利用CRISPR/Cas9創(chuàng)建osarf7突變體及其農(nóng)藝性狀調(diào)查

李兆偉 孫聰穎 零東蘭 曾慧玲 張曉妹 范凱 林文雄, *

利用CRISPR/Cas9創(chuàng)建突變體及其農(nóng)藝性狀調(diào)查

李兆偉1孫聰穎1零東蘭1曾慧玲1張曉妹1范凱2林文雄1, *

(1福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350002;2福建農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/教育部作物遺傳育種與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350002;*通信聯(lián)系人, E-mail: wenxiong181@163.com)

【目的】探究基因在水稻生長發(fā)育中的生物學(xué)功能及其對水稻農(nóng)藝性狀的影響?！痉椒ā坷肅RISPR/Cas9技術(shù)，在粳稻中花11背景下對進(jìn)行定向編輯，獲得基因突變植株，并考查其農(nóng)藝性狀?！窘Y(jié)果】獲得22株T0代轉(zhuǎn)基因株系，經(jīng)PCR擴(kuò)增潮霉素基因鑒定出20株陽性植株。提取T2代轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，通過對的2個編輯位點(diǎn)區(qū)域DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序分析，篩選到15種突變類型的純合基因型植株?；虮磉_(dá)分析顯示，突變體的和生長素轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵基因、和的表達(dá)量均顯著低于野生型。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，突變體的分蘗成穗率顯著降低，其中，分蘗數(shù)比野生型增多的突變體，有效穗數(shù)基本保持不變，而分蘗數(shù)與野生型相近的突變體，有效穗數(shù)少于野生型，最終表現(xiàn)為無效分蘗明顯增多，分蘗成穗率降低?！窘Y(jié)論】基因與生長素調(diào)控水稻分蘗發(fā)生相關(guān)，并影響分蘗芽的生長發(fā)育及成穗；基因突變會導(dǎo)致遲發(fā)分蘗芽不能正常發(fā)育成穗；粳稻突變體的創(chuàng)建對揭示基因生理功能和探索生長素促控分蘗發(fā)生與成穗機(jī)理等具有積極意義。

水稻；基因編輯；；CRISPR/Cas9；生長素

水稻（L.）是世界上最重要的糧食作物之一，養(yǎng)育著全球半數(shù)以上的人口，尤其在亞洲地區(qū)，長期以來是90%以上人口的主糧。20世紀(jì)，我國通過矮化育種和雜交水稻三系配套技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了水稻產(chǎn)量的大幅度穩(wěn)步增長，并引領(lǐng)世界水稻育種潮流[1]。進(jìn)入21世紀(jì)以來，世界人口持續(xù)增長，人們對糧食的需求日益加大，而隨著全球可用耕地和水肥資源逐漸短缺、自然災(zāi)害頻繁發(fā)生、生態(tài)環(huán)境壓力持續(xù)加大、農(nóng)業(yè)從業(yè)人員逐年萎縮，世界糧食供需變得越來越不平衡，糧食短缺問題變得日益嚴(yán)重。因此，突破傳統(tǒng)育種手段和栽培調(diào)控技術(shù)的瓶頸，結(jié)合分子遺傳學(xué)、功能基因組學(xué)和分子標(biāo)記輔助育種，采用基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)更加高效、精準(zhǔn)的分子設(shè)計育種，成為解決糧食短缺和維持農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展的新策略[1]。

生長素主要調(diào)控植物根系和莖的伸長生長、維持植株頂端優(yōu)勢、促進(jìn)側(cè)根形成、誘導(dǎo)維管組織分化等生長發(fā)育代謝，在植物生長過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[2]。植物生長素信號代謝受兩類轉(zhuǎn)錄因子家族基因調(diào)控，分別是生長素響應(yīng)因子（auxin response factors, ARFs）和生長素反應(yīng)阻遏子/抑制子（Aux/IAA蛋白），屬于生長素早期響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[3]。ARFs能感受生長素變化，特異性結(jié)合生長素早期響應(yīng)基因啟動子的生長素響應(yīng)元件（auxin response elements, AuxREs）TGTCTC，激活或抑制生長素早期響應(yīng)基因的表達(dá)；在一定濃度的生長素條件下，Aux/IAA蛋白可以優(yōu)先與ARFs結(jié)合成二聚體，使ARFs蛋白不能與AuxREs元件結(jié)合，從而影響生長素響應(yīng)基因表達(dá)，對特定濃度生長素作出應(yīng)答反應(yīng)[4-5]。

