大豆花葉病毒病轉基因抗性研究進展

高樂，李志強，李凱，智海劍*

（1.北京農業(yè)職業(yè)學院園藝系，北京 ， 102442；2.南京農業(yè)大學國家大豆改良中心/農業(yè)農村部大豆生物學與遺傳育種重點實驗室/作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室，江蘇 南京， 210095）

大豆[Glycine max(L.)Merr.]是世界上最重要的豆類作物，是人類飲食中優(yōu)質植物油和蛋白質的主要來源，富含異黃酮、維生素、礦物質、磷脂、皂素等活性成分，對人類健康極為有益[1]。大豆在生長發(fā)育過程中容易受到多種病原物的侵害，包括卵菌、線蟲、真菌、細菌、病毒等，其中大豆花葉病毒（soybean mosaic virus，SMV）引起的病毒病是大豆上最為流行的病害，嚴重影響大豆的產量和品質[2～5]。

SMV屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae），馬鈴薯Y 病毒屬（Potyvirus），基因組為線性單鏈正義[ss(+)]RNA，全長約10 kb，編碼11 種多功能蛋白，從5＇N 端到3＇C端依次為P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb、CP（圖1）[4,6]。根據病毒分離物在大豆鑒別寄主上的癥狀反應和致病性差異，中國、美國、日本分別將SMV 劃分為22 個株系（SC1～SC22）[7]、7 個 株 系（G1～G7）[8]、5 個 株 系（A～E）[9]。SMV 以種子帶毒作為初侵染源，被30 多種蚜蟲非持久性傳播，造成田間病害流行[4,10]。大豆感染SMV 后，會產生花葉和壞死等癥狀，造成植株光合面積減少和光合能力降低，生長量下降，植株矮化，籽粒出現褐斑，通常造成大豆減產8%～35%，嚴重時產量損失在50%以上甚至絕收[2～6,10]。

圖1 大豆花葉病毒（SMV）基因組結構和蛋白切割位點[6]Fig.1 Genome organization and cleavage sites of soybean mosaic virus(SMV)[6]

目前尚無有效的化學藥劑可以防治大豆花葉病毒病，培育抗病大豆品種是最經濟、安全、有效的途徑[11,12]。然而，傳統(tǒng)的抗病育種周期漫長，育成品種的抗譜較窄且抗性容易因病毒的變異而喪失[13,14]。轉基因技術可以挖掘跨物種基因資源，或通過基因編輯技術創(chuàng)造出新的基因，從而拓寬遺傳基礎，這些優(yōu)勢使其成為大豆抗病毒研究的有力手段，為大豆抗病育種提供重要的理論依據。這些技術的有關報道包括：過量表達SMV 抗病基因，可以誘導大豆產生正向抗性；應用RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術沉默寄主感病因子，可以誘導大豆產生負向抗性；過量表達SMV CP 外殼蛋白或是應用RNAi 技術靶向SMV 基因組，可以誘導大豆產生病原物誘導的抗性，等等（表1）。

表1 大豆花葉病毒?。⊿MV）轉基因抗性的研究報道Table 1 Reports of transgenic resistance to soybean mosaic virus disease

