoa v1.0 （https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias=Org_Cquinoa_er）進行Blastp比對，設置E-value為1×e-5。在Pfam （http：//pfam.xfam.org/）和CDD （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）上在線分析候選CqZF-HD蛋白的保守結構域，去除編碼不完整蛋白質和不含ZF或HD結構域的蛋白質，最終得到藜麥ZF-HD轉錄因子家族所有成員。利用ExPasy網(wǎng)站（http：//au.expasy.org/tool.html）分析藜麥ZF-HD蛋白家族的氨基酸序列長度、相對分子質量和理論等電點。

1.2 藜麥ZF-HD蛋白的二級結構和亞細胞定位

利用在線網(wǎng)站GORIV （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）分析藜麥ZF-HD蛋白的二級結構特征。使用PSORT （http：//psort1.hgc.jp/form.html）對ZF-HD蛋白進行亞細胞定位預測。

1.3藜麥ZF-HD基因家族的基因結構和藜麥ZF-HD蛋白保守結構域分析

根據(jù)藜麥ZF-HD基因的基因組序列和編碼序列，確定基因的外顯子和內(nèi)含子起止位置，并利用在線軟件GSDS 2.0 （http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）繪制基因結構圖。經(jīng)CDD分析得到藜麥ZF-HD蛋白保守結構域的氨基酸序列起始位點，利用IBS 1.0軟件[19]將保守結構域位置進行可視化顯示，再使用ClustalX 2.0軟件[20]對保守結構域氨基酸序列進行多重比對。

1.4ZF-HD基因家族的系統(tǒng)進化分析

利用MEGA 5.0[21]內(nèi)置軟件ClustalW對藜麥（21個）和擬南芥（17個）ZF-HD蛋白的氨基酸序列進行多重比對，再利用MEGA 5.0軟件對比對結果進行系統(tǒng)進化關系分析，用鄰接法（Neighbor-Joining， NJ）構建無根進化樹，bootstrap重復次數(shù)設置為1 000次。

1.5鹽脅迫下藜麥ZF-HD基因的表達分析

利用本課題組已經(jīng)完成的藜麥高通量測序轉錄組數(shù)據(jù)，分析藜麥ZF-HD基因家族在鹽脅迫下的表達模式。用3%的雙氧水對供試藜麥品種37TES的種子進行表面消毒1 min，然后用無菌水將種子沖洗干凈，在光周期為16 h光照/8 h黑暗的28 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱進行發(fā)芽試驗。培養(yǎng)7 d后，將長勢一致的幼苗轉移到Hoagland營養(yǎng)液[22]中進行水培，繼續(xù)培養(yǎng)28 d。然后進行300 mmol/L NaCl處理，分別在0 h、0.5 h、2.0 h和24.0 h時取根部，用于轉錄組測序和qRT-PCR驗證，每個處理設3次重復。藜麥ZF-HD基因家族成員的轉錄組表達量經(jīng)logx2均一化處理，使用HemI軟件[23]繪制鹽脅迫下轉錄組基因表達圖譜。

2結果與分析

2.1藜麥ZF-HD基因家族的全基因組鑒定與特征分析

以擬南芥AtZF-HD基因編碼的蛋白質氨基酸序列為查詢對象，在藜麥全基因組數(shù)據(jù)庫進行Blastp比對，得到23個具有編碼ZF或HD結構域的CqZF-HD基因，其中有2個CqZF-HD編碼不完整蛋白質，最終鑒定出21個藜麥ZF-HD基因家族成員，分布在16條scaffold上（表1）。理化性質分析結果表明，不同ZF-HD蛋白氨基酸序列的長度差異較大，其中AUR62021438最小，為68 aa，AUR62019007最大，為284 aa。除AUR62027182和AUR62044191因蛋白質氨基酸序列含有幾個連續(xù)未定義的氨基酸而無法計算其相對分子質量和等電點（pI）外，其余19個ZF-HD蛋白的相對分子質量為7.54×103～30.20×103，pI為6.01～9.54。pI小于7的只有AUR62021438（6.68）和AUR62039796（6.01），為酸性蛋白質，其他ZF-HD的pI均大于7，為堿性蛋白質。

