納米抗體特性及其在農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素檢測中的應(yīng)用

蔡沖，閆洪林，唐曉倩，張奇,2,3,4,5，張文,2,3,4,5*，李培武,2,3,4,5*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北 武漢， 430062；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢， 430062；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部生物毒素檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢， 430062；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（武漢），湖北 武漢， 430062；5.國家農(nóng)業(yè)檢測基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室（生物毒素），湖北 武漢， 430062）

抗體（antibody）作為免疫系統(tǒng)的核心材料一直備受關(guān)注，傳統(tǒng)的單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）、多克隆抗體（polyclonal antibody，pAb），以及近年來興起的基因工程抗體在農(nóng)業(yè)和生命科學(xué)等領(lǐng)域占據(jù)舉足輕重的位置。納米抗體（variable domain of heavy chain of the heavy chain antibody,VHH）作為基因工程抗體的一種，由于具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、產(chǎn)量高、耐受有機(jī)溶劑等優(yōu)點(diǎn)得到突飛猛進(jìn)的發(fā)展[1，2]。駱駝科動(dòng)物（單峰駱駝、雙峰駱駝、羊駝等）體內(nèi)既存在傳統(tǒng)的單克隆抗體，又含有一種結(jié)構(gòu)和功能都比較特殊的重鏈抗體（heavy chain antibodies, HCAbs）。HCAb 由抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域組成。而駝源納米抗體就是由駱駝科動(dòng)物血清中提取的HCAb，其中的抗原結(jié)構(gòu)域，不含有輕鏈和第一常數(shù)結(jié)構(gòu)域（the first constant domain,CH1），僅含有重鏈可變區(qū)的自然結(jié)構(gòu)域的一種工程抗體[3～5]。

本文總結(jié)了納米抗體國內(nèi)外研究進(jìn)展，旨在介紹其結(jié)構(gòu)、生化特性以及其在農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素檢測中的應(yīng)用，以期為納米抗體的充分開發(fā)和利用，特別是為其在農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素檢測方面的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 納米抗體的結(jié)構(gòu)

納米抗體為目前發(fā)現(xiàn)的尺寸最小的天然抗原結(jié)合片段，分子量僅為15 kDa，是傳統(tǒng)單克隆抗體分子量（150 kDa）的十分之一，小于同為基因工程抗體的單鏈抗體（single-chain fragment variable, scFv,分子量為27 kDa）和抗原結(jié)合片段（fragment antigen binding, Fab, 分子量約為57 kDa），其結(jié)構(gòu)如圖1 所示。納米抗體直徑為2.5 nm，高度為4 nm。折疊的VHH 由9 條β 鏈組成，這些β 鏈組成一個(gè)四鏈β 折疊和五鏈β 折疊，由互補(bǔ)決定區(qū)（complementary determining region, CDR）和骨架區(qū)（fragment region,FR）內(nèi)存在的二硫鍵連接[6]。VHH 結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)緊湊的扁長型，類似于橄欖球，形成一個(gè)凸?fàn)罨パa(bǔ)表位，VHH 具有強(qiáng)大的抗原結(jié)合能力，可以輕松地接觸到蛋白表面的空洞或裂隙[7,8]，而這些空洞或者裂隙是傳統(tǒng)單克隆抗體無法接觸到的。

大體上VHH 的結(jié)構(gòu)與抗體重鏈可變區(qū)（variable region of heavy chain, VH）相似，但也存在些許差異：

（1）VH 上FR2 區(qū)的高度保守的疏水氨基酸（Val37，Gly44，Leu45和Trp47）分別被親水和（或）更小的氨基酸取代，一般為Phe37、Glu44、Arg45 和Gly47，分別對應(yīng)于圖1 納米抗體結(jié)構(gòu)FR2 區(qū)域紅色標(biāo)注的四個(gè)特征氨基酸。這些疏水氨基酸通常參與傳統(tǒng)抗體輕鏈和重鏈的組裝過程中，因此重塑此段結(jié)構(gòu)可以提高納米抗體的溶解度并減少聚集[6,9,10]。

圖1 單克隆抗體、單鏈抗體、抗原結(jié)合片段、重鏈抗體和納米抗體結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the structure of monoclonal antibody,scFv,Fab,heavy chain antibody and nanobody

