利用Aag2細(xì)胞過表達(dá)體系篩選埃及伊蚊對(duì)DENV2易感相關(guān)免疫基因*

王 迪 謝曉雪 周新宇 趙 騰 郭曉霞 邢 丹 李春曉

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071)

登革熱被認(rèn)為是人類流行性最強(qiáng)和傳播最迅速的蚊媒病毒性疾病(Guzmanetal., 2015)。在過去的50年里，登革熱的發(fā)病率增加了30倍，世界上100多個(gè)國家50%以上的人口生活在有DENV感染風(fēng)險(xiǎn)的地區(qū)(Harapanetal., 2020)。隨著其傳播范圍、病例數(shù)量和病情嚴(yán)重程度的增加，登革熱已成為影響社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大公共衛(wèi)生問題。埃及伊蚊是登革病毒(dengue virus，DENV)的主要傳播媒介，它在城市中的擴(kuò)散促進(jìn)了登革熱疫情在整個(gè)熱帶和亞熱帶地區(qū)的暴發(fā)(Bhattetal., 2013)。因此，控制傳播媒介、切斷傳播途徑是防控登革熱疫情的重要措施。

DENV通常會(huì)導(dǎo)致人體出現(xiàn)病理性癥狀，而對(duì)埃及伊蚊不會(huì)產(chǎn)生明顯的病理性改變(Pattersonetal., 2016)。埃及伊蚊對(duì)DENV的媒介效能取決于其允許病毒在組織細(xì)胞中感染、復(fù)制和傳播的基因、分子和通路。DENV會(huì)使蚊蟲產(chǎn)生先天免疫反應(yīng)，從而改變其基因表達(dá)譜。因此，從其變化的基因入手，不僅可以研究DENV感染的免疫機(jī)制、闡明媒介效能的分子生物學(xué)機(jī)制，同時(shí)也可為靶向調(diào)控甚至阻斷病毒在蚊蟲體內(nèi)的復(fù)制和傳播提供理論基礎(chǔ)。鑒于埃及伊蚊的胚胎源性細(xì)胞系A(chǔ)ag2和蚊蟲個(gè)體的免疫特性相似，且可以持續(xù)維持DENV的復(fù)制，因此，Aag2細(xì)胞系是進(jìn)行蚊蟲感染DENV免疫研究的理想模型(Castillo-Méndezetal., 2020)。

根據(jù)抗原差異，DENV可以分為DENV1-4，4個(gè)血清型，其中DENV2比其他血清型更常見，可以引起更嚴(yán)重的登革熱大流行(Rico-Hesse, 2003)。本研究中，在前期埃及伊蚊感染DENV2后中腸和唾液腺轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析和Aag2細(xì)胞感染DENV2轉(zhuǎn)錄組分析的基礎(chǔ)上，篩選出12個(gè)可能與埃及伊蚊感染DENV2調(diào)控相關(guān)的基因。利用Aag2細(xì)胞構(gòu)建相應(yīng)基因的過表達(dá)體系，進(jìn)一步探究12個(gè)基因與DENV2感染的關(guān)系，尋找蚊蟲與病毒相互作用中可能涉及的免疫調(diào)節(jié)基因，為后續(xù)研究某種基因?qū)刂坪蜏p少蚊媒病毒在蚊蟲種群內(nèi)傳播以及對(duì)人類宿主的傳播提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Aag2細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞系，長期傳代培養(yǎng)，凍存于液氮罐中。DENV2由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供，保存于-80℃冰箱。SPF級(jí)1～2日齡昆明乳鼠和6～8周昆明雌鼠，為北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。所有程序均按照《動(dòng)物護(hù)理與使用指導(dǎo)原則》(GB/T 35892-2018)進(jìn)行，并經(jīng)病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。蚊蟲為?？谥臧＜耙廖?，由本實(shí)驗(yàn)室采集并長期傳代飼養(yǎng)。

PSL1180polyUBdsRED質(zhì)粒購自Addgene (Addgene plasmid # 49327)。目的基因表達(dá)量檢測引物為自行設(shè)計(jì)，交由北京六合華大基因科技有限公司合成。無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s Medium)和SDM培養(yǎng)基(Schneider′s Drosophila Medium)購自賽默飛世爾科技有限公司。轉(zhuǎn)染試劑FuGENE@6 Transfection Reagent(Promega，E2691)購自普洛麥格生物技術(shù)有限公司。TransScript? Green One-Step qRT-PCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。登革病毒Ⅱ型核酸免提取檢測試劑盒購自北京三目生物科技有限公司。

