利用CRSPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制抗稻瘟病香型早秈溫敏核不育系

梁敏敏 張華麗 陳俊宇 戴冬青 杜成興 王惠梅 馬良勇

利用CRSPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制抗稻瘟病香型早秈溫敏核不育系

梁敏敏#張華麗#陳俊宇 戴冬青 杜成興 王惠梅 馬良勇*

（中國(guó)水稻研究所水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家水稻改良中心，杭州 310006，#共同第一作者；*通信聯(lián)系人, E-mail: maliangyong@caas.cn）

【目的】創(chuàng)制新型抗稻瘟病香型早秈溫敏核不育系，為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雜交水稻選育提供資源?！痉椒ā坷肅RISPP/Cas9技術(shù)在水稻稻瘟病基因、溫敏不育基因和香味基因的第1外顯子處設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)，構(gòu)建多基因表達(dá)載體pC1300-2×35S::g-g-g，轉(zhuǎn)化優(yōu)質(zhì)常規(guī)秈稻品種中早70，測(cè)序鑒定分析獲得純合陽性穩(wěn)定株系。利用稻瘟病噴霧接種和打孔接種方法對(duì)稻瘟病基因的純合突變株系進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定，利用GC-MS技術(shù)對(duì)純合突變株系的香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量進(jìn)行測(cè)定?！窘Y(jié)果】在T0轉(zhuǎn)基因株系中，、和突變頻率分別為87.5%、80.0%和87.5%，突變類型多為雙等位突變。從T1代中篩選不含載體骨架的純合突變株系，獲得兩種三突變純合株系。稻瘟病接種結(jié)果表明，與野生型相比，T2代純合變異株系的抗性顯著提高。同時(shí)，接種后純合突變體株系內(nèi)相關(guān)防衛(wèi)基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，ROS積累量也顯著增加。純合變異株系表現(xiàn)出典型的溫敏不育特性，基因的表達(dá)水平與野生型相比顯著降低，高溫下Ub4基因的表達(dá)水平明顯高于野生型。與野生型相比，在純合突變體植株中的表達(dá)水平顯著下調(diào)，并且香味物質(zhì)2-AP含量極顯著增加?！窘Y(jié)論】利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功對(duì)和基因同時(shí)進(jìn)行定向編輯，獲得了具有高抗稻瘟病的香型溫敏不育系，為高抗、香型不育系材料的選育提供參考，加快高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雜交水稻的選育。

水稻；CRISPR/Cas9；；；

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量與糧食安全密切相關(guān)[1]。與常規(guī)稻相比，雜交稻增產(chǎn)10%～20%[2-4]。雜交水稻的育種方法主要包括兩系法和三系法，兩系法相比于三系法具有簡(jiǎn)化育種和制種程序的優(yōu)勢(shì)[5]，利用兩系法育成的兩系雜交稻組合近幾年推廣面積快速增長(zhǎng)。但目前已育成的水稻兩系不育系中優(yōu)質(zhì)香型仍然比較少，尤其是適應(yīng)當(dāng)前市場(chǎng)需求、品質(zhì)優(yōu)良、抗性好且具有香味的兩系早稻不育系尚未見報(bào)道。

水稻兩系不育系可分為光敏核不育系(photoperiod-sensitive genic male sterile line, PGMS）和溫敏核不育系（thermo-sensitive genic male sterile line, TGMS），目前已經(jīng)有多個(gè)兩系不育系相關(guān)基因被克隆報(bào)道，如溫敏不育基因～和光周期敏感不育基因～{Zhou, 2016 #624;陳日榮, 2020 #626}[2, 6-10]。其中，溫敏雄性不育基因應(yīng)用最為廣泛，在我國(guó)兩系育種中有著非常重要的地位[11, 12]。編碼一個(gè)保守的RNA酶ZS1，能在不同溫度下降解3個(gè)泛素核糖體L40融合蛋白基因(Ub)的mRNA，保持Ub轉(zhuǎn)錄水平的平衡[12]。近年來，利用CRSIPR/Cas9技術(shù)編輯基因獲得了多個(gè)溫敏雄性不育材料，大大加速了兩系不育系的選育進(jìn)程[2, 11, 13, 14]。