基因家族在擬南芥[6]()、水稻[7]()、玉米[8]()、大豆[9]()、番茄[10]()、黃瓜[11]()等植物中均有發(fā)現(xiàn)。大多數(shù)ARFs蛋白包含3個結(jié)構(gòu)域：1個位于氨基端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain, DBD)、1個含激活結(jié)構(gòu)域(activation domain, AD)和抑制結(jié)構(gòu)域(repression domain, RD)的中間區(qū)域(middle region, MR)以及1個羥基末端二聚體結(jié)構(gòu)域(carboxy-terminal dimerization domain, CTD)，DBD結(jié)構(gòu)域主要與靶基因的AuxRE元件結(jié)合，MR結(jié)構(gòu)域決定激活或抑制靶基因表達(dá)。水稻中有25個基因，分布于10條染色體上，其中、、、、和不含有CTD，OsARF5和OsARF20則有兩個DBDs，其余17個ARF成員均包含典型的ARF結(jié)構(gòu)域[7]，依據(jù)ARF激活子MR富含Glu、Ser和Leu殘基的特點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，、、、、、、、、具有轉(zhuǎn)錄激活功能，其余OsARF蛋白則具有轉(zhuǎn)錄抑制功能[12]。在水稻中，除在幼苗中表達(dá)外，其余24個在根、莖、葉、花、幼穗等組織和器官中表達(dá)，發(fā)揮特定生物學(xué)功能，響應(yīng)激素變化和應(yīng)答外界環(huán)境因子[7]，如在水稻莖和葉節(jié)中大量表達(dá)，參與油菜素內(nèi)酯調(diào)節(jié)葉片夾角，調(diào)控水稻株型構(gòu)建與側(cè)根發(fā)育[13]；在水稻胚性愈傷和幼穗組織中表達(dá)[7, 14]，并受外源生長素誘導(dǎo)[15]；、、、、則在根系中表達(dá)量較高，參與根冠和側(cè)根的生長發(fā)育[16]；通過建立Auxin-miR167- ARF8信號通路，感受光照強(qiáng)度變化，調(diào)控愈傷組織分化發(fā)育[7,17]；既參與細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)信號途徑[18]，又是水稻響應(yīng)鐵饑餓代謝的必需物質(zhì)[19]。近年來，家族成員的基因結(jié)構(gòu)、氨基酸序列、與其他物種間的進(jìn)化關(guān)系等信息已經(jīng)被詳細(xì)分析報道[7, 20]。然而，仍有多數(shù)基因成員在水稻生長過程中的生物學(xué)功能等研究相對缺乏。Wang等[7]指出，在水稻幼苗中呈組成性表達(dá)，不受光照和外源生長素影響，系統(tǒng)發(fā)育分析表明水稻與擬南芥親緣關(guān)系最近。Ellis等[21]指出，擬南芥作為轉(zhuǎn)錄抑制子，與協(xié)同調(diào)節(jié)擬南芥葉片衰老過程。然而基因在生長素調(diào)節(jié)水稻發(fā)育過程中的分子作用機(jī)理仍未見報道，其對水稻產(chǎn)量構(gòu)成相關(guān)的農(nóng)藝性狀表型影響也有待進(jìn)一步探索。構(gòu)建功能缺失突變體是準(zhǔn)確、高效地探究基因的分子功能及其生物學(xué)作用機(jī)制的有效措施。

CRISPR/Cas9編輯技術(shù)是對目標(biāo)基因DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)編輯改造的遺傳操作方法，具有操作步驟簡單、目標(biāo)基因突變效率高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于功能基因組研究和作物分子育種等領(lǐng)域，在擬南芥、水稻、小麥、玉米、煙草、高粱、番茄、甜橙等植物中實(shí)現(xiàn)了對靶基因的定向編輯[22, 23]。尤其近幾年來，CRISPR/Cas9編輯技術(shù)在水稻遺傳改良的應(yīng)用越來越廣泛，陸續(xù)獲得了較多具有較大育種價值的優(yōu)良種質(zhì)資源，如王加峰等[24]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻千粒重基因定向突變，獲得了5種千粒重顯著提高的堿基缺失突變體，為稻米的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)研究提供了重要的科研材料；周延彪等[25]通過CRISPR/Cas9技術(shù)將水稻反光敏育性基因定向編輯，成功獲得了株高降低、分蘗數(shù)增加、花粉在短日照條件下完全不育的反光敏不育水稻材料；而黃忠明等[26]利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功地對水稻溫敏不育基因進(jìn)行編輯突變，得到了結(jié)實(shí)率和單株產(chǎn)量顯著降低的突變體粳稻種質(zhì)。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)編輯轉(zhuǎn)錄因子，獲得了一套以粳稻中花11為背景的突變體種質(zhì)，并調(diào)查了突變體材料的田間農(nóng)藝性狀，研究結(jié)果對水稻理想農(nóng)藝性狀指標(biāo)材料的選育有積極的實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 靶位點(diǎn)設(shè)計