（2）納米抗體CDR 區(qū)較長，特別是CDR3 區(qū)，在駱駝科動(dòng)物中平均長度為16 個(gè)氨基酸，而人和鼠VH 的CDR3 區(qū)分別為14 和12 個(gè)氨基酸，這通常被認(rèn)為是彌補(bǔ)缺少的輕鏈部分，以提供足夠大的區(qū)域結(jié)合抗原[11]。對VHH 和抗原結(jié)合物進(jìn)行X 衍射分析，結(jié)果表明CDR3 區(qū)為抗原抗體結(jié)合的主要貢獻(xiàn)部分[12]，并且CDR3 區(qū)有助于納米抗體和抗原形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，類似于常規(guī)抗體與抗原的結(jié)合。而且納米抗體更易于識(shí)別抗原某些隱蔽表位，例如酶的活性位點(diǎn)，較長的CDR3 區(qū)可以形成一個(gè)突出的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，從而使納米抗體可以結(jié)合特殊的構(gòu)象表位[8,13,14]。例如，有人認(rèn)為這些突出的環(huán)可能對靶向活性位點(diǎn)裂隙和隱秘的病毒表位具有特殊識(shí)別效果[15]。

（3）在許多的駝源納米抗體中，往往在CDR1 區(qū)和CDR3 區(qū)之間有二硫鍵的存在，有少數(shù)情況也位于CDR3 區(qū)和FR2 區(qū)之間[16]。此二硫鍵可能會(huì)限制CDR 區(qū)的柔韌性，可以實(shí)現(xiàn)更強(qiáng)的相互作用；也有報(bào)道稱，此二硫鍵可以使納米抗體識(shí)別更多的表位[10]。

2 納米抗體的生化特性

2.1 高親和力

VHH 與scFv有所區(qū)別，scFv是通過PCR技術(shù)擴(kuò)增在B細(xì)胞中成熟的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的外顯子隨機(jī)組裝而成，而VHH 則是通過存在于外周B淋巴細(xì)胞的外顯子直接通過PCR 技術(shù)擴(kuò)增即可獲得一個(gè)緊密的、較高親和力的抗體。VHH 獲得的動(dòng)力學(xué)kon和koff速率常數(shù)范圍分別為105～106M-1·s-1和10-2～10-4s-1，因此納米抗體可以在納摩爾甚至是皮摩爾范圍內(nèi)表現(xiàn)出親和力表位，這意味著納米抗體較傳統(tǒng)抗體或者其它基因工程抗體有相當(dāng)或更高的親和力[12,17,18]；另一種解釋方法為，納米抗體結(jié)構(gòu)中的CDR1 區(qū)和CDR3 區(qū)相連接的二硫鍵會(huì)明顯降低結(jié)合物的熵值，從而使得納米抗體具有較高親和力[8]。

2.2 高穩(wěn)定性

VHH 與多克隆抗體相比，各個(gè)生產(chǎn)批次之間相對穩(wěn)定，沒有較大的波動(dòng)。另外，一般情況下VHH具有較高的穩(wěn)定性，在4℃可以保存幾個(gè)月，在-20℃的溫度下可以保存更長的時(shí)間，與抗原的結(jié)合能力不受影響[9]。Zhang[19]等將納米抗體與單克隆抗體進(jìn)行熱穩(wěn)定性的比較，研究結(jié)果表明，納米抗體在80℃加熱60 min 后仍保留有30%的活性，而單克隆抗體在80℃加熱10 min 后與抗原的結(jié)合能力全部喪失。并且有研究表明，納米抗體較單克隆抗體和單鏈抗體的優(yōu)勢在于當(dāng)溫度下降時(shí)，納米抗體可以恢復(fù)天然構(gòu)象，而其它抗體構(gòu)象改變是不可逆的[1,20]。同時(shí)，He等[21]探究在不同有機(jī)溶劑處理下納米抗體和單克隆抗體的活性變化，結(jié)果表明納米抗體對甲醇、丙酮、乙腈和二甲基亞砜的耐受性強(qiáng)于單克隆抗體。

2.3 易表達(dá)