水稻的香味性狀為衡量大米品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，是水稻品質(zhì)改良的重要內(nèi)容。研究表明，稻米的香味主要來源于揮發(fā)性物質(zhì)2-乙?；?1-吡咯啉（2-AP）[15]，受第8染色體的基因調(diào)控[16]。當(dāng)發(fā)生突變時(shí)，香味物質(zhì)2-AP大量積累，稻米產(chǎn)生香味[17]。利用CRSIPR/Cas9技術(shù)，對(duì)水稻香味基因進(jìn)行編輯，能夠獲得具有香味的水稻材料。

稻瘟病是水稻生產(chǎn)上危害最為嚴(yán)重的病害之一，稻瘟病菌生理小種極易發(fā)生變異，培育具有持久抗性的水稻品種具有重要意義。目前，已有35個(gè)水稻稻瘟病抗性基因被克隆[18-21]。其中，是隱性的抗病基因位點(diǎn)，編碼一個(gè)富含脯氨酸的蛋白，其突變后表現(xiàn)出非小種特異性的持久型抗性[22]。基于CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行編輯，能夠增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性，上調(diào)防御機(jī)制相關(guān)基因的表達(dá)[23-26][14]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是繼轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）技術(shù)和鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)之后的新一代基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，利用CRISPR/Cas9技術(shù)可對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行插入或者刪除式的基因敲除[27]。自2013年以來，CRISPR /Cas9編輯系統(tǒng)作為植物遺傳改良的有效途徑，在包括小麥、玉米、水稻等作物在內(nèi)的植物研究領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越多，極大地提高了育種效率[28, 29]。

本研究以優(yōu)質(zhì)常規(guī)早秈稻品種中早70為研究材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻稻瘟病基因、溫敏不育基因和香味基因同時(shí)進(jìn)行編輯，高效獲得高抗稻瘟病的香型優(yōu)質(zhì)早稻兩系不育系，為水稻育種提供了有利的中間材料，有望助力優(yōu)質(zhì)雜交稻的選育。

1 材料與方法

1.1 水稻材料及種植條件

遺傳轉(zhuǎn)化受體材料中早70為中國(guó)水稻研究所早稻育種課題組選育的優(yōu)質(zhì)早秈常規(guī)稻品系，全生育期112 d左右，產(chǎn)量與對(duì)照中早35相當(dāng)，米質(zhì)達(dá)部頒優(yōu)質(zhì)米二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

遺傳轉(zhuǎn)化所獲得的轉(zhuǎn)基因材料種植于中國(guó)水稻研究所富陽基地轉(zhuǎn)基因指定種植區(qū)和溫室中，栽插密度為20cm×20 cm，常規(guī)水肥管理。用于不育系鑒定的冷水池溫度為23℃。

1.2 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

利用CRISPR-GE網(wǎng)站（http://skl.scau.edu.cn/ targetdesign/）進(jìn)行g(shù)RNA靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)，靶位點(diǎn)的特異性通過Cas-OFFinder（http://www.rgenome.net/ cas-offinder/）分析和水稻基因組BLAST分析驗(yàn)證，分別在、和的第1外顯子上設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)序列（附表1）。載體構(gòu)建的方法參照沈蘭等[30]，構(gòu)建好的多基因表達(dá)載體經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后交由武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。表達(dá)載體pC1300-Cas9和SK-gRNA中間載體由中國(guó)水稻研究所王克劍研究員惠贈(zèng)。

1.3 T0代靶位點(diǎn)檢測(cè)

為檢測(cè)、和靶位點(diǎn)突變情況，在靶點(diǎn)的5′端和3′端分別設(shè)計(jì)測(cè)序引物（附表1）。利用TPS方法[31]提取T03葉期葉片DNA，用特異性引物分別擴(kuò)增、和靶點(diǎn)及附近序列，PCR產(chǎn)物送尚亞公司測(cè)序。以中早70基因組序列作為參照，利用在線軟件DSDecode（http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/）分析測(cè)序結(jié)果[32]。

