一個(gè)調(diào)控大豆根瘤數(shù)量的GmWUS2基因功能研究

韓露，渠可心，傅永福，陳慶山，武小霞*，張曉玫*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)/東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院大豆遺傳改良實(shí)驗(yàn)室，黑龍 江哈爾濱， 150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 ， 100081）

大豆是共生固氮類植物的典型代表，其根部可與根瘤菌共生并產(chǎn)生根瘤。根瘤具有固氮能力，在自然界氮素的循環(huán)中起著重要的作用[1]。結(jié)瘤的數(shù)量影響植物的固氮能力。結(jié)瘤由多種過(guò)程控制，包括外部環(huán)境和結(jié)瘤內(nèi)部的自動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制等[2,3]。結(jié)瘤的自動(dòng)調(diào)節(jié)通過(guò)涉及葉片的系統(tǒng)過(guò)程，來(lái)控制每株植物的根瘤數(shù)量。葉組織感知來(lái)自根部早期結(jié)瘤事件的信號(hào)，然后產(chǎn)生新信號(hào)并傳遞到根，進(jìn)一步限制根瘤的發(fā)生和發(fā)育[4]。

在植物器官發(fā)生過(guò)程中，分生組織細(xì)胞的有序分化和增殖依賴于其不同器官、不同組織區(qū)域細(xì)胞間的信號(hào)交流[5]。擬南芥AtWUS基因在莖端分生組織中心表達(dá)，其基因功能缺失突變體植株莖端分生組織不能有序維持，植株的地下部發(fā)育也受到影響[6～9]。在擬南芥中，AtWUS 和AtSTM 蛋白發(fā)生直接的相互作用，共同結(jié)合到AtCLV3基因的啟動(dòng)子上并激活其表達(dá)，從而調(diào)控莖端分生組織干細(xì)胞的活性[10～12]。當(dāng)CLV3 蛋白積累到一定量之后會(huì)反過(guò)來(lái)抑制AtSTM基因與AtWUS基因的表達(dá)[13]。這樣，At?WUS、AtSTM和AtCLV3共同維持莖端分生組織中干細(xì)胞的數(shù)量[14～15]。由于根瘤菌對(duì)根的侵染，誘導(dǎo)根生成一種多肽（CLV3），通過(guò)植物的傳導(dǎo)系統(tǒng)向地上運(yùn)輸[16～19]，介導(dǎo)合成與根瘤有關(guān)的信號(hào)因子，通過(guò)傳導(dǎo)系統(tǒng)向下傳至根部，從而調(diào)控根部結(jié)瘤的數(shù)量和發(fā)生位置[20]。CLV3 蛋白的積累量會(huì)影響WUS基因的表達(dá)[1,21～24]。但大豆中WUS基因是否介導(dǎo)結(jié)瘤有關(guān)的信號(hào)分子，從而調(diào)控根部結(jié)瘤的數(shù)量和發(fā)生位置尚不清楚。

為探究GmWUS2基因在大豆結(jié)瘤過(guò)程中的作用，本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9 基因編輯和發(fā)根轉(zhuǎn)化等技術(shù)[25]，分析GmWUS2基因?qū)Υ蠖菇Y(jié)瘤過(guò)程的影響。研究結(jié)果為闡明GmWUS2基因?qū)Ω霭l(fā)育的調(diào)控機(jī)制及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的大豆（Glycine max（L.）Mer.）為大豆品種天隆1 號(hào)。實(shí)驗(yàn)中所用大腸桿菌（Escherich?ia coli）菌株為DH5α；發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）為菌株K599；快生根瘤菌（Sinorhizobi?um fredii）菌株為HH103。植物表達(dá)載體Fu76，F(xiàn)u28，F(xiàn)u79，表達(dá)載體pSoy10 均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。主要試劑：所有連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶購(gòu)自TaKaRa。Gateway? LR Clonase? II enzyme mix 購(gòu)自Invitrogen。試劑盒及其他試劑：質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京博邁德公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；EasyPure?Plant RNA Kit 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司。PCR擴(kuò)增引物合成及DNA 序列測(cè)定由北京睿博興科有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 序列分析 利用Phytozome 網(wǎng)站的BLAST工具，將擬南芥AtWUS 蛋白氨基酸序列與大豆蛋白比對(duì)，尋找同源基因GmWUS2（Glyma. 11G07650 0）。將所得數(shù)據(jù)在MEGA 5.05 軟件中分析Gm-WUS2 氨基酸序列的相似性及繪制進(jìn)化樹。

