三七總皂苷-TCP骨修復(fù)復(fù)合材料的生物相容性評(píng)價(jià)*

康 樂 陳 萍 陳仲華 區(qū)文歡 司徒堅(jiān) 劉 彥 廖志鵬

廣東省江門市五邑中醫(yī)院 暨南大學(xué)附屬江門中醫(yī)院 529000

臨床上由于外部創(chuàng)傷和并發(fā)感染等原因引發(fā)的骨缺損、骨不連和延遲愈合等問(wèn)題給患者帶來(lái)較大不便，其治療也是骨科醫(yī)生面對(duì)的棘手問(wèn)題[1]。目前，骨移植材料主要來(lái)自自體骨、同種異體骨以及異種骨三種材料，但三種材料均存在一定程度的缺點(diǎn)，在應(yīng)用上頗為受限[2]，近年來(lái)，隨著再生組織工程學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于生物材料為載體的骨組織工程修復(fù)技術(shù)取得長(zhǎng)足進(jìn)步，本研究前期成功制備了一類新型的載藥仿生骨修復(fù)支架材料，主要由成骨誘導(dǎo)因子三七總皂苷與磷酸三鈣(TCP)生物涂層組合形成，TCP材料克服了以往由聚乳酸、殼聚糖代表的高分子材料所具有的力學(xué)性能較低，以及羥基磷狄石陶瓷等為陶瓷韌性較差等缺點(diǎn)[3]，同時(shí)三七總皂苷主要來(lái)源于中藥三七，現(xiàn)代藥理學(xué)結(jié)果顯示，三七總皂苷可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，同時(shí)增強(qiáng)骨折缺血組織供血能力，進(jìn)而促進(jìn)愈合[4]。基于此，為了深入研究三七總皂苷-TCP骨修復(fù)復(fù)合材料在臨床應(yīng)用的可行性，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞增殖速度、生化指標(biāo)和細(xì)胞形態(tài)等多方面探討材料的生物相容性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 6月齡山羊1只(上海甲干生物科技有限公司)，胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，胰蛋白酶，青霉素—鏈霉素(美國(guó)Gibco公司)；噻唑藍(lán)(MTT，美國(guó)Sigma公司)，骨鈣素和堿性磷酸酶ELISA檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，三七總皂苷(西安百川生物科技公司)，S-3000N 掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)，CKX41倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2 方法

1.2.1 三七總皂苷-TCP骨修復(fù)復(fù)合材料制備。將三七總皂苷溶于無(wú)水乙醇。隨后在30%的Na2HPO4溶液中400℃條件下浸泡10h，去離子水沖洗10min，真空干燥，隨后將三七總皂苷無(wú)水乙醇溶液與Na2HPO4·12H2O(23.75g/L)和Ca(NO3)2(18.2g/L)溶液中70℃條件下作用48h，用4%NaOH 去離子水飽和浸泡三七總皂苷8h，隨后用去離子反復(fù)清洗飽和三七總皂苷溶液至中性，冷凍干燥得到三七總皂苷-TCP復(fù)合材料。按照此方法制備載藥量分別為200、100、50、25、12.5μg/ml的三七總皂苷-TCP復(fù)合材料，對(duì)照組僅采用單純TCP，不加入三七總皂苷，亦不用含飽和三七總皂苷的溶劑浸洗。

1.2.2 山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)。取6月齡山羊1只，采用戊巴比妥鈉麻醉，應(yīng)用16號(hào)骨穿針行髂骨穿刺，吸取骨髓5ml，加等量含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，2 000r/min離心5min，吸除上層脂肪層，隨后移取至100cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)5d至細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行傳代，取第2代細(xì)胞分別經(jīng)堿性磷酸酶和油紅O染色鑒定為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 掃描電鏡。三七總皂苷-TCP骨修復(fù)復(fù)合材料約4mm×3mm大小，經(jīng)干燥后表面噴金，S-3000N掃描電子顯微鏡觀察其表面形態(tài)。

1.2.4 MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖。取消毒過(guò)的三七總皂苷-TCP骨修復(fù)復(fù)合材料1.5g，眼科剪剪成碎末狀，置于成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基含40ng/ml地塞米松，10ng/ml轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，100ng/ml胰島素樣生長(zhǎng)因子-1；無(wú)血清培養(yǎng)，用20μm微孔濾膜過(guò)濾，加胎牛血清1.5ml，分別配成含200、100、50、25、12.5μg/ml材料浸提液。山羊BMSCs細(xì)胞接種至24孔板，待細(xì)胞貼壁，加入100μl材料浸提液繼續(xù)培養(yǎng)，每孔分別于第1、3、5、7天四個(gè)時(shí)間點(diǎn)加入20μl MTT溶液，離心棄液，加入DMSO 150μl，振蕩混勻5min，用酶標(biāo)儀在570/630nm處測(cè)定吸光度(A)。

1.2.5 ELISA檢測(cè)骨鈣素和堿性磷酸酶含量。取經(jīng)不同濃度材料處理過(guò)并已培養(yǎng)7d的山羊BMSCs細(xì)胞，1 000r/min離心10min，去上清，PBS漂洗3遍，離心去上清，參照試劑盒說(shuō)明測(cè)定細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(OCN)含量。