1.4 T1代純合突變株的篩選

提取T1植株3葉期的葉片DNA，利用測(cè)序引物篩選出3個(gè)基因均純合的T1代突變植株，自交收種獲得T2代，用于性狀觀察及鑒定。

1.5 T2代農(nóng)藝性狀考查

對(duì)T2代純合突變體抽穗期性狀進(jìn)行觀察記錄，

并于成熟期分別考查純合突變體植株和野生型株高、有效分蘗數(shù)、穗長(zhǎng)、每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重。數(shù)據(jù)利用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 稻瘟病菌的人工接種鑒定

稻瘟病菌培養(yǎng)及孢子液配制參考Yang等[24]的方法，選用稻瘟病生理小種RB22用于稻瘟病接種。

噴霧接種：將3～4葉齡幼苗用透明的PVC膜做成卷筒狀密封，取配制好的孢子溶液噴霧使每個(gè)葉片上形成霧化的小水滴，用保鮮膜密封。在22℃下黑暗培養(yǎng)24 h后恢復(fù)正常光照周期培養(yǎng)5～7 d，調(diào)查發(fā)病情況。

打孔接種：用10 μL的滅菌槍頭在水稻葉片的葉脈邊緣打孔，吸取10 μL孢子懸浮液滴到葉片的打孔部位，接種葉片密封置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d左右，對(duì)接種葉片進(jìn)行拍照并統(tǒng)計(jì)病斑面積。取相同葉面積的病斑葉片提取DNA進(jìn)行生物量檢測(cè)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析真菌生物量[33]。以水稻()作為內(nèi)參基因，用2法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 防衛(wèi)相關(guān)基因表達(dá)量及ROS檢測(cè)

在稻瘟菌接種36 h后剪取野生型和純合突變體植株的葉片，檢測(cè)稻瘟病菌防衛(wèi)相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。

活性氧測(cè)定參考Park等[34]，取野生型和純合突變體植株葉片，使用0.5 cm打孔器在主葉脈兩側(cè)打孔，將葉片放入ddH2O中黑暗過夜處理。隨機(jī)選取每個(gè)樣品的3片葉片置于含有100 μL魯米諾(1 mol/L)、1 μL辣根過氧化物酶(1 mol/L)和1 μL幾丁質(zhì)(1 mol/L)的1.5 mL的試管中，快速放入Glomax 20/20 Luminometer儀器中，每隔10 s檢測(cè)一次熒光，共監(jiān)測(cè)20 min。ddH2O作為空白對(duì)照。

藍(lán)色字母表示靶點(diǎn)序列，紅色字母表示PAM序列。線條表示內(nèi)含子，黑盒子代表外顯子。

Fig.1.Schematic diagram of the targeted sites ofand.

1.8 tms5突變體育性鑒定

T2代純合突變體于5月21日播種于中國(guó)水稻研究所轉(zhuǎn)基因指定種植區(qū)，7月6日?20日為突變體幼穗敏感期，期間平均氣溫為30℃。純合突變植株發(fā)育至幼穗分化4期時(shí)，移至人工冷灌池，23℃處理20 d。在即將開花的小穗的上、中、下部各取2朵穎花，用1%的I2-KI對(duì)花粉進(jìn)行染色，用顯微鏡觀察花粉育性。

1.9 香味物質(zhì)2-AP含量測(cè)定

取純合突變體植株和野生型成熟種子30 g，去殼并將糙米碾磨成米粉后，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析種子中的芳香化合物2-AP含量。方法參照Hui等[35]，檢測(cè)數(shù)據(jù)使用Excel進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多基因編輯載體構(gòu)建

為獲得三基因純合突變體植株，利用CRISPR/ Cas9技術(shù)分別在、和基因的第1外顯子上選取20 bp特異性較好的靶位點(diǎn)序列（圖1），并將其構(gòu)建到中間載體上后再連接到表達(dá)載體中，最終構(gòu)建成pC1300-2×35S:: g- g-g多基因表達(dá)載體，用于開展轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)（圖2）。

Hyg?潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；LB?載體左邊界；RB?載體右邊界；Cas9蛋白的啟動(dòng)子是35S；sgRNA的啟動(dòng)子為U3。

Fig.2.Schematic diagram of the pC1300-2×35S::g-g-gvector.