2.2藜麥ZF-HD蛋白的二級結構和亞細胞定位預測

藜麥ZF-HD基因編碼的蛋白質二級結構主要包括α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲，均不含β-折疊，其中AUR62021682、AUR62008414、AUR62021438、AUR62039796、AUR62028772和AUR62010926也沒有α-螺旋結構（表2）。大部分ZF-HD成員的二級結構成分中，無規(guī)則卷曲占比最高，其次是延伸鏈，α-螺旋占比相對較少。亞細胞定位預測結果顯示，14個ZF-HD成員定位于細胞質，3個成員定位于細胞核，3個成員定位于線粒體基質，1個成員定位于葉綠體基質，說明它們可能調(diào)控著植物不同的生物學過程。

2.3ZF-HD基因家族的系統(tǒng)進化關系分析

為更好地了解藜麥ZF-HD基因家族成員之間的同源性關系，將17個擬南芥AtZF-HD 基因與21個藜麥CqZF-HD基因編碼的蛋白質氨基酸序列進行多重比對并構建系統(tǒng)進化樹（圖1）。聚類分析結果顯示，38個ZF-HD轉錄因子可以劃分為5個亞家族：MIF、ZHDⅠ、ZHDⅡ、ZHD Ⅲ和ZHD Ⅳ，位于不同亞家族的蛋白質可能發(fā)揮著不同的生物學作用。藜麥的ZF-HD基因在MIF亞家族數(shù)目較多，為12個，在ZHDⅠ存在4個，在ZHD Ⅱ和ZHD Ⅳ均含2個，在ZHD Ⅲ只存在1個，即AUR62000606。藜麥的AUR62007575和AUR62004062與擬南芥的AT2G18350和AT1G75240處于同一分支，說明它們的親緣關系較近，可能具有類似的功能。

2.4藜麥ZF-HD基因結構特征分析

基因結構分析結果表明，藜麥ZF-HD基因家族的基因結構比較簡單，均不含非翻譯區(qū)，但不同成員間也存在一定差異（圖2）。其中，13個基因只有1個外顯子，沒有內(nèi)含子;7個基因具有2個外顯子和1個內(nèi)含子;1個基因（AUR62027182）具有4個外顯子和3個內(nèi)含子。AUR62019007和AUR62027848同屬ZHDⅠ亞家族，有著相同的基因結構和相似的CDS長度，但因內(nèi)含子長度差別較大使其基因全長存在顯著差異。

為進一步研究藜麥ZF-HD蛋白的特征區(qū)域，在CDD網(wǎng)站上對其進行保守結構域分析，結果表明21個ZF-HD蛋白均含有ZF或HD結構域，但這2個結構域在各個亞家族成員的分布有所不同（圖3）。MIF亞家族所有成員HD結構域缺失，均只含有1個ZF結構域，并且同源基因對編碼蛋白質的氨基酸數(shù)量和結構域位置都具有較高的相似性;ZHDⅠ亞家族中除AUR62044191只含有1個ZF結構域外，其他3個成員都含有ZF和HD結構域;ZHD Ⅱ和ZHD Ⅲ的成員都含有ZF和HD結構域;ZHD Ⅳ的2個成員的保守結構域均位于蛋白質的N端，AUR62039796只含有1個HD結構域，而AUR62028772只含有1個ZF結構域。

對藜麥ZF-HD蛋白保守結構域氨基酸序列進行多重比對，發(fā)現(xiàn)ZF結構域由31～55個氨基酸組成，HD結構域由31～58個氨基酸組成，并且它們都有多個保守的氨基酸位點，HD結構域在藜麥ZF-HD家族中的保守性比ZF結構域更強 （圖4）。保守區(qū)域可能通過與其他DNA結合或互作，從而導致ZF-HD轉錄因子的功能多樣性。