1.2 乳鼠鼠腦DENV2病毒懸液制備及滴度檢測

使用無菌注射器吸取DENV2懸液，從1～2日齡乳鼠腦顱眼睛到耳緣連線的中心點(diǎn)向腦顱方向注射0.01～0.02 mL，4～5 d發(fā)病后，將乳鼠解剖，左右腦組織分別放入EP管中，冷凍研磨儀60 Hz/45 s研磨2次，離心后收集上清放置-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

BHK-21細(xì)胞于10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)傳代培養(yǎng)(37 ℃, 5% CO2)。將BHK-21細(xì)胞傳至12孔板培養(yǎng)24 h形成單層細(xì)胞后，將DENV2懸液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋后感染BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)5 d后觀察。結(jié)晶紫和4%甲醛溶液按照14∶1混合，固定染色30 min。統(tǒng)計(jì)空斑數(shù)，計(jì)算病毒滴度，病毒滴度(PFU/mL)=(平均空斑數(shù)×空斑形成所在梯度)/0.1 mL(病毒懸液量)。

1.3 差異基因的篩選

在基因的選擇上，根據(jù)前期研究結(jié)果，首先根據(jù)感染DENV2的埃及伊蚊中腸和唾液腺轉(zhuǎn)錄組與未感染DENV2的蚊蟲中腸和唾液腺轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行對(duì)比的結(jié)果，篩選出10個(gè)基因表達(dá)差異倍數(shù)較大且調(diào)整P值<0.05的基因(表1)。其中，3個(gè)基因在唾液腺中表達(dá)下調(diào)，7個(gè)基因在唾液腺中表達(dá)上調(diào)；4個(gè)基因在中腸中表達(dá)下調(diào)，6個(gè)基因在中腸中表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，根據(jù)Aag2細(xì)胞感染DENV2轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果(Lietal., 2020)，同樣篩選出2個(gè)表達(dá)差異較大的基因(表1)。其中，1個(gè)基因在Aag2細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，1個(gè)基因在Aag2細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。將上述12個(gè)感染DENV2后變化較大的基因CDS片段分別構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒，得到可以進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染Aag2細(xì)胞使其能在幾天內(nèi)產(chǎn)生多個(gè)拷貝, 進(jìn)行高水平的表達(dá)，從而研究目標(biāo)基因?qū)ag2細(xì)胞感染DENV2的影響。

表1 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果篩選的12個(gè)差異基因

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建與提取

利用可表達(dá)紅色熒光蛋白的PSL1180polyUBdsRED質(zhì)粒構(gòu)建實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒載體。首先應(yīng)用Snapgene軟件采用雙酶切法(Tolmachov, 2009)加入增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)和嘌呤霉素兩個(gè)位點(diǎn)。將目的基因的CDS片段替換EGFP位點(diǎn)構(gòu)建為實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒，以未替換EGFP位點(diǎn)為對(duì)照質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)和對(duì)照質(zhì)粒設(shè)計(jì)由生工生物(上海)股份有限公司合成。質(zhì)粒提取參照說明書使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒進(jìn)行提取。

1.5 Aag2細(xì)胞過表達(dá)體系的構(gòu)建

埃及伊蚊Aag2細(xì)胞于10% FBS的SDM培養(yǎng)基中常規(guī)傳代培養(yǎng)(28 ℃, 5%CO2)。使用含2% FBS的SDM培養(yǎng)基將Aag2細(xì)胞洗脫并吹打混勻，采用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測細(xì)胞濃度，控制細(xì)胞懸液濃度為1×105cells/mL。十二孔板中每孔加入1 mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)3 d使其貼壁牢固。使用轉(zhuǎn)染試劑FuGENE@6 Transfection Reagent進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，十二孔板每孔細(xì)胞最佳轉(zhuǎn)染體系：質(zhì)粒，1 μg(根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)提取的質(zhì)粒濃度換算)；Transfection Reagent 8 μL；Opti-MEM培養(yǎng)液補(bǔ)足至50 μL。每組4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以含有EGFP的質(zhì)粒為陰性對(duì)照，培養(yǎng)(28 ℃, 5%CO2)24 h后，在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。