2.2 T0代轉(zhuǎn)基因陽性檢測(cè)及靶位點(diǎn)突變分析

用載體特異引物Cas9-F/Cas9-R檢測(cè)轉(zhuǎn)基因苗篩選轉(zhuǎn)基因陽性株系，共獲得40株陽性轉(zhuǎn)基因苗。利用測(cè)序引物-F/R、-F/R和-F/R檢測(cè)（附表1）。結(jié)果表明，其中有35株在靶位點(diǎn)處發(fā)生突變，純合突變率為34.3%，純合突變率為28.6%，純合突變率為11.4%，其中和雙突純合率為11.4%，三突純合率為2.9%（表1）。

藍(lán)色字母表示靶點(diǎn)序列；紅色字母表示堿基插入；紅色連字符表示堿基缺失；+表示插入；―表示缺失；WT表示野生型。

Fig.3.Two types of homozygous triple mutants.

2.3 T1代三基因純合突變植株的篩選

T1代植株3葉期時(shí)提取葉片DNA，利用、和的檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過測(cè)序鑒定篩選出三基因純合突變植株。同時(shí)用Hyg-F/Hyg-R和Cas9-F/Cas9-R這兩對(duì)載體引物篩選剔除載體骨架的株系。最終獲得了兩種、和三基因純合突變植株（圖2），用于后續(xù)抗性鑒定和香味成分分析。

A?純合突變株系和野生型（WT）打孔接種；B?純合突變株系和野生型噴霧接種；C?野生型和純合突變株系的相對(duì)病斑面積；D?野生型和純合突變株系的真菌生物量；E?純合突變體及其野生型水稻相對(duì)表達(dá)量；F?野生型和純合突變株系防衛(wèi)基因的相對(duì)表達(dá)量；G?野生型和純合突變株系ROS的積累量。數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤；**表示差異達(dá)0.01顯著水平(檢驗(yàn))。

A, Punch inoculation of homozygous mutant lines and wild type.B, Spray inoculation of homozygous mutant lines and wild type.C, Lesion area of wild type and homozygous mutant lines.D, Relative fungal biomass of wild type and homozygous mutant lines.E.Relative expression levels ofin homozygous mutant lines and wild type; F, Relative expression levels of defense genesandin the wild type and the homozygous mutant lines.G, ROS accumulation in wild type and homozygous mutant lines.Data are shown as means ± SE of three biological replicates; **, Significant difference at 0.01 level(-test).

圖4 稻瘟病抗性鑒定

Fig.4.Identification of rice blast resistance.

表1 T0轉(zhuǎn)基因株突變情況統(tǒng)計(jì)

2.4 T2代pi21基因純合突變株系稻瘟病抗性增強(qiáng)

稻瘟病菌接種7 d后，對(duì)純合突變株系進(jìn)行進(jìn)行病情調(diào)查。打孔接種和噴霧接種結(jié)果均表明，與野生型相比，純合突變株的相對(duì)病斑面積顯著減小，并且稻瘟菌生物量顯著降低（圖4）。

利用qRT-PCR檢測(cè)純合突變株中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與野生型相比純合突變株中的表達(dá)水平顯著降低（圖4-E）。另外，純合突變體植株中接種稻瘟病菌36 h后防衛(wèi)基因和的表達(dá)量極顯著上調(diào)（圖4-F）。

為進(jìn)一步研究純合突變體植株是否影響水稻基礎(chǔ)免疫水平，使用基于魯米諾的化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)葉片ROS的積累情況。在幾丁質(zhì)的誘導(dǎo)下，相較于空白對(duì)照，純合突變體植株的ROS積累量顯著高于野生型（圖4-G）。這些結(jié)果表明純合突變株系對(duì)稻瘟病的抗性增強(qiáng)。

2.5 T2代tms5純合突變株系農(nóng)藝性狀分析及育性表現(xiàn)

在田間條件下，T2代純合突變株系與野生型相比，抽穗期延遲，有效分蘗明顯增加，但株高、穗長(zhǎng)和每穗粒數(shù)明顯降低（表2，圖5）；T2代純合突變株系花藥形態(tài)較細(xì)，花粉完全不育，表現(xiàn)出高溫不育的特性。

