旋毛蟲預(yù)感染對小鼠急性脊髓損傷炎癥反應(yīng)的抑制作用*

徐常艷 王小莉 萬 晨 楊浩宇 邱 禹 許夢夢 吳宜修 常雪蓮 袁 圓 李徽徽 褚 亮 楊小迪

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽蚌埠 233030；2.感染與免疫安徽省重點實驗室，安徽蚌埠 233030；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，安徽蚌埠 233030)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是指由于各種原因?qū)е碌募顾柰耆虿煌耆珎?，最終造成病人完全或不完全性癱瘓(Eftekharpouretal., 2008)。SCI的病理過程分為急性期(0～7 d)、 亞急性期(7～14 d)和慢性期(>14 d)(Badhiwalaetal., 2021)。SCI病理進程分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷是外力直接或間接作用于脊髓所造成的機械性損傷(Kasinathanetal., 2015)，而繼發(fā)性損傷則是指脊髓組織對創(chuàng)傷所產(chǎn)生的包括局部水腫、缺血、缺氧、自由基積聚和炎癥反應(yīng)等一系列細胞和分子機制的改變(Okadaetal., 2018)。SCI后，炎癥反應(yīng)相關(guān)小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、抗體和細胞因子等對SCI病理進展產(chǎn)生重要影響(Rustetal., 2017)，也影響著繼發(fā)性損傷進程和損傷后的功能恢復(fù)程度，因此，減輕繼發(fā)性損傷引起的炎癥反應(yīng)成為SCI研究的重點之一。

旋毛蟲Trichinellaspiralis作為一種可在人體長期寄生的組織內(nèi)線蟲，可通過其排泄—分泌產(chǎn)物作用，抑制過度的免疫應(yīng)答及劇烈的炎癥反應(yīng)，修復(fù)蟲體在寄生過程中對機體造成的損傷，營造利于其長時間寄生的微環(huán)境(Whelanetal., 2012; Steinfelderetal., 2016; Coakleyetal., 2020)。有研究表明旋毛蟲感染可改善呼吸道合胞病毒誘導(dǎo)的炎癥性反應(yīng)(Chuetal., 2020)，本課題組前期亦證實，旋毛蟲及其衍生蛋白可顯著緩解小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎(Yangetal., 2014)、哮喘(Sunetal., 2019)、膿毒癥(李徽徽等, 2016; 楊小迪等, 2016; Lietal., 2021)，但旋毛蟲及其衍生蛋白是否對SCI有改善作用未見報道。本研究采用旋毛蟲預(yù)感染對急性SCI小鼠進行干預(yù)，檢測其預(yù)防效果并初步分析其作用機制，旨在為蠕蟲或蟲源性分子治療和預(yù)防SCI提供實驗基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及蟲株

SPF級C57BL/6小鼠(雌性，6～8周齡)，購自常州卡文斯實驗動物有限公司(SCXK(蘇)2016-0010)。雌性ICR小鼠，20～23 g/只，購自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司。(22±2)℃常溫環(huán)境，自由飲食，飼養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。河南豬源旋毛蟲株由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院崔晶教授惠贈，本實驗室經(jīng)ICR小鼠傳代保種。本研究獲得蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理審查委員會批準(倫理編號：倫動科批字[2021]第324號)。

1.2 主要試劑與材料

胃蛋白酶(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)、明膠(Sigma)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(Biosharp 公司)；Trizol (Thermo Fisher)；蘇木精伊紅染色試劑盒(碧云天)；4%多聚甲醛、石蠟和二甲苯(麥克林公司)；ELISA試劑盒購自上海達科為公司(IL-6、IL-10、TNF-α)和ABclonal公司(TGF-β)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo scientific)、實時熒光定量PCR試劑盒(Sangon Biotech)。