2.5藜麥ZF-HD家族基因在鹽脅迫下的表達模式分析

為挖掘藜麥耐鹽相關ZF-HD基因，提供藜麥耐鹽遺傳改良基因資源，利用課題組前期完成的轉錄組數(shù)據(jù)，對ZF-HD家族基因在鹽脅迫下的表達模式進行分析。結果如圖5所示，藜麥ZF-HD家族基因在鹽脅迫處理后的表達模式存在差異，其中10個基因表達量未發(fā)生變化，即不參與對鹽脅迫的響應，11個基因表達量在不同處理時間發(fā)生不同程度的變化。與對照（0 h）相比，AUR62027848、AUR62008414和AUR62028772基因在各個時間點都呈上調(diào)表達，而AUR62004062、AUR62000606和AUR62023917則呈下調(diào)表達。鹽脅迫0.5 h時，AUR62019007和AUR62007575的表達量上調(diào)至最高值，在2.0 h和24.0 h時表達量有所下降并明顯低于對照，說明這2個基因可能迅速響應早期鹽脅迫。鹽脅迫下AUR62021682的表達量呈先降低后升高再降低的趨勢，在2.0 h時達到最高峰;AUR62039798和AUR62039796的表達量呈先降低后上升的趨勢，在24.0 h達到最大值。為驗證轉錄組數(shù)據(jù)的可靠性，課題組已對用于測序的樣品進行了qRT-PCR分析（圖6），結果表明兩者具有很強的相關性（R2=0.797 3），證明RNA-seq表達數(shù)據(jù)是可靠的[24]。同時，ZF-HD家族基因在鹽脅迫下呈現(xiàn)出的不同表達模式也說明它們在藜麥鹽響應過程中可能發(fā)揮著不同的作用。

3討論

土壤鹽分是干旱半干旱地區(qū)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的主要非生物脅迫之一，嚴重影響種子萌發(fā)、植物生長發(fā)育和作物產(chǎn)量[25-26]。據(jù)統(tǒng)計，約有8×108 hm2的土地（占世界土地總面積的6.5%）受到鹽脅迫的危害[27]。為了適應鹽脅迫，植物進化出了一系列的響應機制來提高其耐鹽性，包括復雜的生理特性、代謝和信號通路以及分子調(diào)控網(wǎng)絡等。隨著植物基因組測序的完成及全基因組數(shù)據(jù)庫的公布，越來越多的耐鹽基因被挖掘出來，其中鑒定和分析植物基因家族就是挖掘關鍵功能基因的一種有效手段。植物特異性ZF-HD基因編碼一個轉錄因子家族，該家族存在于陸生植物的主要類群中，包括維管植物和非維管植物，但在原核生物、綠藻和真菌中沒有發(fā)現(xiàn)。ZF-HD基因家族參與多種過程，包括植物發(fā)育和生理過程，以及對生物脅迫和非生物脅迫的抗性。目前，在擬南芥、水稻、玉米和棉花等多種植物中均已鑒定出ZF-HD基因家族，但關于藜麥ZF-HD基因家族的研究至今尚未見報道。在本研究中，我們鑒定并分析了藜麥ZF-HD基因的全基因組及其在鹽脅迫反應中的表達。