在冷水池條件下，對(duì)T2代純合突變株系的育性特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)純合突變體植株與野生型的花藥形態(tài)無差異（圖6-A），花粉育性基本正常，有少量的不育花粉存在，野生型結(jié)實(shí)率為81.9%，純合突變體#3和#20結(jié)實(shí)率分別為77.0%和75.1%，表現(xiàn)出低溫可育的特性（圖6-B～D）。與野生型相比，純合突變體植株葉片和幼穗中基因的表達(dá)水平顯著降低，并且高溫下Ub4基因的表達(dá)水平明顯高于野生型（圖6-E～F）。

表2 野生型和tms5純合突變體的農(nóng)藝性狀

均值±標(biāo)準(zhǔn)差，=3.**表示差異達(dá)0.01顯著水平（檢驗(yàn)）。

Means±SD,=3.**Significant difference at 0.01 level(-test).

A?野生型和純合突變體的株型，標(biāo)尺為20 cm；B?野生型和純合突變體的花藥形態(tài)，標(biāo)尺為0.5 cm；C?野生型和純合突變體的花粉育性，標(biāo)尺為100 μm；D?野生型和純合突變體的穗，標(biāo)尺為5 cm；E?野生型和純合突變體的結(jié)實(shí)率。數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3；**差異達(dá)0.01顯著水平（t檢驗(yàn)）。

Fig.5.Phenotype of the wild-type and homozygous mutant grown in field during the normal rice growing season.

A?野生型和純合突變體在冷灌處理?xiàng)l件下的花藥形態(tài)，標(biāo)尺為0.5 cm；B?野生型和純合突變體在冷灌處理?xiàng)l件下的花粉育性，標(biāo)尺為100 μm；C?野生型和純合突變體在冷灌處理?xiàng)l件下的穗子表型，標(biāo)尺為5 m；D?野生型和純合突變體在冷灌處理?xiàng)l件下的結(jié)實(shí)率；E?在不同溫度下水稻葉片和幼穗TMS5基因的轉(zhuǎn)錄水平；F?野生型和純合突變體在不同溫度下UbL404的相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3；*和**分別表示差異達(dá)0.05和0.01顯著水平（t檢驗(yàn)）。

Fig.6.Phenotypes and expression ofandUb4 in wild type and homozygous mutant plants.

A―野生型（WT）和純合突變體Badh2基因的表達(dá)量；B―野生型和純合突變體的2-AP含量。平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)；**表示差異達(dá)0.01顯著水平（t檢驗(yàn)）。

Fig.7.Expression ofand content determination of 2-AP.

2.6 Badh2純合突變體表達(dá)水平檢測(cè)及香味物質(zhì)2-AP含量的測(cè)定

純合突變體中基因的表達(dá)量相對(duì)野生型顯著下調(diào)（圖7-A）。進(jìn)一步利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)野生型及純合突變體材料中的2-AP含量進(jìn)行了測(cè)定分析（圖7-B）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型中早70相比，#3和#20純合突變體中的香味物質(zhì)2-AP含量顯著提高，分別增加了0.092、0.132 mg/kg。該結(jié)果表明，利用基因編輯技術(shù)使基因突變，可造成表達(dá)水平降低，有效獲得具有香味性狀的新品種。

3 討論

CRISPR/Cas9技術(shù)作為目前應(yīng)用最為廣泛的基因編輯技術(shù)，為農(nóng)作物的品種改良提供了更多的新路徑。Ma等[36]利用植物密碼子優(yōu)化的基因構(gòu)建出的CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)，可以高效地對(duì)單子葉和雙子葉植物進(jìn)行多基因編輯。Shen等[37]利用CRISPR/Cas9多基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建了一個(gè)針對(duì)水稻8個(gè)基因的載體，遺傳轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)這8個(gè)靶基因在T0代具有較高的突變效率，并出現(xiàn)與靶基因相關(guān)的多種表型。Li等[38]利用CRISPR/Cas9多基因編輯系統(tǒng)對(duì)水稻材料中的、和基因進(jìn)行編輯，獲得的純合突變體表現(xiàn)出對(duì)稻瘟病和白葉枯病抗性增強(qiáng)的溫敏性核不育特性。Xu[25]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，對(duì)Pita、Pi21和ERF922基因進(jìn)行突變獲得了能夠穩(wěn)定遺傳和具有較高稻瘟病抗性的純合突變株系。Tao[39]利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的多重基因組編輯技術(shù)，獲得的、和三基因功能缺失的突變體顯著增強(qiáng)了稻瘟病和白葉枯的抗性。雖然并不影響稻米品質(zhì)，但由于基因與一個(gè)稻米品質(zhì)基因緊密連鎖，利用傳統(tǒng)育種將導(dǎo)入優(yōu)良品種時(shí)難以避免連鎖累贅造成稻米品質(zhì)的下降[40]，而利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯稻瘟病基因創(chuàng)制的突變體，能夠在提高稻瘟病抗性的同時(shí)有效避免連鎖累贅?biāo)鶎?dǎo)致的米質(zhì)下降。因此，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的多基因編輯系統(tǒng)，可快速有效獲得多基因突變的純合突變體。