1.3 脊髓損傷動物造模

C57BL/6小鼠腹腔注射5%水合氯醛，充分麻醉后，切開皮膚和肌肉，暴露胸段棘突，咬除T9的椎板，暴露脊髓，通過夾持T7和T11棘突來穩(wěn)定脊柱，用直徑1.3 mm的鉆頭以合適的力度建立中度SCI模型。SCI后，止血、縫合各層組織(Chenetal., 2020)。假手術(shù)小鼠只打開椎板，不損傷脊膜及脊髓。術(shù)后小鼠置于暖光燈下復(fù)蘇，蘇醒后Basso小鼠評分(Basso mouse scale, BMS)標準評分0分，判斷為建模成功。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，每天早、晚擠壓膀胱協(xié)助排尿兩次，連續(xù)7 d給予小鼠皮下注射青霉素預(yù)防感染。

1.4 旋毛蟲肌幼蟲分離及實驗分組

取經(jīng)旋毛蟲感染的ICR小鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，去除小鼠的頭部、皮毛、內(nèi)臟和脂肪，分離出剩余肌肉后，用胃蛋白酶消化法消化，收集肌幼蟲，并混懸于4%明膠，定量計數(shù)后，以350條肌幼蟲經(jīng)口灌胃感染相應(yīng)組別實驗鼠。將C57BL/6小鼠隨機分為4組：A組為假手術(shù)組、B組為旋毛蟲預(yù)感染后14 d+假手術(shù)組、C組為脊髓損傷組、D組為旋毛蟲預(yù)感染后14 d+脊髓損傷組。

1.5 后肢運動功能檢測

分別于術(shù)后第7天，采用詳細的BMS標準，在曠場中對各組小鼠后肢功能進行評估。把小鼠放置在曠場中，提前熟悉環(huán)境10 min，觀察分析后打分，BMS是10分制(0～9)，0分代表后肢完全癱瘓，9分代表后肢運動功能正常，評分越高則表示小鼠后肢功能越健全(Bassoetal., 2006)。評分均采用雙人雙盲獨立觀察與記錄，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.6 樣本準備

1.6.1脊髓的提取：各組小鼠于術(shù)后7 d取材，小鼠乙醚麻醉后斷頭處死，剪開背部皮膚和肌肉，自損傷區(qū)向頭側(cè)和尾側(cè)各打開2～3個錐板，以損傷區(qū)為中心取1 cm脊髓置于無RNA酶的凍存管中，-80 ℃保存。

1.6.2血清的分離：各組小鼠于術(shù)后 7 d 實施眼球采血，將采集的血液置于潔凈干燥的1.5 mL離心管內(nèi)，待其自然凝固后，分離血清。將分離的血清分裝于無菌 EP 管內(nèi)，置于-80℃保存。

1.7 脊髓組織HE染色

經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察脊髓組織病理損傷程度，在切片上隨機選擇3個以上相同大小的視野，用image pro plus 6軟件計數(shù)HE染色切片中炎性細胞的數(shù)量(cells/mm2)，按炎性細胞數(shù)/組織面積求平均值。

1.8 脊髓組織總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和Real-time PCR檢測

脊髓總RNA提取依據(jù)試劑盒說明書操作，引物逆轉(zhuǎn)錄后，通過RT-PCR檢測各組小鼠脊髓組織中IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β mRNA的相對表達量。使用β-actin作為管家基因，所有引物如表1所示，采用20 μL體系(SYBR buffer 10 μL，正反向引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL)進行RT-PCR擴增，反應(yīng)條件為95℃3 min，95℃30 s，58℃30 s，72℃15 s，45個循環(huán)。

表1 引物序列信息

1.9 ELISA檢測血清炎癥因子

按ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測各組小鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β水平。酶標儀檢測450 nm處吸光度值，并計算各因子含量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 旋毛蟲預(yù)感染對急性脊髓損傷小鼠運動功能的影響

A和B組小鼠BMS行為學(xué)評分均為(9.00±0.00)分，SCI造模后第7天，C、D組小鼠BMS評分的平均分分別為(0.65±0.23)和(1.40±0.35)分。4組小鼠BMS評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與A組小鼠相比，C組小鼠 BMS 評分明顯降低(P均 <0.05)；D組小鼠BMS評分高于C組小鼠(P<0.05)，后肢癥狀明顯減輕(圖1)。