2 結(jié)果

2.1 不同載藥量三七總皂苷-TCP復(fù)合材料的掃描電鏡觀察 仿生構(gòu)建的三七總皂苷-TCP復(fù)合材料孔隙率適宜，孔隙相互聯(lián)通，孔徑均勻一致，均約為150μm，此空間結(jié)構(gòu)適合細(xì)胞生長(zhǎng)；載三七總皂苷劑量大小對(duì)TCP復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響，結(jié)構(gòu)相似。詳見圖1。

a b c

2.2 三七總皂苷-TCP復(fù)合材料對(duì)細(xì)胞增殖影響 山羊 BMSCs在三七總皂苷-TCP復(fù)合材料浸提液中正常生長(zhǎng)，增殖良好，5個(gè)濃度組與對(duì)照組的增殖率存在顯著性差異(P<0.05)。隨著三七總皂苷-TCP浸提液濃度的增大，山羊BMSCs的增殖率越高，并呈時(shí)間—?jiǎng)┝恳蕾囆?yīng)(P<0.05)。詳見表1。

表1 三七總皂苷-TCP復(fù)合材料對(duì)細(xì)胞增殖率影響

2.3 三七總皂苷-TCP復(fù)合材料對(duì)ALP和OCN的影響 隨著三七總皂苷含藥濃度增高，ALP和OCN含量依次明顯增加，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)(P<0.05)，詳見表2。

表2 三七總皂苷-TCP復(fù)合材料對(duì)ALP和OCN影響

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明三七總皂苷可誘導(dǎo)體外條件培養(yǎng)的間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，具有促進(jìn)骨折愈合的功效[5]。因此，三七總皂苷作為種骨誘導(dǎo)活性因子為用于骨組織工程研究提供了理論基礎(chǔ)。

隨著仿生學(xué)的發(fā)展，模擬新骨生長(zhǎng)過(guò)程的復(fù)合材料逐漸得到應(yīng)用，現(xiàn)有研究表明，TCP材料具有疏松多孔的表層，為植入體內(nèi)的骨長(zhǎng)入提供了良好的物理結(jié)構(gòu)，同時(shí)生物相容性較好，可在體內(nèi)誘導(dǎo)骨生成，促進(jìn)愈合，目前已在骨修復(fù)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[6]。近年來(lái)，基于生物材料聯(lián)合成骨誘導(dǎo)活性因子的骨修復(fù)策略愈發(fā)受到關(guān)注。根據(jù)本研究前期細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最大載藥量可達(dá)200mg，其對(duì)材料的孔隙結(jié)構(gòu)不發(fā)生顯著干擾，因此本研究制備了載5種不同劑量的三七總皂苷-TCP復(fù)合材料，同時(shí)采用的最大載藥量為200mg，電鏡掃描的載藥材料的結(jié)果顯示，載藥劑量對(duì)材料的密度、孔隙率和孔徑的影響甚小，因此可以判斷不高于200mg的載藥量對(duì)三七總皂苷-TCP材料的空間結(jié)構(gòu)不會(huì)造成實(shí)質(zhì)影響。從細(xì)胞相容性來(lái)看，采用材料浸提液培養(yǎng)第二代山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞7d，單純TCP材料未抑制細(xì)胞增殖，表明該材料本身具有較高的安全性；載三七總皂苷材料明顯促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，且具有時(shí)間和劑量效應(yīng)，其原因主要是三七總皂苷的骨誘導(dǎo)活性因子發(fā)揮作用，可促進(jìn)骨細(xì)胞增殖和分化，同時(shí)由于TCP材料成分主要是無(wú)機(jī)鈣，其隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降解，在細(xì)胞局部形成高鈣環(huán)境，為期增殖提供鈣源，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖以及分化成熟，因此，三七總皂苷-TCP復(fù)合材料可協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞增殖，增進(jìn)骨愈合。堿性磷酸酶可直接反映成骨細(xì)胞的活性或功能狀況，是反映成骨細(xì)胞活性和數(shù)量的專一標(biāo)志物，是目前最常用的評(píng)價(jià)骨形成和骨轉(zhuǎn)換的指標(biāo)[7]。骨鈣素又稱骨R-羥基谷氨酸蛋，在調(diào)節(jié)骨鈣代謝中起重要作用，能夠參與人體骨骼的新陳代謝，是研究骨代謝的一項(xiàng)新的生化標(biāo)志物[8]。本研究結(jié)果顯示堿性磷酸酶和骨鈣素的含量具有劑量效應(yīng)關(guān)系，也可進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞增殖旺盛，促進(jìn)向骨細(xì)胞分化，綜上來(lái)看，三七總皂苷-TCP復(fù)合材料同時(shí)可協(xié)同發(fā)揮促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和成熟[9]。

綜上所述，通過(guò)原位復(fù)合技術(shù)可構(gòu)建出具有三維空間結(jié)構(gòu)和要求的三七總皂苷-TCP復(fù)合材料，該材料生物相容性良好，為下一步開展的體內(nèi)成骨實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。