1.2.2 啟動(dòng)子擴(kuò)增和相關(guān)載體的構(gòu)建 采用CTAB 法提取天隆1 號(hào)基因組DNA。根據(jù)Phytozome 基因組文庫(kù)中GmWUS2基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）上游3000 bp 片段，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（表1），擴(kuò)增GmWUS2啟動(dòng)子（GmWUS2pro）序列。以大豆天隆1 號(hào)DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。利用1.5% 的瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增序列。將擴(kuò)增出來(lái)的GmWUS2啟動(dòng)子片段，分別用XhoI 和BamH I 克隆位點(diǎn)連接到入門載體Fu76 上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，通過(guò)菌液PCR 篩選陽(yáng)性入門載體克隆Fu76-GmWUS2pro。通過(guò)LR反應(yīng)（Invitrogen），將入門載體Fu76-GmWUS2pro和另一個(gè)入門載體Fu79-GUS與雙元載體pSoy10 在LR 酶的作用下，產(chǎn)生GmWUS2pro:GUS表達(dá)載體（表2）。通過(guò)電轉(zhuǎn)法將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌K599 感受態(tài)，獲得相對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性農(nóng)桿菌。

表1 實(shí)驗(yàn)所需擴(kuò)增引物Table 1 A list of primers required in this study

1.2.3 構(gòu)建CRISPR/Cas9 突變載體 通過(guò)CRISPR工具設(shè)計(jì)GmWUS2基因的靶位點(diǎn)序列sgRNA。每個(gè)靶位點(diǎn)序列挑選2個(gè)評(píng)分高的，距離較近，均在外顯子區(qū)域的靶序列為編輯位點(diǎn)。然后合成兩個(gè)靶序列片段，并分別用BsaI 和BspQ I 酶切連接到Fu79-sgRNA。 將 Fu76-Cas9、 Fu79-sgRNA與pSOY10，通過(guò)LR 反應(yīng)將sgRNA 表達(dá)框和Cas9 表達(dá)框克隆到pSOY10 上（表2）。通過(guò)電轉(zhuǎn)法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌K599 感受態(tài)，獲得相對(duì)應(yīng)的農(nóng)桿菌。

1.2.4 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建 將GmWUS2基因的編碼區(qū)序列利用XbaI 和SphI 克隆位點(diǎn)，酶切連接至入門載體Fu28 上與GFP 標(biāo)簽融合，然后通過(guò)LR 反應(yīng)將其與Fu76-35S一起構(gòu)建至pSOY10 上（表2）。通過(guò)電轉(zhuǎn)法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌K599 感受態(tài)，獲得相對(duì)應(yīng)的農(nóng)桿菌。

表2 本文中所構(gòu)建的載體信息Table 2 Vector information in this study

1.2.5 發(fā)根轉(zhuǎn)化 將GmWUS2pro:GUS表達(dá)載體、35Spro:GmWUS2:GFP表達(dá)載體和大豆基因編輯載體Cas9:GmWUS2分別導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599 菌株中用于大豆毛狀根轉(zhuǎn)化。大豆種子用氯氣熏蒸法滅菌16 h,取出置于超凈臺(tái)吹凈剩余氯氣后,再用滅菌的超純水浸泡17 h 備用。將含有目標(biāo)載體的K599農(nóng)桿菌，挑單克隆鑒定，活化后用培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值在1.0～1.1 之間。菌液在22℃,4000g下離心10 min 后，菌塊重懸于LCCM 培養(yǎng)基（1/10×Gamborg B5 鹽，30 g/L；蔗糖（3.9 g/L）；0.59 g/L MES pH5.4；滅菌后加入40 mg/L 乙酰丁香酮），獲得重懸液。將浸泡好的大豆胚根切掉，留下靠近子葉節(jié)的下胚軸和子葉為外植體。將外植體浸于重懸菌液中浸泡30 min 完成侵染。取出外植體，在濾紙上吸干重懸液。將侵染后的大豆外植體置于共 培 養(yǎng) 基（1/10 × Gamborg B5 鹽；30 g/L 蔗 糖（3.9 g/L）；0.59 g/L MES; 4.25 g/L 瓊脂；pH5.4；滅菌后加入Cysteine（400 mg/L）；二硫蘇糖醇（154.2 mg/L）和40 mg/L 乙酰丁香酮）上，避光培養(yǎng)3 d。將共培養(yǎng)后的大豆外植體的下胚軸垂直插入發(fā)根誘導(dǎo)培養(yǎng)基（1 × Gamborg B5 鹽；30 g/L 蔗糖；0.59 g/L MES；7 g/L 瓊 脂；pH5.7；滅 菌 后 加 入100 mg/L Timentin；100 mg/L Cefotaxime）中，置于16 h/8 h 光暗下培養(yǎng)12 d。待在靠近子葉節(jié)的下胚軸處誘導(dǎo)生成毛狀根生長(zhǎng)至2 cm 時(shí)，取出洗凈培養(yǎng)基。置于根瘤菌HH103 懸浮液中浸染30 min，完成根瘤菌接種。把整個(gè)植株移至蛭石中培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d 后可見幼嫩根瘤，取材用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6GmWUS2基因在大豆各組織的表達(dá)分析取大豆的莖、葉、花、莢、果實(shí)、根和根瘤為實(shí)驗(yàn)材料，用全式金EasyPure?Plant RNA Kit 提取大豆各組織的總RNA。使用Prime ScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，將cDNA 用RNase free H2O 以1:3 的比例稀釋，并且以此作為模板。使用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)GmWUS2基因的熒光定量PCR 引物（表1）。以大豆GmUKN2為內(nèi)參基因[26]。在熒光定量PCR 儀上進(jìn)行qRT-PCR，兩步法反應(yīng)運(yùn)行程序?yàn)椋?5℃30 s；95℃10 s,60℃30 s,40 個(gè)循環(huán)?；虮磉_(dá)分析通過(guò)2－△△CT方法計(jì)算。