在（LOC_Os02g35140）基因反義鏈上設(shè)計1個跨第1外顯子和內(nèi)含子的20 bp靶點(diǎn)序列，PAM序列為CGG（圖1），在靶序列的正義鏈和反義鏈5′端分別添加GCCG和AAAC短序列（表1），使其與中間載體pYL-U6a-gRNA經(jīng)Ⅰ（NBE）酶切后形成互補(bǔ)黏性末端。在基因正義鏈的第2外顯子內(nèi)設(shè)計第2個靶點(diǎn)序列，序列長度為20 bp，PAM序列為TGG（圖1），TGG序列上游第20個堿基為G，在靶序列正義鏈和反義鏈5′端分別添加GTT和AAAC序列（表1），使其與中間載體pYL-U6b-gRNA經(jīng)I酶切后形成對應(yīng)的互補(bǔ)黏性末端。在水稻基因組數(shù)據(jù)庫中查詢比對設(shè)計好的靶點(diǎn)序列，以排除Cas9蛋白對非特異性位點(diǎn)的錯誤識別切割。同時設(shè)計轉(zhuǎn)基因植株陽性鑒定用的潮霉素特異引物和編輯位點(diǎn)PCR擴(kuò)增檢測與測序引物。所有引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。pYL-U6a/U6b-gRNA中間載體及pYLCRISPR/Cas9-MT表達(dá)載體均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光院士惠贈。

1.2 雙靶點(diǎn)載體構(gòu)建

參考Ma等[27]方法稍作修改。1）雙鏈靶點(diǎn)制備：取等量靶點(diǎn)的上下游引物混合為50 μL體系，終濃度為2 μmol/L，95℃下變性處理5 min，再于25℃下孵育退火20 min，形成互補(bǔ)雙鏈DNA；2）雙鏈靶點(diǎn)DNA與pYL-U6a-gRNA、pYL-U6b-gRNA中間載體連接，采用邊切邊連接方法。取pYL-U6a-gRNA及pYL-U6b-gRNA載體各20 ng，雙鏈互補(bǔ)DNA靶序列各1 μL，其中第1個靶點(diǎn)DNA雙鏈與pYL-U6a-gRNA載體連接，第2個靶點(diǎn)DNA雙鏈與pYL-U6b-gRNA連接，再分別加入1 μL 5 U的I內(nèi)切酶和20 U的T4 DNA連接酶，以及1 μL的CutSmart緩沖液和10倍Ligation緩沖液，加水至終體積為10 μL。在37℃下酶切5 min，后于16℃連接5 min，連續(xù)設(shè)置12次酶切與連接循環(huán)。3）PCR擴(kuò)增：以構(gòu)建好的中間載體為模板，采用通用引物U-F（5′-CTCCGTTTTACCTGTGG AATCG-3′）和gRNA-R（5′-CGGAGGAAAATTC CATCCAC-3′）分別擴(kuò)增U6a啟動子-gRNA1表達(dá)盒和U6b啟動子-gRNA2表達(dá)盒。將獲得的PCR產(chǎn)物稀釋10倍后進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增，為得到的表達(dá)盒引入酶切位點(diǎn)和特異性雙鏈接頭，U6a啟動子-gRNA1表達(dá)盒的引物為Uctcg-B1′(5′-TTCAGAG GTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3′)和gRctga-B2 (5′-AGCGTGGGTCTCGTCAGG GTCCATCCACTCCAAGCTC-3′)，U6b啟動子-gRNA2表達(dá)盒的引物為Uctga-B2′ (5′-TTCAGAG GTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3′)和gRcggt-BL (5′-AGCGTGGGTCTCGACCGAC GCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3′)，PCR條件為先94℃下2 min，98℃下變性10 s，58℃下退火30 s和68℃下延伸45 s，共31次循環(huán)反應(yīng)；4)產(chǎn)物回收純化及pYLCRISPR/ Cas9-ARF7-T12載體連接。第2次PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，各取15 ng含酶切位點(diǎn)和連接接頭的U6a啟動子-gRNA1表達(dá)盒和U6b啟動子-gRNA2表達(dá)盒，以及70 ng的pYLCRISPR/ Cas9-MT空載體混合于同一體系中，用1 μL 5 U的Ⅰ內(nèi)切酶和20 U的T4 DNA連接酶在37 ℃和16 ℃條件下進(jìn)行邊酶切邊連接反應(yīng)，連續(xù)進(jìn)行12次循環(huán)，獲得重組載體。5）轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒測序，連接好的重組載體轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，平板培養(yǎng)后挑取單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證，選取陽性菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 轉(zhuǎn)基因陽性植株鑒定