圖1 各組小鼠BMS評分

2.2 旋毛蟲預(yù)感染對急性脊髓損傷小鼠組織病理變化的影響

術(shù)后7 d，A和B組小鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)完整，無明顯炎癥細胞浸潤現(xiàn)象。C組小鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)明顯損傷，出現(xiàn)脊髓充血、水腫等現(xiàn)象，側(cè)索、背側(cè)及中央灰質(zhì)脊髓空洞增大，炎癥細胞浸潤增多。在旋毛蟲預(yù)感染后，D組小鼠與C組相比，脊髓組織病理損傷得到改善，背側(cè)白質(zhì)及中央灰質(zhì)組織破壞程度減小，炎癥細胞浸潤得到抑制(P<0.05)(圖2)。

圖2 各組小鼠脊髓組織病理學(xué)改變(HE染色)

2.3 旋毛蟲預(yù)感染對小鼠急性脊髓損傷組織中炎癥因子基因表達的影響

利用RT-PCR檢測脊髓組織中促炎因子IL-6和TNF-α的mRNA的表達情況，結(jié)果顯示：SCI組分別為(1.36 ± 0.09)和(1.88 ± 0.17)，較假手術(shù)組的(0.99 ± 0.05)和(1.01 ± 0.05)明顯升高(P<0.05)。經(jīng)旋毛蟲預(yù)感染干預(yù)后，T.spiralis+SCI組上述兩種促炎因子分別為(0.49 ± 0.12)和(0.69 ± 0.13)，較SCI組明顯降低(P<0.05)。檢測脊髓中抗炎細胞因子IL-10和TGF-β mRNA的表達情況，結(jié)果顯示：假手術(shù)組和SCI組的IL-10分別為(1.01 ± 0.09)和(1.06 ± 0.12)，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)；SCI組的TGF-β為(3.26 ± 0.42)，較假手術(shù)組(1.02 ± 0.08)顯著升高(P<0.05)。經(jīng)旋毛蟲預(yù)感染干預(yù)后，T.spiralis+ SCI組IL-10和TGF-β分別為(1.57 ± 0.14)和(4.55 ± 0.28)，較SCI組明顯升高(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組小鼠脊髓組織中炎癥因子mRNA的表達

2.4 旋毛蟲預(yù)感染對急性脊髓損傷小鼠血清中炎癥因子的影響

利用ELISA檢測血清中促炎因子IL-6和TNF-α的結(jié)果顯示：SCI組分別為(36.39 ± 3.32)和(90.41 ± 5.84)pg/mL，較假手術(shù)組的(23.00 ± 2.68)和(47.03 ± 1.89)pg/mL顯著升高(P<0.05)。經(jīng)旋毛蟲預(yù)感染干預(yù)后，T.spiralis+SCI組上述兩種促炎因子分別為(22.45 ± 1.82)和(43.83 ± 4.19)pg/mL，較SCI組明顯降低(P<0.05)。檢測血清中抗炎細胞因子IL-10和TGF-β的結(jié)果顯示：假手術(shù)組和SCI組的IL-10分別為(28.08 ± 1.06)和(28.41 ± 1.08)pg/mL，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，假手術(shù)組和SCI組的TGF-β分別為(21 984.56 ± 677.66)和(23 191.73 ± 783.52)pg/mL，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。經(jīng)旋毛蟲預(yù)感染干預(yù)后，T.spiralis+SCI組上述兩種抗炎細胞因子分別為(32.80 ± 2.18)和(35 189.79 ± 1 296.04)pg/mL，較SCI組明顯升高(P<0.05)(圖4)。