單克隆抗體是大型多聚體蛋白質(zhì)，需要進(jìn)行翻譯后修飾。因此，單克隆抗體生產(chǎn)需要在動(dòng)物體內(nèi)完成，通常需要大量的哺乳動(dòng)物以及繁瑣的純化步驟，從而導(dǎo)致昂貴的生產(chǎn)成本并限制其發(fā)展。相反，納米抗體可以在微生物系統(tǒng)（如大腸桿菌、釀酒酵母和畢赤酵母）、哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系或植物中高水平表達(dá)[22]。例如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，細(xì)菌每20 min 可復(fù)制一次，一般的培養(yǎng)時(shí)間為15 h，每升的培養(yǎng)基中可以獲得幾毫克的產(chǎn)量[23]，He 等[21]使用E.coliTOP 10F′表達(dá)系統(tǒng)純化后的納米抗體產(chǎn)量為4.2 mg/L；在酵母表達(dá)系統(tǒng)中可以獲得更高的產(chǎn)量，Chen 等[24]使用P. pastoris表達(dá)系統(tǒng)純化后的納米體產(chǎn)量為51.71 mg/L。

2.4 其它性質(zhì)

納米抗體具有簡單的基因序列，適宜于改造與修飾，從而實(shí)現(xiàn)某些特定的需求。由于納米抗體的FR2 區(qū)域被四個(gè)親水氨基酸所取代，因此納米抗體具有高親水性，較VL 更易形成雙價(jià)或多價(jià)的偶聯(lián)形式[25]。例如，F(xiàn)an[26]等將納米抗體以24聚體的方式在磷酸鐵蛋白上展示，形成一個(gè)新型的平臺(tái)，并命名為fenobody。透射電鏡分析結(jié)果顯示，納米抗體以6×4 束的排列方式圍繞在鐵蛋白的表面，此種結(jié)合方式較常規(guī)的納米抗體不僅在空間結(jié)構(gòu)上更加靈活，而且有更高的親和力，且親和力提高約180倍。

根據(jù)晶體學(xué)研究表明，抗原的結(jié)合表面是平坦或者凹入的，納米抗體的表面有一個(gè)凸起的抗原結(jié)合位點(diǎn)，使得它們能夠結(jié)合凹入的或者以其它方式結(jié)合受到嚴(yán)重阻礙的抗原的表面，這種能力使得納米抗體可以充當(dāng)酶抑制劑，可以識(shí)別更加隱蔽的表位，這是其它種類抗體所達(dá)不到的[8]。

駱駝科VHH 與人VH 具有高度的同源性，駝源納米抗體在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中均未引起動(dòng)物或者人類的免疫反應(yīng)，這意味著納米抗體較單克隆抗體更加適合作為治療藥物[5]。另外，納米抗體表現(xiàn)出更強(qiáng)的藥物代謝能力、更好的透過血腦屏障的能力，再次驗(yàn)證了納米抗體的巨大潛力[11,27]。

3 納米抗體在農(nóng)產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用

3.1 酶聯(lián)免疫吸附測定法

酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）是指以酶作為標(biāo)記物，利用抗原和抗體之間免疫結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的固相吸附測定方法。根據(jù)抗原和抗體性質(zhì)的不同，常見的ELISA方法包括直接法、間接法、雙抗體夾心法、競爭抑制法等。ELISA 是一種操作方便，可以用于大規(guī)模篩選、省時(shí)省力的研究方法，根據(jù)納米抗體的體積小特性，對其進(jìn)行加工修飾，可以建立方便、快捷且高靈敏的ELISA檢測技術(shù)。Houwelingen[28]等通過使用赭曲霉毒素A（ochratoxin A, OTA）完全抗原（OTABSA）免疫羊駝，篩選到與OTA特異性相結(jié)合的納米抗體，通過建立競爭ELISA測定其靈敏度（half-maximum inhibition concentration, IC50）為12 ng/mL。除了傳統(tǒng)形式上的ELISA 檢測方法外，目前有許多學(xué)者聚焦在納米抗體的修飾上，通過將納米抗體與其它信號(hào)標(biāo)簽融合實(shí)現(xiàn)高靈敏的ELISA 檢測（表1）。Sun[29]等描述了納米抗體與AviTag 標(biāo)簽融合并使用生物素-鏈霉親和素?cái)U(kuò)增（biotin-streptavidin-amplified, BA）ELISA 法，高靈敏、高精準(zhǔn)地檢測谷物中OTA。此方法較基于納米抗體ELISA 方法的靈敏度提高了4 倍，與液相色譜質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS）相比顯示出良好的一致性，可以應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測。Sun[30]等將抗OTA 特異性納米抗體與堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）融合表達(dá)，融合蛋白既保留了納米抗體與抗原之間特異性結(jié)合能力又具有酶促活力。為監(jiān)測水稻中的OTA 含量，建立一步競爭ELISA 法檢測，所建立方法的IC50為0.57 ng/mL，檢出限（limit of detection,LOD）為0.059 ng/mL，分別較基于納米抗體ELISA 分別提高了1.1 和2.7倍。