1.2.7 GUS 染色 GUS 表達(dá)的組織化學(xué)分析主要參考Jefferson 等方法進(jìn)行[27],并稍作修改。將接種HH103 根瘤菌的發(fā)根植株在蛭石中生長(zhǎng)14 d 后取出，在流水下輕柔清洗洗凈根和根瘤上殘留的蛭石。在距離根瘤著生處的上下各1 cm 的位置剪斷,獲取根瘤及根瘤附近根新鮮組織為材料。將新鮮材料在預(yù)先冷卻的90%丙酮中真空固定5 min, 在冰上放置20 min,用冷水沖洗5 min,加入冷卻的GUS染液（50 mmol/L Sodium phosphate buffer，0.2% Triton-X-100, 5 mmol/L K4Fe（CN）6，5 mmol/L K3Fe（CN）6，1～2 mmol/L X-gluc），使用真空濃縮機(jī)抽真空10 min，并在37℃下過(guò)夜。再浸泡在不同濃度下的乙醇（50%和75%）中梯度脫水。將樣品材料放置在在4℃下保存或在顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.2.8 大豆結(jié)瘤實(shí)驗(yàn) 結(jié)瘤實(shí)驗(yàn)主要參考Kereszt等的方法[28]。在熒光顯微鏡下觀察植株的毛狀根是否具有RFP標(biāo)記基因片段的紅色熒光。將成功轉(zhuǎn)化35Spro:GmWUS2:GFP表達(dá)載體、大豆基因編輯載體Cas9:GmWUS2或?qū)φ盏陌l(fā)根植株，分別接種根瘤菌HH103：即將植物根部浸泡在根瘤菌重懸液中30 min 完成根瘤菌侵染。然后將植株移栽到裝有蛭石、含有營(yíng)養(yǎng)液的盆中，放置在溫室（短日照8 h/16 h光暗）正常培養(yǎng)。

培養(yǎng)根瘤菌HH103 的TY 培養(yǎng)基配方為：3 g/L酵母提取物, 5 g/L Tryptone, 0.4 g/L CaCl2, pH 7.0。植物營(yíng)養(yǎng)液配方：1 mmol/L KNO3, 1 mmol/L CaCl2，10 μmol/L Fe-citrate，0.25 μmol/L MgSO4, 0.25μmol/L K2SO4,1μmol/L MnSO4,2μmol/L H3BO3,0.5μmol/L ZnSO4, 0.2 μmol/L CuSO4，0.1 μmol/L Co-SO4，0.1 μmol/L Na2MoO4，KH2PO4，pH 5.8。在接種根瘤菌28 d 后取材，分析大豆根和根瘤的表型。根瘤的數(shù)目為單株（發(fā)根遺傳轉(zhuǎn)化材料）為單位的總的根瘤數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列分析