1 大豆對SMV的正向抗性

在寄主體內過量表達內源或外源抗病基因，可以誘導寄主產生對病毒的正向抗性。例如將天然的SMV 抗病基因導入大豆，抗病基因所編碼的蛋白質能夠識別特定的病原物效應子（無毒基因），刺激相關的激素信號傳導途徑并激活防御反應機制，從而以“基因對基因”的方式抵御病毒入侵。Liu 和Whitham[15]在本氏煙葉片中瞬時表達了一個含有III型DnaJ 結構域的大豆基因GmHSP40.1，植株發(fā)生過敏性壞死反應，說明該基因與抗病相關；應用病毒誘導的基因沉默技術（virus-induced gene silencing，VIGS）沉默GmHSP40.1增強了大豆對SMV的敏感性，進一步證實了該基因在大豆抗病中的關鍵作用[15]。Zhou 等[16]將大豆鉀離子（K+）通道相關基因GmAKT2導入栽培大豆品種Williams 82 中，轉基因大豆植株對SMV 的抗性得到了顯著提高，說明改變K+轉運蛋白的表達水平是提高大豆SMV 抗性的一種新型有效的方法。Zhou 等[17]將鉬輔因子生物合成蛋白相關基因GmCnx1導入大豆中，促進了硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）和乙醛氧化酶（aldehyde oxidase，AO）的上調表達（分別增加了2.6 倍和3.9 倍），提升了轉基因大豆的生理和抗逆作用，從而增強了SMV 抗性。馬露萍[18]將促絲裂原活化蛋白激酶相關基因GmMAPKKK導入大豆中，提高了大豆對SMV 的抗性和耐受力，通過檢測發(fā)現相關防御基因得到了上調表達，推測這可能是通過刺激水楊酸（salicylic acid，SA）信號傳導途徑實現的。He等[19]分別對抗、感大豆品種接種SMV，在轉錄組水平上比較分析了品種間的基因表達差異，發(fā)現赤霉素刺激轉錄的一個亞基因組在感病品種中被下調，而在抗病品種中沒有變化；序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，其中一個基因GmSN1與馬鈴薯抗病基因Sna?kin-1密切相關，并且在大豆中過量表達GmSN1能夠顯著增強轉基因大豆對SMV 的抗性水平，作者推測GmSN1最有可能通過影響信號轉導和免疫響應相關基因的表達水平來增強植物的抗病性。Xun等[20]在大豆中過表達了一個TIR-NBS-LRR 型抗病基因GmKR3，發(fā)現轉基因大豆對多個SMV株系的抗性均顯著提高；進一步研究發(fā)現，轉基因大豆中脫落酸（abscisic acid，ABA）分解代謝相關基因下調表達，且ABA 響應基因上調表達，推測這種增強的SMV 抗性至少部分是通過ABA 信號途徑實現的。牛陸等[21]和Yang 等[22]利用核糖核酸酶PAC1 能夠識別和降解植物RNA 病毒復制過程中產生的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）這一特性，將來源于粟酒裂殖酵母菌（Schizosaccharomyces pombe）的PAC1基因導入Williams 82 中，顯著抑制了大豆體內SMV 的積累以及癥狀的發(fā)展，增強了轉基因大豆對多個SMV 株系的抗性水平。Ishibashi等[23]圖位克隆了SMV 廣譜抗性基因Rsv4，該基因編碼具有dsRNA 降解活性的RNase H 家族蛋白，能夠在病毒復合物組裝過程中進入病毒復制室降解病毒的dsRNA，并且通過轉化感病大豆品種進一步明確了該基因的抗病功能。

2 大豆對SMV的負向抗性

沉默寄主內源感病因子，可以誘導寄主產生對病毒的負向抗性。例如應用RNAi 技術沉默大豆感病因子，感病基因編碼的蛋白質在SMV 的侵染循環(huán)中是必不可少的，因此一個或多個感病因子的缺失或突變可以阻斷病毒與寄主因子的相互作用，限制病毒的繁殖、復制和運動，激活防御反應機制，從而產生負向抗性，即“感病性喪失”誘發(fā)的抗性。Liu等[24]利用VIGS 技術沉默大豆內源基因GmMPK4，顯著上調了SA 信號途徑中參與防御反應基因的表達水平，增加了SA 和H2O2的積累量，從而增強了對SMV 的抗性；而與生長發(fā)育有關基因的表達水平顯著下調，表明該基因負向調控寄主抗病防御反應且正向調控寄主的生長發(fā)育。Liu 等[25]利用VIGS 技術沉默大豆內源基因GmMPK6，導致葉片發(fā)育遲緩和細胞程序性死亡，這是激活防御反應的典型表現，從而增強了寄主對SMV 的抗性。Gao 等[14]發(fā)現接種SMV 后，感病大豆品種的真核翻譯起始因子GmeIF4E的表達水平明顯上調，而抗病品種的GmeIF4E變化不顯著，說明感病品種的GmeIF4E參與了SMV 的侵染過程；進一步利用RNAi 技術創(chuàng)制了沉默GmeIF4E的轉基因大豆材料，通過抗病鑒定證實該轉基因材料對多個SMV 株系都具有良好的抗性，為培育SMV 廣譜抗病大豆提供了新方法。Luan 等[26]前期利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到一個能夠與SMV高度互作的大豆感病因子GmVma12，之后應用RNAi技術將該基因的反向重復序列（invertedrepeat sequence，IRS）導入到大豆中，抑制了GmV?ma12的表達水平，從而誘導了大豆對SMV 的抗性。Zong 等[27]利用二代測序技術證實SMV CP 蛋白和大豆的一個DnaJ 型蛋白存在互作，進而利用VIGS 技術沉默該大豆蛋白的編碼基因GmCPIP，發(fā)現病毒的積累量顯著下降，增強了大豆對SMV的抗性。