隨著生活質(zhì)量的提高，人們對(duì)稻米品質(zhì)的要求也越來越高，優(yōu)質(zhì)稻米成為選育品種追求的目標(biāo)。香味是水稻品質(zhì)的一項(xiàng)指標(biāo)，香米由于具有獨(dú)特香味，深受消費(fèi)者青睞，生產(chǎn)和市場(chǎng)價(jià)值較高[41]。優(yōu)質(zhì)不育系的選育作為優(yōu)質(zhì)雜交水稻選育的基礎(chǔ)，在生產(chǎn)上應(yīng)用的帶有香味的優(yōu)質(zhì)不育系主要是三系的野香A、朝1A、渝香813A、廣泰A、粳香A等，但帶有香味的兩系不育系較少[42-46]，育種目標(biāo)多樣化，除了高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)，還要考慮抗病性。

植物對(duì)抗病原菌侵入時(shí)，體內(nèi)會(huì)激活免疫反應(yīng)來抵御病原菌，進(jìn)而增強(qiáng)植物的抗病性[47]。、、、、等防衛(wèi)相關(guān)基因在防御稻瘟病中起重要作用[34, 48, 49]，ROS是防御稻瘟病菌侵染的關(guān)鍵因素[46]。本研究所獲得的純合株系中和防衛(wèi)基因表達(dá)極顯著上調(diào)同時(shí)ROS積累量也顯著增加，表明基因突變對(duì)稻瘟病的抗性顯著增強(qiáng)，在水稻的基礎(chǔ)免疫中也起著重要作用。

Barman[13]利用CRISPR/Cas9對(duì)中嘉早17的位點(diǎn)進(jìn)行編輯，成功獲得了具有優(yōu)良配合力的兩系不育系。陳日榮等[50]對(duì)6個(gè)粳稻和4個(gè)秈稻的基因進(jìn)行敲除，獲得了相應(yīng)的溫敏核不育系，并發(fā)現(xiàn)不同遺傳背景材料獲得的突變體的不育起點(diǎn)溫度不一樣。通過對(duì)Ub4mRNA的加工調(diào)控水稻在不同溫度下的雄性育性[12]，本研究所獲得的純合突變體植株表現(xiàn)高溫不育、低溫可育的溫敏特性，并且的表達(dá)減少，高溫條件下Ub4的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，結(jié)果與前人一致。

前人研究表明，是控制稻米香味的一個(gè)重要基因，由15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子組成，編碼甜菜堿醛脫氫酶，該酶抑制水稻香米主要成分2-乙?；?1-吡咯啉(2-AP)的生物合成[51]。利用CRISPR/Cas9技術(shù)可成功地對(duì)基因進(jìn)行編輯，并獲得香味顯著提高且無轉(zhuǎn)基因成分的純合突變體材料[52, 53]。因此，利用該技術(shù)對(duì)其進(jìn)行編輯，可以創(chuàng)制出新的香型種質(zhì)資源，我們通過參考邵高能等[54]的研究方法利用CRISPR/Cas9技術(shù)也成功地在早稻品種中早70中編輯了水稻香味基因，獲得了具有香味的純合突變體植株，所獲得的純合變異株系中2-AP含量雖然有所提高，但沒有其他研究人員[17, 54, 55]報(bào)道的2-AP含量高，這可能與受體材料的本身特性有關(guān)。