1.6 Aag2細(xì)胞感染DENV2及取樣

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，將乳鼠鼠腦擴(kuò)增的DENV2懸液稀釋到合適比例使得MOI為0.1直接加入細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞感染后2、4、6 d取樣，將每孔的細(xì)胞洗脫并混勻，使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)每孔細(xì)胞計(jì)數(shù)。2 000 r/min，5 min離心后將上清轉(zhuǎn)移至新EP管，細(xì)胞沉淀中加入1 mL Trizol保存。

1.7 細(xì)胞中目的基因表達(dá)量的定量檢測

在每個(gè)細(xì)胞沉淀樣品中加入5～7顆研磨珠，60 Hz/45 s，研磨2次。常溫反應(yīng)5 min，使其完全裂解，離心后將液體轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中，加入0.2 mL氯仿，充分混勻反應(yīng)2～3 min，離心后將上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入等體積冷凍的異丙醇0.5 mL，反應(yīng)10 min小心吸除上清液，加入1 mL 75%乙醇懸液沉淀，輕微振動(dòng)，離心后小心倒出上清在生物安全柜中干燥約10 min。加入100 μL RNase-free water溶解RNA，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用TransScript? Green One-Step qRT-PCR SuperMix進(jìn)行定量檢測。反應(yīng)體系：2×PerfectStartTMGreen One-Step qPCR SuperMix，10 μL；TransScript? Green One-Step RT/RI Enzyme Mix，0.4 μL；Forward Primer(表2，10 μmol/L)，0.4 μL；Reverse Primer(表2，10 μmol/L)，0.4 μL；Passive Reference Dye(50×)，0.4 μL；RNA模板，2 μL；Nuclease-free Water，補(bǔ)足至20 μL。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(QuantStudio 7 Flex)進(jìn)行定量檢測，反應(yīng)程序：45 ℃，5 min；94 ℃，30 s；94 ℃，5 s，60 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品做3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.8 細(xì)胞上清液中病毒載量檢測

按照說明書用登革病毒Ⅱ型核酸免提取檢測試劑盒檢測病毒含量，該試劑盒選用登革Ⅱ型病毒特異性的保守區(qū)域作為檢測靶基因，設(shè)計(jì)熒光檢測的特異性引物Forward Primer(5’-A A T T A G A G A G C A G A T C T C T G A T G AA-3’)、Reverse Primer(5’-A G C A T T C C A A G T G A G A A T C T C T T T GT-3’)、探針(Taqman探針：FAM-A G C T G T T G C A C A G T T G A C A C G CG-BHQ1)。反應(yīng)體系：2×登革病毒Ⅱ型擴(kuò)增反應(yīng)液，10 μL；登革病毒Ⅱ型引物及探針混合液，1 μL；RT-PCR酶混合液，0.5 μL；細(xì)胞上清液，4 μL；雙蒸水，補(bǔ)足至20 μL。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(QuantStudio 7 Flex)進(jìn)行定量反應(yīng)，反應(yīng)條件(Reporter: FAM, Quencher: None)：50 ℃，10 min；95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.9 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2019處理數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS軟件獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，對(duì)目的基因的表達(dá)量、細(xì)胞上清中DENV2拷貝數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 Aag2過表達(dá)體系的建立

通過分別構(gòu)建含有12個(gè)基因的質(zhì)粒載體，使用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)在Aag2細(xì)胞中建立目標(biāo)基因的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過表達(dá)模型。在將構(gòu)建好的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)Aag2細(xì)胞中后，利用熒光顯微鏡對(duì)插入的質(zhì)粒表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果中，EGFP對(duì)照組在熒光顯微鏡下顯示出紅色、綠色兩種熒光，目的基因組只顯示出紅色熒光(圖1)，表示已經(jīng)構(gòu)建的轉(zhuǎn)染質(zhì)?？梢栽贏ag2細(xì)胞成功表達(dá)。

圖1 質(zhì)粒在Aag2細(xì)胞中表達(dá)的熒光效果圖

驗(yàn)證了帶有目的基因的表達(dá)載體可以在Aag2細(xì)胞中表達(dá)之后，為進(jìn)一步驗(yàn)證此表達(dá)體系在細(xì)胞染毒或未染毒的狀態(tài)下都可以使目的基因的表達(dá)量顯著上升，本研究設(shè)計(jì)了每一段目的基因的引物(表2)，在構(gòu)建過表達(dá)體系后，感染DENV2的2、4、6 d時(shí)分別檢測各組目的基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，對(duì)于各組目的基因的過表達(dá)體系建立之后，無論是未染毒組(圖2)還是染毒組(圖3)，相比于EGFP組，帶有目的基因的組別相應(yīng)基因的表達(dá)量均有明顯提升，其比值log10FC(Fold Change，倍數(shù)差異)值均大于0。因此，所有的過表達(dá)體系細(xì)胞在染毒或未染毒的狀態(tài)下，在6 d之內(nèi)均能保持目的基因的過表達(dá)狀態(tài)。