圖4 各組小鼠血清中炎癥因子的水平

3 討論

SCI是一個致殘率高、功能恢復(fù)差的疾病(Campagnoloetal., 2000; Wuetal., 2009)，可嚴重影響患者的生命健康和生活質(zhì)量，給患者家庭以及社會造成沉重的經(jīng)濟負擔(dān)(馬海萍等, 2013)。目前急性SCI主要采用外科減壓手術(shù)、神經(jīng)營養(yǎng)、激素治療及康復(fù)干預(yù)等臨床綜合治療，但由于脊髓損傷后其神經(jīng)再生能力弱,修復(fù)受損脊髓組織并使其實現(xiàn)功能正?；允悄壳搬t(yī)學(xué)難題，其治療效果并不理想(馮浩銘等, 2021; 趙興昌等, 2022)。因此，探索新型治療藥物或方法已成為脊柱外科的研究熱點之一。多項研究表明，旋毛蟲及其衍生蛋白可通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞增殖及巨噬細胞極化，降低促炎細胞因子釋放，促進抑炎因子分泌，顯著改善哮喘、炎癥性腸炎和實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎等疾病癥狀(Baietal., 2012; 丁憶晗等, 2016; Kangetal., 2019)。本研究通過旋毛蟲預(yù)感染觀察其對小鼠急性SCI修復(fù)效果，發(fā)現(xiàn)旋毛蟲預(yù)感染干預(yù)后SCI小鼠行為學(xué)BMS評分明顯升高，脊髓組織病理損傷有所改善，表明旋毛蟲預(yù)感染對小鼠急性SCI具有保護作用，這對于進一步研發(fā)旋毛蟲及其衍生物用于SCI治療提供了新思路。

脊髓損傷后外源性和內(nèi)源性有害物質(zhì)可通過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，局部和全身炎癥因子變化不僅可預(yù)測SCI的進展，對SCI康復(fù)預(yù)后同樣至關(guān)重要。IL-6可參與調(diào)節(jié)和刺激免疫細胞的生長，TNF-α是一種主要由小膠質(zhì)細胞表達的促炎因子，兩者被認為是SCI后潛在的炎癥反應(yīng)標記物(閔令霞等, 2021)。IL-10主要表達在單核細胞和調(diào)節(jié)性T細胞中，是重要的炎癥抑制因子。而TGF-β可參與Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞和Th17細胞的免疫調(diào)節(jié)作用(鄭晶晶等, 2012)。本研究分析了IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β在局部脊髓組織和血清中的表達水平，結(jié)果顯示旋毛蟲預(yù)感染對于正常小鼠幾乎無影響；與空白對照組相比，SCI造模小鼠脊髓組織和血清中促炎因子IL-6、TNF-α表達水平均升高，在血清中抑炎因子IL-10、TGF-β水平無明顯改變，表明SCI后炎癥細胞能分泌較多IL-6、TNF-α等，而IL-10、TGF-β等表達較少，支持了在SCI急性期促炎因子占主導(dǎo)地位，而抑炎因子表達較低，這也是導(dǎo)致SCI繼發(fā)性病理損傷的重要機制(Sunetal., 2016; Ahmedetal., 2018)。本研究發(fā)現(xiàn)在旋毛蟲感染干預(yù)后，與SCI組比較，脊髓局部和血清中IL-6和TNF-α水平明顯下降，IL-10和TGF-β水平顯著升高。結(jié)合行為學(xué)變化和病理組織改變，提示旋毛蟲預(yù)感染調(diào)控了小鼠SCI急性期炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β的產(chǎn)生水平，改善了損傷脊髓炎癥微環(huán)境，為SCI后修復(fù)創(chuàng)造了有利條件。

研究表明，在旋毛蟲感染后，不僅能引起宿主Th2型免疫應(yīng)答，同時也有Th1型免疫應(yīng)答的參與，是細胞免疫與體液免疫共同作用的結(jié)果，其可進一步調(diào)控機體炎癥因子的表達(茍強, 2014)。炎癥因子是重要的免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)，SCI后促炎因子和抗炎因子的表達差異可能是損傷區(qū)炎癥反應(yīng)擴大，進一步造成脊髓繼發(fā)免疫損傷的重要因素。適時局部或系統(tǒng)地調(diào)節(jié)不同炎癥因子的表達，進而調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)，對于減小繼發(fā)損傷促進SCI的修復(fù)有重要作用(Ferbertetal., 2017)。本研究表明旋毛蟲預(yù)感染可通過調(diào)控炎癥因子水平，對小鼠SCI急性期發(fā)揮保護作用，提示了旋毛蟲及其衍生蛋白具有治療炎癥性疾病的潛力。鑒于直接用旋毛蟲治療疾病具有安全性問題(陳玉瑩等, 2021)，旋毛蟲來源的抗炎活性分子的篩選和驗證仍有待于進一步探索。