CRISPR/Cas9技術(shù)可以較容易地獲得多個(gè)基因定向改良的植株，在自交后代中獲得無選擇標(biāo)記的株系，極大地加快育種的進(jìn)程。利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)敲除目標(biāo)基因，編輯后的純合突變株系在主要農(nóng)藝性狀上與野生型較相似。Nawaz等[26]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除，純合突變株系在主要農(nóng)藝性狀如株高、穗長(zhǎng)、每穗粒數(shù)、千粒重等與野生型都沒有明顯差異。孫慧宇等[53]利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯基因改良粳稻香味，對(duì)純合突變株系的主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行考查，發(fā)現(xiàn)突變株系的穗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率及千粒重與野生型相比均沒有明顯差異。而對(duì)水稻溫敏不育基因進(jìn)行編輯時(shí)，突變體均顯示出結(jié)實(shí)率和株高等均顯著降低的特性[13, 14]。

本研究利用CRISPR/Cas9多基因敲除系統(tǒng)對(duì)早秈稻品種中早70同時(shí)進(jìn)行、和的定向編輯，通過對(duì)T2代純合突變體株系性狀考查發(fā)現(xiàn)目標(biāo)性狀得到了改良，成功獲得高抗稻瘟病的香型優(yōu)質(zhì)早稻溫敏不育系純合突變株系，說明通過基因編輯技術(shù)定向改良水稻品種是完全可行的。但我們發(fā)現(xiàn)三基因純合突變株系的主要農(nóng)藝性狀相比于野生型有顯著差異。與野生型相比，中早70的、和三基因純合突變株系除了目標(biāo)性狀得到改良外，與不育系相關(guān)的性狀如分蘗數(shù)、株高及每穗粒數(shù)均有明顯的變化。由于本研究中獲取的純合突變基因型組合較少，因此無法詳細(xì)分析各種類型組合轉(zhuǎn)基因株系間差異，需要繼續(xù)篩選獲取、和各組合純合突變株系以便進(jìn)一步的研究。

在線輔助性信息：附表1見《中國(guó)水稻科學(xué)》網(wǎng)站（http://www.ricesci.cn）。

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LIANG Minmin#, ZHANG Huali#, CHEN Junyu, DAI Dongqing, DU Chengxing, WANG Huimei, MA Liangyong*

(State Key Laboratory of Rice Biology and Chinese National Center for Rice Improvement, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: maliangyong@caas.cn)

【Objective】New thermosensitive genic male sterile lines with high resistance and fragrance quality will provide resources for hybrid rice breeding.【Method】The target genes,andwere selected to construct the pC1300-2×35S::g-g-gexpression vector by CRISPR/Cas9 technology for transformation of earlyrice Zhongzao 70.The positive transgenic plants were obtained through sequencing analysis.spraying inoculation and punching inoculation assays were conducted to identify the resistance to rice blast, and the content of 2-acetyl-1-pyrrolinewas measured by GC-MS.【Result】In T0transgenic lines, the mutation rates of,andwere 87.5%, 80.0% and 87.5%, respectively, and most of the mutant lines are biallelic mutations.Two types of the homozygous triple mutants without the vector were obtained in T1transgenic lines.Evaluation analysis of resistance to rice blast suggested that T2generation of thehomozygous mutant lines showed significantly higher resistance tocompared with the wild type.The expression levels of defense-related genes were up-regulated and the ROS accumulation increased in the homozygous mutant lines compared to the wild type after inoculation of.homozygous mutant lines displayed thermo-sensitive male sterility.Compared with the wild type, the expression level ofwas significantly decreased and the transcription ofUb4was increased in thehomozygous mutants at high temperature.The expression level ofwas down-regulated and the content of 2-AP increased dramatically in thehomozygous mutant lines.【Conclusion】Thehomozygous triple mutant linesof,andwere obtained by CRISPR/Cas9-mediated technology, which would provide materials for high-resistant and fragrant rice breeding.

rice; CRISPR/Cas9;;;

10.16819/j.1001-7216.2022.211007

2021-10-25；

2021-12-20。

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(CPSIBRF-CNRRI-202105); 水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(20210207; 20190110); 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程資助項(xiàng)目。