抗體表面主要有三種決定簇：同種型決定簇（isotypic determinant）、同種異型決定簇（allotypic determinant）和獨(dú)特型決定簇（idiotypic determinant）。根據(jù)丹麥科學(xué)家Jerne提出的免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說，抗體的獨(dú)特型決定簇可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體，此抗體和靶分析物競爭一抗的相同結(jié)合區(qū)域，這樣的抗體稱之為抗獨(dú)特型抗體[31]。通過文庫篩選到的抗獨(dú)特型納米抗體可以用于替代高毒抗原以及標(biāo)準(zhǔn)品的使用，減少對操作人員的危害同時(shí)也避免了對環(huán)境造成的二次污染，便于建立安全、無毒的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，具有廣闊的應(yīng)用前景。Wang[23]等使用黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）單克隆抗體免疫羊駝，建立免疫噬菌體展示文庫，通過生物淘選策略從文庫中篩選到可以與AFB1單克隆抗體特異性結(jié)合的納米抗體。使用篩選到的納米抗體作為包被抗原，建立農(nóng)產(chǎn)品中AFB1的競爭ELISA 檢測方法，所建立方法對AFB1的IC50為0.16 ng/mL，對黃曲霉毒素B2（aflatoxin B2,AFB2）、黃曲霉毒素G1（aflatoxin G1,AFG1）和黃曲霉毒素G2（aflatoxin G2, AFG2）的交叉反應(yīng)分別為90.4%、54.4%和37.7%。因此所建立的方法可以用于花生或飼料中總黃曲霉毒素進(jìn)行鑒定。Zhao[32]等利用淘選出的AFB1的特異型納米抗體（Nb28）作為“抗原”，從商品化的12肽庫中篩選到與Nb28 相結(jié)合的納米抗體作為Nb28 的模擬表位，即AFB1的抗獨(dú)特型納米抗體（命名為ME17）。利用ME17 和Nb28 開發(fā)了一種快速磁珠定向競爭ELISA（magnetic beads-based directed competitive ELISA,MB-dcELISA）。同時(shí)抗獨(dú)特型納米抗體還可以替代小分子真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，Wang[33]等使用AFB1抗獨(dú)特型納米抗體（VHH 2-5）替代AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，通過建立VHH 2-5 與AFB1之間的定量轉(zhuǎn)換方程，定量測定農(nóng)產(chǎn)品中AFB1含量。

3.2 免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）是一項(xiàng)利用DNA 復(fù)制原理，在生物體外復(fù)制特定DNA 片段的核酸合成技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)可以不依賴大腸桿菌或者酵母菌等生物體，在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)目的基因大量擴(kuò)增。免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（immuno-PCR,IPCR）則是將免疫學(xué)技術(shù)與PCR 技術(shù)相結(jié)合形成的一種全新的免疫檢測方法，其原理與ELISA 方法相似。ELISA 方法是利用顯色深淺來定量，而IPCR 技術(shù)則是利用擴(kuò)增DNA 分子為分析目標(biāo)物，根據(jù)擴(kuò)增目的片段的量進(jìn)行痕量分析，往往靈敏度更高，檢測限更低[34,35]。

Ji[36]等通過從天然噬菌體展示文庫中篩選到與OTA 單克隆抗體相特異性結(jié)合的納米抗體，即OTA抗獨(dú)特型納米抗體。采用此納米抗體噬菌體形式建立了非毒素IPCR 的定量檢測方法應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中OTA 的檢測。該檢測方法的LOD 為4.17 pg/mL（表1）。此方法較于噬菌體ELISA 的檢出限提高了9 倍。同樣，Liu[37]建立OTA 的IPCR 檢測方法，LOD值為3.7 pg/mL，線性范圍為0.01～1000 pg/mL。此方法與常規(guī)ELISA 相比具有良好的一致性，可以實(shí)現(xiàn)谷物中OTA的定量檢測。