在Phytozome 數(shù)據(jù)庫(kù)中找到與AtWUS（AT2G179 50）同源性較高的兩個(gè)基因，位于1 號(hào)染色體上Gm?WUS1（Glyma. 01G166800）和位于11 號(hào)染色體上的GmWUS2（Glyma. 11G076500）。氨基酸序列相似性比對(duì)如圖1所示，GmWUS1和GmWUS2 與AtWUS相似度都較高。在相關(guān)網(wǎng)站（http://plants. ensembl.org/）選取同源性評(píng)分在190 左右的序列，再用相關(guān)軟件生成植物WUS 轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)大豆GmWUS2 與苜蓿MtWUSL1 進(jìn)化關(guān)系最近，相比較而言，與GmWUS1 進(jìn)化距離相對(duì)較遠(yuǎn)。大豆的兩個(gè)GmWUS基 因 與 水 稻OsWOX1、OsWOX2和 擬 南 芥AtWUS進(jìn)化關(guān)系遠(yuǎn)，而與苜蓿MtWUSL2、MtWUSL3、MtWUSL4、MtWUSL5和MtWUSL6進(jìn)化關(guān)系更遠(yuǎn)。因此，本文克隆GmWUS2基因并對(duì)其在植株根和根瘤發(fā)育中的作用進(jìn)行初步分析。

圖1 植物WUS氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化樹分析Fig.1 Alignment of plant WUS amino acid sequence and an evolutionary tree

2.2 克隆GmWUS2啟動(dòng)子及構(gòu)建相關(guān)載體

以大豆天隆1 號(hào)葉片DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增獲得GmWUS2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游3000 bp 的啟動(dòng)子序列GmWUS2pro。利用1.5%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增序列并回收擴(kuò)增片段構(gòu)建相應(yīng)載體。序列通過(guò)測(cè)序分析確定。

2.3 啟動(dòng)子活性分析

通過(guò)qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示GmWUS2基因在大豆的各個(gè)組織都有所表達(dá)（圖2A），其中在花中的表達(dá)量最高，其次是在根瘤中。分生組織在植物的個(gè)體發(fā)育過(guò)程中具有非常重要的作用，植物體所有器官均來(lái)自于分生組織內(nèi)細(xì)胞的分裂和分化活動(dòng)，因此檢測(cè)分生組織基因在植物根和根瘤中的表達(dá)模式非常重要。將含GmWUS2pro:GUS的轉(zhuǎn)化發(fā)根植株移栽到蛭石中生長(zhǎng)14 d 后,取其根和根瘤進(jìn)行GUS染色。如圖2B、C、D 所示，GmWUS2pro:GUS在根的維管組織、側(cè)根原基、根尖和根瘤中都可見GUS 信號(hào)。結(jié)果說(shuō)明，GmWUS2啟動(dòng)子在大豆根部和根瘤中均能驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)，即該基因可能在這些組織中發(fā)揮作用。

圖2 GmWUS2pro:GUS在大豆根和根瘤中的表達(dá)模式Fig.2 GmWUS2pro:GUS expression pattern in soybean roots and nodules

2.4 突變體分析

2.4.1 敲除植株發(fā)根RFP基因的檢測(cè) 為了確保CRISPR/Cas9 敲除載體成功導(dǎo)入大豆根部，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通過(guò)大豆發(fā)根實(shí)驗(yàn)，將構(gòu)建好連接有目的基因靶位點(diǎn)的CRISPR/Cas9載體與空載體分別導(dǎo)入大豆毛狀根。由于pSoy10 載體中帶有RFP標(biāo)記基因片段，所以陽(yáng)性大豆毛狀根具有紅色熒光。在接菌28 d 后取Cas9 敲除載體和對(duì)照發(fā)根植株，在熒光顯微鏡下觀察，可以看到植株根部的紅色熒光清晰明亮（圖3），說(shuō)明CRISPR/Cas9敲除載體和對(duì)照植株的空載體都成功被導(dǎo)入到了大豆的再生根部。

圖3 轉(zhuǎn)基因發(fā)根的鑒定Fig.3 Confirmation of transgenic hairy roots

2.4.2 靶基因的敲除位點(diǎn)檢測(cè) 為了驗(yàn)證Cas9 敲除載體的靶位點(diǎn)是否有效，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在接菌28 d 后，取敲除發(fā)根用CTAB 法提取發(fā)根基因組DNA。以DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)陽(yáng)性克隆。切膠回收目的條帶，送交公司測(cè)序。通過(guò)測(cè)序結(jié)果顯示編輯后的基因缺失1200 bp堿基（圖4），證明靶位點(diǎn)有效。

圖4 突變發(fā)根的基因編輯結(jié)果分析Fig.4 Analysis of the GmWUS gene editing in mutated hairy roots