表2 過表達(dá)基因的驗(yàn)證引物

圖2 Aag2細(xì)胞過表達(dá)體系12個(gè)基因表達(dá)(n=4)

圖3 Aag2細(xì)胞過表達(dá)體系感染DENV2時(shí)12個(gè)基因表達(dá)情況

此外，由于Aag2細(xì)胞感染病毒實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞數(shù)量會(huì)顯著影響到最終的病毒載量，為了保證后續(xù)Aag2細(xì)胞感染病毒實(shí)驗(yàn)中，不會(huì)因?yàn)閹в斜磉_(dá)載體的細(xì)胞生長速度出現(xiàn)變化而造成假陽性結(jié)果，本研究分別對(duì)在構(gòu)建過表達(dá)體系后，感染DENV2的2、4、6 d進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，過表達(dá)體系建立后，無論是感染病毒組還是未感染病毒組，過表達(dá)目的基因的Aag2細(xì)胞密度相對(duì)于EGFP組Aag2細(xì)胞密度的比值都約為1，說明過表達(dá)目的基因組與EGFP組對(duì)比細(xì)胞增殖并沒有出現(xiàn)明顯的異常(圖4、5)。因此，所有的過表達(dá)體系細(xì)胞在感染病毒或未感染病毒的狀態(tài)下，在6 d之內(nèi)細(xì)胞生長速率不會(huì)對(duì)最終病毒載量結(jié)果產(chǎn)生過大的干擾。

圖4 Aag2細(xì)胞過表達(dá)體系細(xì)胞密度差異

圖5 Aag2細(xì)胞過表達(dá)體系感染DENV2時(shí)細(xì)胞密度差異

2.2 目的基因過表達(dá)對(duì)Aag2細(xì)胞上清中DENV2載量的影響

在相應(yīng)基因過表達(dá)的狀態(tài)下使Aag2細(xì)胞感染DENV2，在2、4、6 d測量細(xì)胞上清中病毒載量，以探究這些基因Aag2細(xì)胞感染DENV2過程中可能發(fā)揮的作用。結(jié)果顯示，在2 d時(shí)，ID為110677901、5563788、5566270、5564804的基因過表達(dá)后細(xì)胞上清液中DENV2 RNA拷貝數(shù)相較于過表達(dá)EGFP對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，目的基因組log10DENV2 RNA拷貝數(shù)/EGFP對(duì)照組log10DENV2 RNA拷貝數(shù)計(jì)算得FC值在0.787～0.954之間。在4 d時(shí)，ID為5570528、5566270、5564804的基因過表達(dá)后細(xì)胞上清液中DENV2 RNA拷貝數(shù)相較于過表達(dá)EGFP對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)C值在0.910～1.169之間。在6 d時(shí)，ID為5570528、5567680、5566849、110677901、5566270的基因過表達(dá)后細(xì)胞上清液中DENV2 RNA拷貝數(shù)相較于過表達(dá)EGFP對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)C值在0.787～1.066之間(表3)?？傮w來看，ID為5570528、110677901、5566270 的3個(gè)基因在Aag2細(xì)胞中過表達(dá)后，在6 d之內(nèi)其組別的病毒載量相較于EGFP對(duì)照組均有顯著的降低。

表3 目的基因過表達(dá)后細(xì)胞上清液中DENV2 RNA拷貝數(shù)差異統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 討論

目前，人們對(duì)昆蟲的病毒感染傳播相關(guān)機(jī)制已進(jìn)行了一系列的研究，蚊蟲感染蟲媒病毒后會(huì)產(chǎn)生先天免疫反應(yīng)，產(chǎn)生一系列病原體宿主相互作用，例如，在節(jié)肢動(dòng)物中，先天免疫通過抗菌肽等效應(yīng)分子的產(chǎn)生，吞噬、包埋、分泌等物理屏障和黑化作用(Messinaetal., 2014)，在抑制病原體感染方面發(fā)揮重要作用。岡比亞按蚊Anophelesgambiae感染病毒后誘導(dǎo)激活的18個(gè)基因中包括一種70 kDa的熱休克蛋白因子，該因子后來被證明可影響病毒在蚊媒中復(fù)制的能力(Simetal., 2007)。然而，蚊蟲感染病毒后很多調(diào)控激活的分子機(jī)制以及其他例如吞噬、自噬、蛋白水解等多方面與病毒調(diào)控有關(guān)的機(jī)制尚不清楚(Alonso-Palomaresetal., 2018)。