將構(gòu)建好的雙靶點(diǎn)pYLCRISPR/Cas9-ARF7- T12載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，選取陽性農(nóng)桿菌克隆轉(zhuǎn)化粳稻中花11愈傷組織，通過檢測潮霉素基因篩選T0代中的陽性株系。提取T0代植株DNA，采用特異性潮霉素引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物序列見表1），能擴(kuò)增出280 bp條帶的植株為陽性轉(zhuǎn)基因株系。

1.4 突變位點(diǎn)PCR擴(kuò)增檢測及測序分析

為檢測編輯靶點(diǎn)的突變情況，分別在2個靶點(diǎn)的上下游設(shè)計測序引物OsARF7-T1-F/OsARF7-T1-R和OsARF7-T2-F/ OsARF7-T2-R（表1），提取植株DNA，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增檢測，目的片段長度分別為657 bp和575 bp，并將擴(kuò)增出的待檢測片段送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果與以野生型中花11的DNA為模板擴(kuò)增的片段序列進(jìn)行比對，分析鑒定轉(zhuǎn)基因植株的基因突變類型。

1.5 潛在脫靶位點(diǎn)分析

將基因的2個靶序列在水稻基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，選擇與靶序列錯配堿基在4 bp以內(nèi)且含PAM序列NGG的堿基片段作為潛在的脫靶序列，選擇10株T2代陽性植株提取DNA，通過PCR擴(kuò)增與測序分析，評估2個靶點(diǎn)的脫靶效應(yīng)，脫靶效應(yīng)評估PCR擴(kuò)增引物見附表1。

1.6 osarf7突變體中OsARF7及生長素轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)量分析

參照RNA提取試劑盒(TaKaRa公司，大連)操作步驟，提取突變體和野生型植株葉片的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析及生長素轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵基因的表達(dá)量，熒光定量PCR檢測引物見附表1。

1.7 osarf7突變體的農(nóng)藝性狀調(diào)查

以野生型中花11為對照，于2020年4月至7月在福建省福州市福建農(nóng)林大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場轉(zhuǎn)基因材料種植管理區(qū)，調(diào)查突變體的農(nóng)藝性狀。4月5日播種育秧，4月30日移栽，單本栽秧，株行距為30 cm × 30 cm，每行移栽6株，每個基因型材料種植5行，各基因型間種植3行中花11作為間隔，設(shè)置2個重復(fù)小區(qū)試驗(yàn)，依照福州當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)栽培方式進(jìn)行水肥田間管理。在7月下旬成熟期時，在每個小區(qū)非邊界行選取長勢較一致的10株植株，考查株高、分蘗數(shù)、穗長、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、以及單株產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀指標(biāo)。通過SPSS 13.0軟件計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，采用單因素方差分析法比較各指標(biāo)的種間差異，差異顯著性水平為≤0.05。

圖1 OsARF7的2個gRNA靶點(diǎn)位置

Fig.1.Position of two gRNA targets in thegene.

表1 本研究采用的gRNA靶點(diǎn)序列及相應(yīng)的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 gRNA靶點(diǎn)設(shè)計及表達(dá)載體構(gòu)建

為獲得中花11的編輯突變體，根據(jù)CRISPR/Cas9技術(shù)原理，結(jié)合序列結(jié)構(gòu)，分別在基因+381～+400和+1193～+1212處設(shè)計2條長度為20 bp的特異性編輯靶點(diǎn)（表1）。第1個靶點(diǎn)序列跨第1外顯子和第1內(nèi)含子，靠近PAM序列的13個堿基CCTGTGCCACCGC位于第1外顯子上，其余7個堿基ACACGAA位于第1內(nèi)含子上，第2個編輯靶點(diǎn)位于的第2個外顯子區(qū)間（圖1），以確保徹底敲除的基因功能。

互補(bǔ)的雙鏈靶序列1與pYL-U6a-gRNA載體連接，靶序列2與pYL-U6b-gRNA載體連接后，經(jīng)特異性PCR擴(kuò)增獲得U6a啟動子-gRNA1表達(dá)盒和U6b啟動子-gRNA2表達(dá)盒，經(jīng)第2次PCR擴(kuò)增后分別為兩個表達(dá)盒加入了特異性酶切位點(diǎn)和連接接頭。第2次PCR擴(kuò)增的兩個表達(dá)盒產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，依照圖2方式與pYLCRISPR/Cas9-MT載體重組連接，形成pYLCRISPR/Cas9-ARF7-T12重組表達(dá)載體。構(gòu)建好的pYLCRISPR/Cas9-ARF7-T12重組載體經(jīng)測序分析表明，載體中連接的2個靶位點(diǎn)序列（圖3）與設(shè)計序列一致（表1），靶位點(diǎn)序列完全正確，重組pYLCRISPR/Cas9-ARF7-T12載體適合進(jìn)行水稻遺傳轉(zhuǎn)化。