3 病原物誘導的SMV抗性

將病原物自身的基因序列導入寄主，能夠誘導寄主產生對該病原物的抗性，即病原物誘導的抗性。例如在大豆體內過量表達SMV CP 外殼蛋白或是應用RNAi 技術靶向SMV 基因組，均可以誘導大豆產生SMV 抗性。Wang 等[28]通過農桿菌介導法將SMV 外殼蛋白CP基因和3＇-UTR 轉入大豆中，在獲得的轉基因材料中鑒定到兩個SMV 高抗家系，這是誘導大豆產生病原物誘導抗性的首個報道；該研究團隊在后續(xù)的試驗中進一步評估了轉基因大豆品系的田間表現，分析了SMV 的時空動態(tài)變化，結果證明病原物誘導的抗性可以有效減少轉基因大豆中病原體的傳播[29]。Furutani 等[30,31]通過基因槍轟擊法將SMV 減毒分離株的CP基因導入大豆品種Jack 的體細胞胚中，獲得了三個對SMV 具有高強度抗性的家系，并最終證實雖然采用過表達SMVCP基因的手段，但誘發(fā)了RNAi 介導的抗性。Zhang等[32]利用單個轉基因元件同時表達幾個短的IRS，每個IRS 都包含一種病毒的高度保守序列，最終以這種策略獲得的轉基因植株對包括SMV 在內的三種病毒均表現出強大的系統(tǒng)抗性。章潔瓊等[33]利用RNAi 技術靶向SMVCP基因，獲得了單拷貝插入、外源基因能夠穩(wěn)定遺傳的轉基因植株，抗病鑒定實驗證明該轉基因材料對SMV具有良好的抗性。Kim等[34,35]利用RNAi 技術分別靶向SMVCP和HC-Pro基因，獲得的轉基因植株表現出良好的SMV 抗性，并且在抗性植株中消除了種皮斑駁的現象。Gao等[13]利用RNAi 技術，將含有SMVHC-Pro基因片段的IRS 導入到多個栽培大豆品種中，獲得了大量的轉基因材料，并且誘發(fā)了高強度、穩(wěn)定遺傳的SMV抗性。楊向東等[36]利用RNAi 技術靶向與SMV 運動和寄主范圍有關的P3基因，獲得了單拷貝整合形式的轉基因大豆植株，顯著提高了轉基因材料對SMV的抗性水平，并且抗性可以穩(wěn)定遺傳。Yang 等[37,38]從SMV SC3 株系中分別克隆了P3和NIb的基因片段，利用RNAi 技術獲得的轉基因大豆家系在連續(xù)三年的田間試驗條件下對多個SMV 株系表現出穩(wěn)定、高強度的抗性。

4 大豆對其他病毒的轉基因抗性

除了SMV 以外，菜豆莢斑駁病毒（bean pod mottle virus，BPMV）、苜?；ㄈ~病毒（alfalfa mosaic virus，AMV）、菜豆普通花葉病毒（bean common mosaic virus，BCMV）、西瓜花葉病毒（watermelon mosaic virus，WMV）也能夠經常在大豆田中檢測到，當這些病毒復合侵染寄主并進行協(xié)同作用時，會進一步加劇大豆產量的損失[13,14,22,32,37,38,41]。此外，SMV 與其他Potyvirus成員之間存在著頻繁的種間遺傳物質交換：Chen 等[42]從天南星科（Araceae）植物半夏（Pinel?lia ternata）中分離出一種類似于SMV 病毒的分離物，測序結果顯示它是由SMV 和芋花葉病毒（dasheen mosaic virus，DsMV）重組產生的，這是SMV 自然侵染天南星科植物的首次報道；近年來發(fā)現一種新型SMV 重組株系，廣泛流行于中國大豆種植區(qū)，它是由SMV 和BCMV 或類似于BCMV 的病毒重組產生的[43～46]；Jiang等[47]報道了一個由SMV和WMV重組產生的SMV 分離物，能夠在大豆和本氏煙中引發(fā)不同類型的癥狀。上述報道說明大豆田間的病毒病害具有復雜性和潛在的不確定性，對大豆的生產實踐提出了嚴峻的考驗，因此在防治SMV 的同時，也要警惕其他病毒的協(xié)同危害。

