基于整合藥理學及分子對接技術探討小青龍湯治療慢性阻塞性肺疾病急性加重期的分子機制

韓東衛(wèi) 楊琴琴 王利芳 梁欣 張洪波 張維君

黑龍江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院 北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040

慢性阻塞性肺疾?。ㄒ韵潞喎Q“慢阻肺”）是指持續(xù)性的氣流受限及相應呼吸系統(tǒng)癥狀[1]。慢阻肺急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）在肺功能減退基礎上，合并有氣道黏液高分泌、管腔內(nèi)滲出、小氣道炎癥等急性并發(fā)癥[2]。中醫(yī)可將AECOPD 歸屬于“喘證”“肺脹”范疇，本虛標實是其發(fā)病的基本病機。小青龍湯出自張仲景《傷寒論》，具有解表散寒、溫肺化飲之效。多項研究表明，小青龍湯治療AECOPD 效果確切，且優(yōu)于單獨應用西藥治療[3-4]。

1 材料與方法

1.1 藥物成分與靶標

中醫(yī)藥整合藥理學平臺（integrative pharmacologybased research platform of traditional Chinese medicine，TCMIP）V2.0 平臺檢索小青龍湯（麻黃、芍藥、細辛、干姜、甘草、桂枝、半夏、五味子），構建化學成分庫。與DrugBank 化學指紋特征比對，以相似性系數(shù)Tanimoto≥0.8 篩選藥物候選靶標。以“AECOPD”為關鍵詞檢索GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫，構建疾病靶標。本研究經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學科研倫理委員會審核通過。

1.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡

藥物-疾病交集靶標，通過度中心性、接近中心性、中介中心性中位數(shù)卡值得到核心靶標，導入STRING數(shù)據(jù)庫構建PPI 網(wǎng)絡。

1.3 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

STRING 數(shù)據(jù)庫下載潛在靶標的GO 及KEGG 數(shù)據(jù)，借助微生信在線平臺進行富集分析。

1.4 關聯(lián)網(wǎng)絡圖構建與可視化分析

借助Cytoscape 3.7.2 軟件構建小青龍湯治療AECOPD 多維網(wǎng)絡圖。

1.5 分子對接

借助AutoDock 軟件進行分子對接處理，ZINC 數(shù)據(jù)庫下載活性成分“mol2”文件，PDB 數(shù)據(jù)庫下載靶點蛋白的3D 晶體結構，用Pymol 軟件進行可視化。

2 結果

2.1 小青龍湯化學成分及靶標

TCMIP V2.0 平臺檢索得到小青龍湯化學成分401 個，候選藥物靶標595 個。GeneCards（相關分數(shù)＞30 分）與OMIM 檢索得到疾病靶標825 個。

2.2 核心靶標篩選

藥物-疾病交集靶標58 個，根據(jù)中位數(shù)卡值得到23 個核心靶標。見圖1。

圖1 藥物-疾病核心靶標

2.3 GO 和KEGG 富集分析

GO 富集分析結果顯示，核心靶標主要參與調(diào)節(jié)免疫反應、對含氧化合物反應等生物過程。KEGG 富集分析結果涉及腫瘤壞死因子、AGEs-RAGE 等信號通路，多與炎癥免疫反應、氧化應激及能量代謝過程相關。見圖2。

圖2 GO 和KEGG 富集分析

2.4 活性成分篩選

以核心靶標反向查找，且滿足類藥性等級為“Good”“Moderate”的活性成分有41 個。見表1。

表1 小青龍湯治療AECOPD 的潛在活性成分

2.5 網(wǎng)絡可視化

利用Cytoscape 3.7.2 構建“小青龍湯-活性成分-核心靶標-表型-AECOPD”多維網(wǎng)絡圖。見圖3。

圖3 多維網(wǎng)絡圖

2.6 分子對接

結合能＜-6 kcal/mol 的對接結果，見表2。結果顯示芍藥二酮、異甘草素、2，4，4’-Trihydroxychalcone 與核心靶標中的表皮生長因子、AKT 激酶1、腫瘤壞死因子具有較好的結合能力。見圖4。

圖4 分子對接可視化

表2 分子對接結果

3 討論

炎癥與免疫、氧化應激均被認為是AECOPD 發(fā)病的關鍵機制[5-8]，本研究經(jīng)篩選得到23 個核心靶標。其中腫瘤壞死因子、白細胞介素-6 在介導免疫炎癥反應中發(fā)揮重要作用[9]。多項研究表明，AECOPD 進程中腫瘤壞死因子、白細胞介素-6 的表達顯著升高[10-13]。張月[14]研究發(fā)現(xiàn)給予AECOPD 患者小青龍湯治療后，血清中腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6 水平顯著下降。多項研究表明，肺上皮細胞PI3K、AKT 激酶過度激活與慢阻肺進展密切相關[15-17]。莫碧文等[18]研究表明，小青龍湯可抑制p-AKT 激酶表達改善哮喘氣道重塑。有研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子及其受體表皮生長因子R高表達與慢阻肺氣道上皮杯狀細胞增殖和黏液產(chǎn)生呈正相關[19-20]。

近年來研究表明，黃酮類成分多具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用[21-23]。于維漢等[24]研究表明，槲皮素能抑制細胞炎癥介質(zhì)的形成，抑制白細胞介素-1β、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α 等炎癥因子的分泌及表達。山柰酚可通過抑制絲裂原活化蛋白激酶信號通路對AECOPD 起到保護作用[25]。生物堿類成分可抑制白細胞介素-4、腫瘤壞死因子-α 等細胞因子的釋放，減輕氣道炎癥反應，松弛支氣管平滑肌，解除痙攣[26]。

綜上所述，本研究通過整合藥理學分析小青龍湯的多種活性成分，主要包括黃酮類、生物堿、酚類及少數(shù)有機酸類等，可通過抑制肺部炎癥及氧化應激恢復肺的正常代謝功能，進而改善AECOPD 進程。