本文通過構(gòu)建Aag2細(xì)胞的過表達(dá)體系，研究12個(gè)基因過表達(dá)對(duì)Aag2細(xì)胞感染DENV2的載量變化。結(jié)果篩選出3個(gè)在蚊蟲感染DENV2時(shí)，可能與蚊蟲免疫相關(guān)的基因。其中，基因ID 110677901編碼蛋白為蛻皮激素20單加氧酶(ecdysone 20-monooxygenase)，是一種和昆蟲生長發(fā)育、蛻皮與繁殖相關(guān)的酶，是蛻皮激素(ecdysone)轉(zhuǎn)化為20-羥基脫皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)酶系統(tǒng)中的關(guān)鍵物質(zhì)(Smithetal., 1983)。蛻皮激素是一種昆蟲內(nèi)的類固醇激素(Smithetal., 1979)，是全變態(tài)昆蟲蛻皮和繁殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是幼蟲蛹發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期的主要血淋巴蛻皮甾體。20-羥基脫皮酮?jiǎng)t是蛻皮激素經(jīng)轉(zhuǎn)化后變成的一種更具有生物活性的形式，它們對(duì)發(fā)育、蛻皮和變態(tài)至關(guān)重要(Matsushimaetal., 2019)?；騃D 5570528編碼的蛋白為羥基類固醇脫氫酶樣2(hydroxysteroid dehydrogenase-like protein 2，HSDL2)，是一種含甾醇載體蛋白2(sterol carrier protein 2，SCP2)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，定位于過氧化物酶體，調(diào)節(jié)脂肪酸合成(Ruokunetal., 2016)。在哺乳動(dòng)物內(nèi)HSDL2的代謝異常與腫瘤相關(guān)，相關(guān)組織癌細(xì)胞中的HSDL2往往表現(xiàn)出上調(diào)，人為下調(diào)或敲除HSDL2后細(xì)胞的增殖會(huì)受到抑制甚至凋亡(Sunetal., 2018; Jiaetal., 2019)?；騃D 5566270 編碼的蛋白為3β-羥基類固醇脫氫酶(3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase)，是一種非常重要的酶，催化了所有類固醇激素生物合成的重要一步(Simardetal., 1995)，蛻皮激素就是一種類固醇激素，因此3β-羥基類固醇脫氫酶的上調(diào)可能也與20-羥基脫皮酮的合成相關(guān)聯(lián)。

本研究通過埃及伊蚊和Aag2細(xì)胞感染DENV2的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果和Aag2細(xì)胞的過表達(dá)體系驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)篩選出了3個(gè)不同的基因，這3個(gè)基因可能都與20-羥基脫皮酮的調(diào)節(jié)有關(guān)。在迄今為止的大多數(shù)昆蟲中，已證明蛻皮激素20單加氧酶活性在胚胎后發(fā)育期間波動(dòng)劇烈，表明蛻皮激素20單加氧酶在胚胎后發(fā)育中起著關(guān)鍵作用(Horikeetal., 1999)。另外，在近期的一些報(bào)道中20-羥基脫皮酮可以促進(jìn)昆蟲的先天免疫反應(yīng)(Sunetal., 2016)，例如，20-羥基脫皮酮可以促進(jìn)宿主細(xì)胞和動(dòng)物中免疫相關(guān)基因的表達(dá)，特別是AMP基因的表達(dá)(Smithetal., 1983)，20-羥基脫皮酮還可以促進(jìn)昆蟲的細(xì)胞免疫，如誘導(dǎo)岡比亞按蚊細(xì)胞系酚氧化酶的表達(dá)(Ahmedetal., 1999)，注射20-羥基脫皮酮提高果蠅漿細(xì)胞的吞噬活性等等(Lanotetal., 2001)。這提示蚊蟲在感染DENV2時(shí)可能會(huì)激活與20-羥基脫皮酮相關(guān)的先天免疫過程，因此在蚊蟲感染DENV2時(shí)，20-羥基脫皮酮介導(dǎo)的先天免疫過程可能是蚊蟲非常重要的調(diào)控機(jī)制之一。