2.2 T0代陽性轉(zhuǎn)基因植株的獲得

將pYLCRISPR/Cas9-ARF7-T12重組載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化中花11愈傷組織，共獲得22株T0代轉(zhuǎn)基因再生株系。為鑒定轉(zhuǎn)基因植株中的陽性株系，提取每個株系的DNA，采用潮霉素基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由圖4電泳圖片可見，共有20個轉(zhuǎn)化苗是陽性植株，2個轉(zhuǎn)化苗是陰性株系，陽性率達(dá)90%左右。

2.3 osarf7突變體植株突變位點(diǎn)鑒定

為獲得純合突變植株，T2代植株被用于突變位點(diǎn)測序分析。通過在兩個靶序列上下游區(qū)域設(shè)計的引物PCR擴(kuò)增可見，T2代7突變體植株的兩個突變位點(diǎn)區(qū)域序列均能擴(kuò)增出條帶，含靶點(diǎn)1的預(yù)設(shè)擴(kuò)增區(qū)域長度為657 bp，含靶點(diǎn)2的預(yù)設(shè)擴(kuò)增區(qū)域長度為575 bp，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，兩個靶點(diǎn)的擴(kuò)增片段位于DNA標(biāo)記標(biāo)示的500 bp和750 bp范圍，與設(shè)計長度基本吻合（圖5-A）。擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果表明，在10個株系的T2代植株中篩選出15種類型的純合突變體，在第1靶點(diǎn)的突變類型中，有12個單株是A或T單堿基插入突變，2個單株是缺失25個堿基突變，1個單株是283個堿基插入突變，所有突變區(qū)域均位于第1個外顯子上，沒有涉及第1內(nèi)含子（圖5-B）；在第2個靶點(diǎn)的突變類型中，有12個單株是單堿基插入突變，1個單株是雙堿基GA插入突變，1個單株是10個堿基缺失突變，另有1個株系在第2靶點(diǎn)位置無突變，但其在第1靶點(diǎn)缺失25個堿基（圖5-B）。

2個靶位點(diǎn)gRNA表達(dá)盒與pYLCRISPR/Cas9-MT載體組裝成重組表達(dá)載體。LB―左邊界；RB―右邊界；參照文獻(xiàn)[24]略作修改。

Fig.2.Diagrammatic sketch of pYLCRISPR/Cas9-ARF7-T12 recombinant vector.

圖3 pYLCRISPR/Cas9-ARF7-T12重組載體中2個靶點(diǎn)序列的測序結(jié)果

Fig.3.Sequencing results for the two target sequences inserted in pYLCRISPR/Cas9-ARF7-T12 recombinant vector.

“—”代表陰性對照，“+”代表陽性對照。

Fig.4.Identification of the positive transgenic plants by PCR amplification.

2.4 osarf7突變體植株脫靶效應(yīng)評估

對靶位點(diǎn)與參考基因組序列進(jìn)行比對查詢發(fā)現(xiàn)，靶點(diǎn)1在水稻基因組序列中有5個含4個差異堿基的潛在脫靶序列，靶點(diǎn)2存在6個差異堿基數(shù)小于4的潛在脫靶位點(diǎn)，隨機(jī)選取T2代陽性編輯植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序分析，測序結(jié)果表明，所有被檢測植株的潛在脫靶位點(diǎn)序列均與參考基因組序列一致，即未發(fā)生脫靶編輯（表2）。

A－部分T2代（1～22）轉(zhuǎn)化水稻株系OsARF7編輯位點(diǎn)附近DNA片段的PCR檢測，靶點(diǎn)1的擴(kuò)增長度為657 bp，靶點(diǎn)2的擴(kuò)增長度為575 bp，野生型（WT）為中花11；B－轉(zhuǎn)化植株編輯位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物測序序列與野生型（WT）序列的比對結(jié)果，藍(lán)色字母為靶點(diǎn)序列，黃色高亮顯示PAM序列，刪除線表示缺失堿基，紅色小寫字母為插入堿基，－表示缺失，+表示插入，WT為野生型。

Fig.5.PCR identification and sequence alignment ofmutants compared to the WT line.

表2 CRISPR/Cas9-OsARF7-T12潛在脫靶位點(diǎn)檢測

黑色字母為與靶點(diǎn)序列匹配堿基，紅色粗體標(biāo)記為與靶點(diǎn)序列錯配堿基。

The black letters indicate that these bases match the target site sequences, and red letters show the mismatched bases.