表1 納米抗體在農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素檢測中的應(yīng)用Table 1 Application of nanobodies for determination of mycotoxins in agriculture products

Lei[38]等基于AFB1抗獨(dú)特型納米抗體的M13 噬菌體及其編碼DNA 設(shè)計(jì)特異性引物，建立準(zhǔn)確定量檢測農(nóng)產(chǎn)品中AFB1的IPCR 方法，檢測靈敏度比傳統(tǒng)的噬菌體ELISA 提高了4 倍，且以玉米、大米、花生等黃曲霉毒素污染的主要農(nóng)作物為檢測樣本，驗(yàn)證了該方法的有效性。為了解決農(nóng)產(chǎn)品多種真菌毒素混合污染同步檢測技術(shù)難題，Ren[39]等建立了一種抗獨(dú)特型納米抗體噬菌體展示介導(dǎo)IPCR方法，編碼抗獨(dú)特型納米抗體的特定DNA 序列用于設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物，此方法用于同時(shí)測定谷物中總黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEN），其檢測結(jié)果與高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）具有較高的一致性。

3.3 免疫傳感器法

近幾年中，免疫傳感器（immunosensor）因其小巧、方便、易于使用并且能夠在現(xiàn)場即時(shí)檢測而受到了廣泛的關(guān)注與應(yīng)用。免疫傳感器是一種將生物信號(hào)轉(zhuǎn)換為可識(shí)別信號(hào)的分析設(shè)備。免疫傳感器通常由三個(gè)部分組成：嫁接到傳感器表面的配體，該配體可以通過特定的相互作用識(shí)別目標(biāo)；將轉(zhuǎn)換器表面的生物信號(hào)轉(zhuǎn)化為可識(shí)別的物理信號(hào)；放大并分析信號(hào)的檢測器[40,41]。

Pan[42]等基于納米抗體分子量較小的特點(diǎn)和納米材料的電化學(xué)特性，開發(fā)了一種針對AFB1小分子直接、高靈敏檢測的電化學(xué)免疫傳感器。與使用單克隆抗體制備的免疫傳感器相比，此免疫傳感器的線性范圍擴(kuò)大了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，靈敏度提高了10 倍，具有可重復(fù)性和高穩(wěn)定性。Liu[43]等建立一種基于納米抗體的免疫傳感器，與辣根過氧化物酶串聯(lián)體修飾的雜交鏈反應(yīng)信號(hào)放大系統(tǒng)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對AFB1的快速、超靈敏的檢測。在最佳的條件下，免疫傳感器的LOD 為68 fg/mL，線性范圍為0.5～10 ng/mL。此傳感器與其它常見的小分子真菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)，且具有良好的穩(wěn)定性。生物傳感器具有響應(yīng)快速、高度自動(dòng)化、支持現(xiàn)場檢測等優(yōu)點(diǎn)，因此建立與不同新材料相結(jié)合的檢測手段，以期拓寬對農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素超靈敏檢測的研究。

3.4 側(cè)向流免疫分析法

側(cè)向流免疫分析（lateral flow immunoassay,LFIA）是現(xiàn)場檢測真菌毒素的一種重要手段，與其它檢測手段相比最顯著的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是不需要大型儀器的支撐，僅需要可攜帶的小型儀器或肉眼便可以實(shí)現(xiàn)結(jié)果的判定。側(cè)向流免疫分析適用于現(xiàn)場檢測、操作方便、靈敏度高、成本低、可以批量生產(chǎn)，因此得到了較為廣泛的應(yīng)用[44]。