近年來，研究人員利用轉基因技術成功培育出兼抗多種病毒的轉基因大豆品系：Zhang等[32]分別克隆了AMV、BPMV、SMV 高度保守的短序列（小于150 bp），并且串聯組裝成單個轉基因元件，最終獲得的轉基因大豆能夠同時抵御這三種病毒的侵染，展現出強大的系統(tǒng)抗性；Yang等[37,38]和Gao等[14]分別利用RNAi技術靶向沉默SMVNIb/P3基因和大豆翻譯起始因子GmeIF4E基因，成功誘導轉基因大豆產生對SMV、BCMV、WMV 的高強度抗性；Xun 等[20]和Yang 等[22]分別過表達大豆內源抗病基因GmKR3和粟酒裂殖酵母菌PAC1基因，均發(fā)現轉基因大豆植株對SMV、BCMV、WMV、BPMV具有良好的抗性。

5 展望

傳統(tǒng)的大豆育種技術在SMV 抗病育種中仍占據主要地位，但其育種周期漫長且依賴于優(yōu)良的抗源，然而SMV 存在復雜的株系分化，大豆抗源對SMV 的抗性又具有株系專化性，因此傳統(tǒng)方法很難在短期內培育出對SMV 具有廣譜抗性的大豆新品種。此外，SMV 具有較強的變異性，育成大豆品種容易因SMV 株系的突變而喪失抗性，由于常年推廣種植抗病大豆品種，對SMV 產生了強大的定向選擇壓，導致“抗性-打破”型SMV 株系頻繁出現，最終造成品種的抗性喪失[6,39,40]。

轉基因技術可以打破物種間的屏障，挖掘跨物種基因資源或通過基因編輯技術創(chuàng)造出新的基因，在較短時期內完成抗病基因的定向改造、重組、轉移，從而拓寬遺傳基礎并為大豆抗病育種提供重要的理論依據，縮短優(yōu)良抗病品種的選育進程，為培育廣譜、持久抗性的轉基因大豆新品種提供了新的方法策略。近年來，大豆對SMV 轉基因抗性的研究取得了重要進展（表1），涵蓋正向抗性、負向抗性、病原物誘導的抗性，為轉基因大豆抗病育種提供了堅實的理論基礎。然而，盡管已經挖掘出了一定數量的SMV 抗病基因，也獲得了一些轉基因大豆抗病材料，但這些抗病基因和轉基因材料均未應用于生產實踐，因此轉基因大豆抗病育種還沒有取得實質的發(fā)展，商業(yè)化種植道路還十分遙遠。造成上述原因的根源在于轉基因技術的商業(yè)化發(fā)展受限于不同國家的管控政策以及大眾對該項技術的接受程度。因此，需要在傳統(tǒng)轉基因的基礎上引入新的技術手段，以期改變轉基因技術商業(yè)化發(fā)展難的問題。

近年來興起的CRISPR/Cas 基因組編輯技術是一種高效、精準、特異的基因組靶向修飾技術，相比于傳統(tǒng)的轉基因方法，該技術能夠利用序列特異性核酸酶實現DNA 特定位點的插入、缺失、突變或替換以及RNA 特定位點的靶向切割，該項技術已成為科研領域的熱門，為基因功能的研究和作物農藝性狀的定向精準改良提供了新的手段，將作物育種帶入了5G 時代[48]，同時也為改良植物的抗病性、加速抗病育種提供了新的思路[49]。目前已開發(fā)出不同類型的Cas 蛋白變體，其中SpCas9（Streptococcus pyo?genes）能夠靶向雙鏈DNA 結構[50]，FnCas9（Francisel?la novicida）[51]、LshCas13a（Leptotrichia shahii）[52]、Cas-Rx（Ruminococcus flavefaciens）[53]能夠靶向單鏈RNA結構，這分別為防治植物DNA 病毒和RNA 病毒開辟了新的途徑[49,54～56]。迄今為止，CRISPR/Cas 系統(tǒng)已被成功應用于不同種類的植物抗病毒研究中，包括本氏煙（Nicotiana benthamiana）[57～67]、擬南芥（Ara?bidopsis thaliana）[59,62,64,68-71]、番 茄（Solanum lycopersi?cum）[63]、大麥（Hordeum vulgare）[72]、黃瓜（Cucumis sa?tivus）[73]、木 薯（Manihot esculenta Crantz）[74]、水 稻（Oryza sativa）[67]、馬鈴薯（Solanum tuberosum）[75]、大豆（Glycine max）[76]。綜上表明，CRISPR/Cas 技術與傳統(tǒng)的轉基因技術相輔相成，在植物抗病毒研究領域蘊藏著巨大潛力[77]，為加速改良大豆的抗病性提供了全新的育種策略，對開展大豆基因編輯抗病育種具有深遠意義。