2.5 osarf7突變體中OsARF7基因及生長素轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵基因表達(dá)結(jié)果

在生長素的極性運(yùn)輸過程中，和是主要的生長素輸出載體（auxin efflux carrier），而編碼生長素輸入載體（auxin influx carrier）[28]。本研究對突變體及野生型水稻3葉齡幼苗葉片中的、、以及的表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR檢測。由圖6結(jié)果可見，與野生型相比，突變體中和生長素輸出載體基因的表達(dá)顯著降低；對表達(dá)量檢測發(fā)現(xiàn)，除、以及突變體中表達(dá)水平與野生型無顯著差異外，其余突變體的表達(dá)均顯著低于野生型；此外，生長素輸入載體基因在突變體中的表達(dá)量也顯著低于野生型。以上研究結(jié)果表明，突變體組織中下調(diào)表達(dá)影響了生長素的輸出和輸入關(guān)鍵調(diào)控基因的正常表達(dá)，生長素極性轉(zhuǎn)運(yùn)受到相對抑制。

2.6 osarf7突變體的農(nóng)藝性狀分析

圖6 osarf7突變體及其野生型水稻OsARF7、OsPIN1b、OsPIN2、OsLAX2相對表達(dá)量

Fig.6.Relative expression levels ofandinmutant and its wild type.

表3 不同類型osarf7突變體株系及其野生型水稻（WT）的農(nóng)藝性狀

表中所列數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；表中同列數(shù)據(jù)后相同字母表示在0.05水平上差異不顯著，不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

Data listed in the table are presented as average values ± standard deviation; Values followed by common letters within a column are not significantly different at the 0.05 probability level, and values followed by different letters within a column are significantly different.

對T2代純合突變植株的農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果顯示（表3），、、、、、、以及等7種突變體的總分蘗數(shù)為15.4～20.6個，顯著高于野生型中花11的11.3個分蘗，就有效穗而言，除突變體的有效穗顯著低于野生型外，其余6種突變體的有效穗均與野生型無顯著差異，表明突變體水稻有較多分蘗沒有最終形成有效穗，變成了無效分蘗；而、、和突變株的總分蘗數(shù)與野生型無顯著差異，但其最終形成的有效穗僅有4～5個，有效穗較野生型中花11顯著減少，較多分蘗沒有形成有效穗，變成了無效分蘗；其余3個突變體、和的總分蘗數(shù)和有效穗數(shù)雖與野生型中花11無顯著差異，但總的變化趨勢是總分蘗數(shù)高于野生型中花11，有效穗較野生型減少，無效分蘗較多；而所有突變植株的分蘗成穗率僅為36%～53%，顯著低于野生型中花11的91.67%成穗率，表明基因突變導(dǎo)致植株的分蘗數(shù)增加，較多分蘗沒有形成有效穗，無效分蘗數(shù)變多，顯著降低了突變植株的分蘗成穗率。此外，和的結(jié)實(shí)率分別為63.42%和57.23%，顯著低于野生型88.39%的結(jié)實(shí)率，其他突變類型植株的結(jié)實(shí)率與野生型無顯著差異；而、和的千粒重分別達(dá)28.1 g、27.4 g及30.1 g，均顯著高于野生型。在株高、穗長、每穗粒數(shù)以及單株產(chǎn)量等產(chǎn)量指標(biāo)方面，突變體植株均與野生型中花11無顯著差異。

3 討論

CRISPR/Cas9是近幾年發(fā)展的一種基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，比早先的鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)[29]和TALE核酸酶(transcription activator like effector nucleases, TALENs)[30]技術(shù)更加簡便靈活，僅需gRNA引導(dǎo)序列和Cas9核酸酶即可對靶基因DNA序列進(jìn)行剪切編輯，可以更加快速、準(zhǔn)確地對作物目標(biāo)性狀進(jìn)行定向改造，目前已在多種作物的分子設(shè)計育種中得到應(yīng)用[22-23]。本研究為探討基因的生物學(xué)功能，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，設(shè)計雙編輯靶點(diǎn)，在粳稻中花11中編輯突變基因，成功得到20株陽性轉(zhuǎn)基因T0代植株。鑒于T0代轉(zhuǎn)基因株系存在純合突變、雜合突變、雙等位突變等多樣化的變異類型，以及T1代轉(zhuǎn)基因植株存在等位基因分離等不確定性，T2代以后突變