農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素多為混合污染，因此建立農(nóng)產(chǎn)品中多種真菌毒素的同步檢測技術(shù)是十分必要的。Yan[45]等建立了一種基于量子點(diǎn)/量子點(diǎn)微球（quantum dots/quantum dot microbread, QDs/QB）多重免疫層析法（multiplex immunochromatographic assay, mICA），用于對伏馬毒素B1（fumonisin, FB1）、ZEN 和OTA 高靈敏度、多組分同步檢測。選擇QD和QB 作為熒光基因指示劑，與抗真菌毒素的單克隆抗體偶聯(lián)。此外，將FB1、ZEN 和OTA 的抗獨(dú)特型納米抗體與麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein,MBP）的可溶性單價(jià)融合體作為模擬包被抗原噴涂于檢測線。采用此種檢測方法可以在10 min內(nèi)得到結(jié)果，對于FB1、ZEN 和OTA 的視覺檢測限分別為0.25 ng/mL、3.0 ng/mL 和0.5 ng/mL。經(jīng)驗(yàn)證，此方法具有良好的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和實(shí)用性，適用于現(xiàn)場快速檢測。Tang[46]等為同時(shí)檢測玉米或玉米制品中AFB1和ZEN，使用兩種毒素的抗獨(dú)特型納米抗體與新型的Eu/Tb(III)納米球相偶聯(lián)，并將納米球作為標(biāo)記物。建立了時(shí)間分辨熒光免疫紙層析（time-resolved fluorescence immunochromatographic assay, TRFICA）同步檢測方法，方法對于AFB1和ZEN 的IC50分別為0.46 ng/mL 和0.86 ng/mL，相比較使用兩種毒素對應(yīng)單克隆抗體所建立的TRFICA方法靈敏度分別提高了18.3和20.3倍。

3.5 其它方法

Tang[47]等認(rèn)為納米抗體中的色氨酸殘基可以用于激發(fā)檢測OTA 和赭曲霉毒素B（ochratoxin B,OTB）的受體熒光。因此，建立了一種非競爭性、均相熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）免疫分析方法，用于同時(shí)檢測OTA和OTB。在最佳條件下，基于納米抗體的FRET 方法對OTA 和OTB 的檢出限分別為：0.06 ng/mL 和0.12 ng/mL。且與其類似物交叉反應(yīng)率可以忽略不計(jì)，在加標(biāo)回收試驗(yàn)中有良好的準(zhǔn)確度。Tang[48]等研制出一種快速現(xiàn)場檢測谷物中OTA 的免疫分析方法。此方法是將納米抗體與堿性磷酸酶融合后固定在聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜上，對OTA 進(jìn)行一步定性的視覺檢測，檢測過程可在6 min 中內(nèi)完成，并證明此方法可以用于實(shí)際樣品檢測。

4 結(jié)論與展望

農(nóng)產(chǎn)品安全關(guān)系到人民生命健康以及產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。農(nóng)產(chǎn)品的種、收、貯、運(yùn)的各個(gè)環(huán)節(jié)均容易受到真菌毒素的污染，不僅造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失還容易影響人畜健康。因此，迫切需要建立快速、靈敏的檢測手段以用于檢測農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素的污染情況。免疫學(xué)檢測手段的快速發(fā)展使得這種需要成為可能，抗體作為免疫學(xué)檢測的核心材料更是得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。在分子克隆和表面展示技術(shù)快速發(fā)展的推動(dòng)下，已研制出多種納米抗體應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素檢測。本文綜述了納米抗體的特性及在農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素檢測中的應(yīng)用，具體分析了納米抗體的結(jié)構(gòu)和生化性質(zhì)，比較分析了酶聯(lián)免疫吸附測定法、免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法、免疫傳感器法、側(cè)向流免疫檢測法等在農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素檢測中的應(yīng)用，以期為農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素檢測與監(jiān)測提供參考。在目前的實(shí)際工作中，納米抗體在小分子分析方面的性能與傳統(tǒng)抗體相當(dāng)，易于適應(yīng)開發(fā)快速、高靈敏性檢測痕量分析物的方法。但是，由于真菌毒素均為小分子物質(zhì)，從展示文庫中淘選到理想的納米抗體具有一定的難度與挑戰(zhàn)，阻礙了納米抗體的發(fā)展。因此，在免疫學(xué)與生物學(xué)的基礎(chǔ)上，需要進(jìn)一步探索和開發(fā)具有豐富多樣性、大容量的展示文庫構(gòu)建手段；快速、廉價(jià)、高效的納米抗體篩選技術(shù)；高靈敏、高特異性納米抗體的制備技術(shù)，以適應(yīng)于農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素檢測與監(jiān)測的廣泛需求，并朝向自動(dòng)化與智能化的方向發(fā)展。