在藜麥ZF-HD基因家族中共鑒定出21個成員，其數(shù)量要多于模式植物擬南芥（17）和水稻（15），可能是因為基因組復制事件導致了異源四倍體物種藜麥ZF-HD基因的擴增。21個ZF-HD基因不均勻地分布在藜麥16條scaffold上，其編碼蛋白質的氨基酸數(shù)量和相對分子質量存在差異，并以堿性蛋白質居多?；蛲怙@子和內(nèi)含子結構的差異主要有3種機制，即外顯子或內(nèi)含子的獲得或丟失，外顯子化或假外顯子化和插入或缺失[28-29]。藜麥所有ZF-HD成員中，13個基因沒有內(nèi)含子，7個基因只有1個內(nèi)含子，1個基因具有3個內(nèi)含子，這種差異可能是上述3種機制參與所致。有研究結果表明，植物基因內(nèi)含子的數(shù)量越少，其對外界環(huán)境的適應性越強[30]。將擬南芥和藜麥的ZF-HD蛋白構建系統(tǒng)進化樹，38個ZF-HD轉錄因子劃分為5個亞家族，2種植物ZF-HD在每個亞家族均有分布，說明基因復制是植物基因組進化中基因家族擴增的主要驅動力。藜麥ZF-HD蛋白在結構上與其他物種是相似的，含有ZF和HD結構域，但在亞家族分布上也有不同之處，比如與擬南芥[1]和小麥[2]等植物相比，藜麥的MIF亞家族成員同樣只含有ZF結構域，而ZHD亞家族并非都同時含有ZF和HD結構域。氨基酸序列分析結果顯示，藜麥ZF和HD結構域都具有高度保守性，并且HD結構域的保守性更強一些，結構域中保守區(qū)域可能通過與其他DNA結合或互作，從而導致ZF-HD轉錄因子的功能多樣性。二級結構和亞細胞定位分析結果顯示，大部分ZF-HD成員中無規(guī)則卷曲占比最高，其次是延伸鏈，α-螺旋占比相對較少，其中3對同源基因不含α-螺旋;14個ZF-HD屬于胞質蛋白，分別有3個成員定位于細胞核和線粒體基質，1個定位于葉綠體基質，說明它們在參與藜麥生物學過程中可能發(fā)揮著不同的作用。

植物以一種復雜的方式響應鹽脅迫，涉及許多基因、蛋白質以及代謝和信號通路的協(xié)同功能與相互作用[31-32]?；虮磉_調(diào)控是植物應對和適應鹽脅迫的關鍵現(xiàn)象之一[33-35]。相關研究結果表明，ZF-HD在植物耐鹽脅迫中扮演著重要的角色[10， 17]。本研究利用課題組已經(jīng)完成的藜麥在300 mmol/L NaCl處理下不同時間點的高通量測序轉錄組數(shù)據(jù)，分析了所有ZF-HD基因在響應鹽脅迫的表達模式，發(fā)現(xiàn)10個成員不參與響應鹽脅迫，另外11個成員的表達量在不同處理時間呈現(xiàn)出不同變化，說明它們在藜麥響應鹽脅迫過程中發(fā)揮著不同的作用。AUR62027848、AUR62008414和AUR62028772基因在鹽處理0.5～24.0 h時表達量受到明顯誘導，這些基因可能在藜麥抵抗鹽脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。而AUR62004062、AUR62000606和AUR62023917為鹽敏感基因，鹽脅迫明顯抑制了其表達。AUR62019007和AUR62007575在鹽脅迫0.5 h時表達量較高，在脅迫后期顯著下降，說明這2個基因可在早期迅速響應鹽脅迫，可能直接受到鹽脅迫信號的誘導。關于ZF-HD在藜麥抵抗鹽脅迫中的功能及作用機理仍需要借助遺傳轉化手段進行驗證。

4結論

本研究對藜麥ZF-HD轉錄因子進行了全基因組鑒定，共獲得21個家族成員，劃分為5個亞家族，都具有典型的ZF或HD保守結構域。21個ZF-HD基因在鹽脅迫處理下呈現(xiàn)出不同的表達模式，推測不同ZF-HD家族基因在藜麥響應鹽脅迫過程中可能發(fā)揮著不同的作用。

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（責任編輯：張震林）

收稿日期：2021-07-11

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項目[CX（19）3116];江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（蔬菜）產(chǎn)業(yè)技術體系（鹽城）推廣示范基地項目[JATS（2020）205]

作者簡介：時丕彪（1989-），男，山東菏澤人，助理研究員，主要從事農(nóng)作物新品種選育及分子育種研究。（E-mail）1032175660@qq.com

通訊作者：顧閩峰，（E-mail）ycgmf@126.com