性狀才可以穩(wěn)定遺傳的特性[24]，本研究通過對2個靶點(diǎn)區(qū)域序列測序，在T2代植株中直接通過測序手段分離篩選能穩(wěn)定遺傳的純合突變植株，剔除測序結(jié)果中雜合突變和雙等位突變導(dǎo)致的PCR產(chǎn)物測序出現(xiàn)重疊峰的植株[31]，共在T2代植株中篩選出測序圖譜顯示單一峰的15種純合突變類型，大多數(shù)突變在兩個靶點(diǎn)區(qū)域都是單堿基插入或缺失突變，長片段突變率較低，這與前人報道的編輯結(jié)果相似[26, 32]。此外，相較于單靶點(diǎn)編輯突變幾率較低、突變位點(diǎn)多為單堿基插入或缺失[26, 31]，雙靶點(diǎn)編輯方式明顯提高了對基因的編輯效率，通過篩選較易獲得成片段堿基缺失或插入突變體。本研究共獲得15種純合突變類型植株，突變類型較為多樣，其中來源于同一個T0代株系的和突變體在靶點(diǎn)1區(qū)域缺失25個堿基，區(qū)別在于突變體在靶點(diǎn)2發(fā)生單堿基A插入突變，而突變體在第2個靶點(diǎn)則沒有發(fā)生突變，表明突變體中的基因編碼產(chǎn)物在靶點(diǎn)1區(qū)域缺失8個氨基酸，并且其后續(xù)的氨基酸發(fā)生錯碼翻譯，直到在靶點(diǎn)2區(qū)域，隨著A堿基插入，靶點(diǎn)2后翻譯的氨基酸序列恢復(fù)正常；另有T0代突變體在T2代植株中分離出兩種純合突變類型，和突變體，其中，突變體在靶點(diǎn)1區(qū)域插入283個堿基大片段，在靶點(diǎn)2插入1個A堿基，而突變體則在靶點(diǎn)1插入A堿基，在靶點(diǎn)2缺失10個堿基的小片段，表明突變體在2個靶點(diǎn)區(qū)域發(fā)生氨基酸的錯碼翻譯與缺失，自靶點(diǎn)2位點(diǎn)后翻譯的氨基酸恢復(fù)正常；其余突變體株系的T2后代基本在兩個靶點(diǎn)位置都是單堿基插入突變，會引起目標(biāo)基因的表達(dá)受到抑制或表達(dá)的氨基酸編碼框發(fā)生兩次移碼變異。由以上結(jié)果可見，從轉(zhuǎn)基因株系的T2代基因分離后的植株中篩選出遺傳穩(wěn)定、編輯類型相對多樣的純合突變體植株，這些突變體的缺失或插入堿基數(shù)大部分非3的倍數(shù)，會造成氨基酸殘基缺失或局部編碼框移碼，或由于錯碼翻譯使其提前遇到終止密碼子而引起編碼序列提前終止。本研究采用的雙靶點(diǎn)編輯設(shè)計有效地提高了對基因的突變頻率，從T2后代中較易篩選到純合突變植株，獲得了較好的突變效果。

生長素作為一種促進(jìn)植株器官伸長生長的植物激素，在植物生長過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。本研究對創(chuàng)建的突變體T2代植株的表型進(jìn)行田間調(diào)查，發(fā)現(xiàn)所有突變體植株的分蘗成穗率均顯著低于野生型中花11，其中，、、、、、和突變體的分蘗數(shù)均比野生型增多，但有效穗數(shù)與野生型無顯著差異；而、、和突變株的分蘗數(shù)與野生型無顯著差異，但其有效穗?yún)s較野生型顯著減少；、和突變體的分蘗數(shù)多于野生型，有效穗較野生型減少（表2）。以上對分蘗數(shù)和有效穗的調(diào)查結(jié)果表明，突變導(dǎo)致植株有較多分蘗沒有最終形成有效穗，變?yōu)闊o效分蘗，分蘗成穗率降低，而造成無效分蘗增多的原因，可能是突變體植株的基因突變引起分蘗芽增多，其中低節(jié)位早發(fā)分蘗芽能有效成穗，后期產(chǎn)生的遲發(fā)分蘗芽則較難成穗，變成無效分蘗。此外，、和突變體水稻的有效穗較野生型減少，但其千粒重卻比野生型顯著提高，表現(xiàn)出通過提高千粒重的方式來彌補(bǔ)有效穗減少的不足，從而盡量維持單株產(chǎn)量穩(wěn)定。