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的表型分析

接菌28 d 后對(duì)植株的地上部和地下部進(jìn)行表型觀察。發(fā)現(xiàn)Gmwus2突變體植株的葉片明顯要比GmWUS2過(guò)表達(dá)植株（圖5B）和對(duì)照組植株（圖5C）的葉片更大、更綠，而過(guò)表達(dá)植株的葉片較小而且出現(xiàn)黃化現(xiàn)象（圖5）。然后，分別統(tǒng)計(jì)10 條根上的平均結(jié)瘤情況（圖6），將三次重復(fù)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，Gmwus2突變體植株（圖6B）上的平均結(jié)瘤數(shù)為99.78 個(gè)，對(duì)照植株（圖6A）的平均結(jié)瘤數(shù)53 個(gè)，而GmWUS2基因過(guò)表達(dá)植株（圖6C）的平均結(jié)瘤數(shù)為35.33個(gè)。說(shuō)明Cas9突變體植株上的結(jié)瘤數(shù)目要多于GmWUS2過(guò)表達(dá)植株和對(duì)照植株，而GmWUS2過(guò)表達(dá)植株的結(jié)瘤數(shù)目也明顯少于對(duì)照植株的結(jié)瘤數(shù)目，過(guò)表達(dá)植株上的根瘤數(shù)是最少的（圖6）。因此，GmWUS2基因?qū)Υ蠖垢鲂纬删哂幸种谱饔?，根瘤的多少影響植物的固氮效率，從而?duì)植物地上部（葉片）生長(zhǎng)也具有間接的調(diào)控作用。

圖5 接菌后28天Gmwus2突變體和35Spro:GmWUS2葉片對(duì)比Fig.5 Leaf comparison of Gmwus2 mutants and 35Spro:GmWUS2 in 28 days after inoculation

圖6 Gmwus2突變體和35Spro:GmWUS2根瘤對(duì)比Fig.6 Gmwus2 mutant and 35Spro:GmWUS2 nodule comparison

3 討論與結(jié)論

WUS與CLV3和STM等分生組織特異的關(guān)鍵基因相互協(xié)同作用，調(diào)控分生組織細(xì)胞的分裂和分化[29]。大豆CLV3基因已經(jīng)被報(bào)道具有調(diào)節(jié)根瘤發(fā)生的功能，該基因的突變導(dǎo)致根瘤的大量發(fā)生[20]。本研究對(duì)大豆WUS同源基因GmWUS2基因在根瘤發(fā)育中的潛在作用進(jìn)行初步探討發(fā)現(xiàn)，GmWUS2與擬南芥的AtWUS基因序列高度相似，但是更接近于苜蓿的WUS同源基因MtWUSL1，顯示豆科植物WUS基因功能的潛在相似性。GmWUS2基因主要在大豆根的維管組織、側(cè)根原基、根尖和根瘤表達(dá)。Gm?WUS2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致植株結(jié)瘤數(shù)減少，而基因突變會(huì)增加根瘤數(shù)，說(shuō)明GmWUS2基因作為一個(gè)負(fù)調(diào)控因子對(duì)根瘤具有負(fù)向調(diào)控作用，這與GmCLV3基因的功能類似。但是，GmCLV3編碼蛋白作為可移動(dòng)信號(hào)從地上部被運(yùn)輸?shù)降叵虏堪l(fā)揮作用，而WUS基因在根瘤中的功能尚未見報(bào)道。因此，GmGUS2基因作為負(fù)調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)根瘤發(fā)生的詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

根瘤的發(fā)生和功能與整個(gè)植株的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。根瘤的數(shù)量與植株的固氮能力密切相關(guān)，根瘤往往會(huì)促進(jìn)地上部的發(fā)育[30]。本研究通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定的Gmwus2突變體和GmWUS2過(guò)表達(dá)材料進(jìn)一步證實(shí)這一理論，即Gmwus2突變體的葉片比野生型大而綠，過(guò)表達(dá)GmWUS2基因則抑制葉片生長(zhǎng)，葉片較黃。GmWUS2在大豆的根與根瘤的各個(gè)位置均有表達(dá)，說(shuō)明該基因在其他器官發(fā)育過(guò)程具有潛在功能。這對(duì)于解析大豆根瘤在其它器官發(fā)育中發(fā)揮的作用機(jī)制及其在提高大豆固氮效率上都具有重要意義。

WUS基因主要在分生組織中發(fā)揮功能。本研究證實(shí)GmWUS2參與大豆根瘤發(fā)育的調(diào)控，而且暗示該基因還可能在其他器官中有功能，研究結(jié)果豐富了分生組織基因功能。此外，大豆遺傳轉(zhuǎn)化相對(duì)較難、更花時(shí)間和人力。本研究結(jié)果說(shuō)明，與根部相關(guān)的基因功能，可以通過(guò)發(fā)根轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對(duì)基因功能進(jìn)行快速分析，篩選出參與根或根瘤相關(guān)的功能的目標(biāo)基因，然后進(jìn)行深入研究。