在生長素信號途徑中，、和調(diào)控生長素透過細(xì)胞質(zhì)膜的輸出與輸入轉(zhuǎn)運(yùn)，建立起組織及細(xì)胞間的非對稱生長素分布，有研究指出，在生長素促進(jìn)不定根形成和分蘗產(chǎn)生過程中起重要作用，抑制表達(dá)會引起轉(zhuǎn)基因水稻植株分蘗數(shù)目增加和分蘗角度改變[33]，而調(diào)控生長素從地上部向地下與地上結(jié)合處的極性運(yùn)輸，引起自由生長素在結(jié)合處的非組織特異性積累，與和協(xié)同參與生長素調(diào)控的水稻株型構(gòu)建[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，在突變體水稻中，隨著基因被編輯突變，其表達(dá)水平顯著下調(diào)，生長素轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控基因、和的表達(dá)水平也隨著降低（圖6），表明作為生長素信號途徑中的響應(yīng)因子，可能位于生長素代謝途徑上游，通過感受環(huán)境中的生長素信號，進(jìn)而影響生長素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白產(chǎn)生，調(diào)節(jié)生長素的極性運(yùn)輸，促進(jìn)生長素在地下部與地上結(jié)合處積累，從而抑制原生細(xì)胞向腋芽組織分化。而在突變體水稻中，隨著表達(dá)受到抑制，由、、等生長素轉(zhuǎn)運(yùn)基因調(diào)控的生長素自上而下的極性運(yùn)輸受到影響，致使生長素在地下部與地上結(jié)合處積累減少，低濃度生長素則有利于原生細(xì)胞向腋芽組織分化發(fā)育，并促使形成新的分蘗芽，而遲發(fā)的分蘗芽并不能形成有效穗，最終導(dǎo)致無效分蘗數(shù)目增多，植株成穗率明顯降低。此外，由于基于CRISPR/Cas9技術(shù)的基因編輯突變類型存在差異，雖然所有突變體植株中的表達(dá)均受到抑制，但不同突變體間的表達(dá)受抑制程度存在一定差別，導(dǎo)致下游、、等生長素轉(zhuǎn)運(yùn)基因在不同突變體間產(chǎn)生不同程度的差異性抑制表達(dá)，并最終引起田間表型性狀產(chǎn)生差別，但其影響分蘗芽發(fā)生與成穗的主要生理表型基本表現(xiàn)一致。該研究結(jié)果對水稻的株型塑造等田間表型改良有積極意義，但影響生長素促控水稻分蘗腋芽發(fā)生及其促控后期分蘗芽成穗的分子生態(tài)機(jī)制，仍有待進(jìn)一步的探究和證實(shí)，我們將在以后的研究工作中進(jìn)一步詳細(xì)探索。

4 結(jié)論

通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功創(chuàng)建了突變體，并從T2代植株中獲得15種類型的純合突變體，突變體總分蘗數(shù)相對增加，有效穗數(shù)保持穩(wěn)定或減少，分蘗成穗率變低，生長素響應(yīng)與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)降低，生長素轉(zhuǎn)運(yùn)途徑受到抑制。研究結(jié)果對家族基因生理功能揭示以及生長素促控水稻分蘗發(fā)生機(jī)理等方面研究具有積極意義，并為水稻理想株型選育、合理田間群體結(jié)構(gòu)建立等提供了重要種質(zhì)資源基礎(chǔ)。

在線輔助性信息：附表1見《中國水稻科學(xué)》網(wǎng)站(http://www.ricesci.cn)。

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Construction ofMutants in Rice Based on CRISPR/Cas9 Technology and Investigation on Their Agronomic Traits

LI Zhaowei1, SUN Congying1, LING Donglan1, ZENG Huiling1, ZHANG Xiaomei1, FAN Kai2, LIN Wenxiong1,*

(1College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University / Fujian Provincial Key Laboratory of Agroecological Processing and Safety Monitoring, Fuzhou 350002, China;2College of Agriculture, Fujian Agriculture and Forestry University / Key Laboratory of Ministry of Education for Genetics, Breeding and Multiple Utilization of Crops, Fuzhou 350002, China;*Corresponding author, E-mail: wenxiong181@163.com)

【Objective】The purpose is to offer a deep insight into the biological function ofand its effect on agronomic traits during the growth and development stage of rice.【Method】CRISPR/Cas9 technology was employed to edit the gene sequence ofand to obtain the mutants ofvariety Zhonghua 11.The agronomic traits of the mutants were investigated in a field experiment.【Result】Twenty-two T0transgenic lines were obtained through-mediated infection ofrice Zhonghua 11 callus, and twenty positive transgenic lines were distinguished by screening the gene encoding hygromycin.For T2transgenic lines, the regions of genomic DNA including two target sites were detected and identified by PCR amplifying and sequencing, and fifteen homozygous mutations were confirmed.Gene expression results displayed that the expression levels of,,, andin themutants were significantly lower than those in the wild type.In comparison with the wild-type plants,mutants showed a significant decrease in the productive panicle percentage.Among them, themutants with more tillers than the wild type showed a similar effective panicle number to the wild type, and themutants with the same tiller number as the wild type presented a decrease in the effective panicle number per plant in paddy field conditions, resulting in increased non-productive tillers and decreased effective panicle percentage.【Conclusion】was involved in the emergence and development of tiller bud dominated by auxin, and the successful construction ofmutants plays a positive role in revealing the biological function ofand the mechanism of tiller formation and development dominated by auxin.

rice; gene editing;; CRISPR/Cas9; auxin

10.16819/j.1001-7216.2022.210117

2021-01-17;

2021-04-22。

國家自然科學(xué)基金資助項目(31701329); 福建省自然科學(xué)基金資助項目(2021J01098); 中國博士后科學(xué)基金資助項目(2015M580560)。