利用制革廢棄牛毛制備角蛋白基水凝膠研究

孫莉 ，肖遠(yuǎn)航 ，王春華 ，穆暢道 ，林煒 ＊

（1. 四川大學(xué)制革清潔技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065；2. 四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065）

前言

在制革工業(yè)中，每產(chǎn)出 3000 張牛皮會(huì)產(chǎn)生5～10 t 廢棄牛毛[1]。然而，目前絕大部分廢棄牛毛并未得到充分利用，多被焚燒或填埋處理[2]，不僅造成了資源浪費(fèi)，還會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染[3-4]。這些廢棄牛毛屬于天然的角蛋白資源，來(lái)源豐富且價(jià)格低廉，具有良好的生物相容性和可生物降解性 ，應(yīng)用價(jià)值高[2,5]。角蛋白中含 15.0%～18.0%的氮，1.5%～2.0%的磷，2%～5%的硫及多種微量元素，能為植物的生長(zhǎng)提供必需的養(yǎng)分[6]，將廢棄牛 毛角蛋白用作肥料是一種經(jīng)濟(jì)合理的資源化利用方式。近年來(lái)出現(xiàn)了一種新型肥料，即將所需養(yǎng)分負(fù)載于水凝膠上，又稱 緩 釋 肥 水 凝 膠，可使養(yǎng)分更加有效的吸收和釋放，明顯提高肥料的利用效率。因此，將制革廢棄牛毛角蛋白用于制備水凝膠，不僅其自身就是很好的肥 料 ， 而 且角蛋白水凝膠還可作為其它肥料的載體 ，從而實(shí)現(xiàn)肥料的高效利用 ，減少養(yǎng)分流失及由此造成的環(huán)境污染問(wèn)題[7]。

角蛋白中所含的氨基酸種類約 20 種[8]，分子鏈上的反應(yīng)活性位點(diǎn)較多，可發(fā)生多種化學(xué)反應(yīng)以 制備所需水凝膠。其中可用于接枝的位點(diǎn)主要有以下幾種：被還原的胱氨酸側(cè)鏈上的巰基[7-10]賴氨酸側(cè)鏈上 的 伯氨 基[11-13]和酪氨酸側(cè)鏈上的苯酚式結(jié)構(gòu)等 。Ali Khademhosseini 團(tuán)隊(duì)[14]報(bào)道了通過(guò)可見(jiàn)光引發(fā)巰基 - 降冰片烯反應(yīng) 得到的角蛋白 - 聚 乙 二醇(PEG)水凝膠，即將四臂聚乙烯醇接枝降冰片烯作為交聯(lián)劑，在可見(jiàn)光照射下一分鐘內(nèi)形成水凝膠。 但 是該報(bào)道 所 得的水凝膠制備方法復(fù)雜 ，成本高 ，不適用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中，因?yàn)樽鳛榉柿陷d體的水凝膠 材 料，低成本是研 究 開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵因素[15]。Yussef Esparza[16]等人從人發(fā)、羊毛和羽毛中提取的還原角蛋白(這里簡(jiǎn)寫為 K-SH) 可通過(guò) H2O2催化形成二硫鍵得到水凝膠。但我們通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比該文獻(xiàn)中所使用的 K-SH，從制革廢棄牛毛中所提取的 K-SH 相對(duì)分子質(zhì)量較低，僅通過(guò)二硫鍵的交聯(lián)不能形 成水凝膠。因此，本文選擇甲基丙烯酸酐(MA)作為改性劑 ， 以期 在 K-SH 分子鏈結(jié)構(gòu)中引入 C=C 活 性 基團(tuán)，進(jìn)一步通過(guò)交聯(lián)反應(yīng)制備角蛋白水凝膠。

目前，MA 作為改性劑被廣泛用于蛋白質(zhì)的改性，可在蛋白質(zhì)中引入?yún)⑴c自由基聚合反 應(yīng) 的 C=C鍵。Van Den Bulcke 等人[17]用 MA 對(duì)明膠上的伯氨基團(tuán)進(jìn)行?；?性 ，從而引入C=C雙鍵 得 到改性 明膠。這種改性明膠在排除氧氣的條件下，通過(guò)光引發(fā) 劑及紫外輻照可 引 發(fā) C=C 雙鍵自 由 基聚 合 形 成水凝膠。然而，我們前期的探索實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，K-SH 與MA在有氧且不加引發(fā)劑的條件下即可形成水凝膠，顯然這兩種水凝膠的形成機(jī)理不同。推測(cè)后 者是因?yàn)?MA 不僅可與 K-SH 結(jié)構(gòu)中的側(cè)鏈氨基發(fā)生?；磻?yīng)使之引入 C=C 雙鍵，同時(shí) K-SH 高反應(yīng)活性的游離巰 基 與該 C=C 雙鍵可 直 接發(fā)生 巰 基 - 烯反應(yīng)；并且 MA 在?；男?K-SH 過(guò)程中產(chǎn)生的甲基丙烯酸也可能與巰基發(fā)生巰基 - 烯反應(yīng)；因此才會(huì)在 MA ?；男?K-SH 時(shí)直接生成了水凝膠。這些都需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證，以明確兩者之間的化學(xué)交聯(lián)機(jī)理，為角蛋白基水凝膠的制備與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

本文利用制革廢棄牛毛制備得到的 K-SH，采用 MA 改性交聯(lián)后得到 甲 基丙烯?；堑?白 水 凝膠(KMA-Gel)，其制備方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫 和 ，將其作為肥料緩釋的水凝膠載體，符合循環(huán)經(jīng)濟(jì)理念 。 通 過(guò) 測(cè) 定 K-SH 結(jié) 構(gòu) 中 氨 基 及 巰 基 轉(zhuǎn) 化 度 、FT-IR、1H-NMR 和 XPS 對(duì)改性角蛋白 (KMA) 的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，可推斷出 K-SH 與 MA 的化學(xué)交聯(lián)機(jī)理，以期為角蛋白基材料的合成研發(fā)提供新思路和參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要原料及儀器

制革廢棄牛毛，興業(yè)皮革科技股份有限公司 ；甲基丙烯酸酐，AR，上海阿拉丁有限公司；甲基丙烯酸，AR，上海阿拉丁有限公司；2,4,6- 三硝基苯磺酸（TNBS），AR，上海阿拉丁有限公司；磷酸二氫鈉·二水 ，AR，成 都 市科龍化工試劑廠 ；磷 酸 氫二鈉·十二水，AR，成 都 市科龍化工試劑廠 ； 乙 二 胺四 乙 酸，AR；5,5’- 二 硫 代 雙 - （ 二 硝 基 苯 甲 酸），AR；Tris-base，AR；過(guò) 氧 化 氫（30%），AR，成 都 市 科 龍 化工試劑廠。

滲析袋，截留相 對(duì) 分子質(zhì)量為 8000～14 000，上海 源 葉 生 物 科 技 有 限 公 司 ； 冷凍干燥機(jī) ，ALPHA 1-2 LD，德 國(guó) CHRIST 公 司 ；pH 酸 度 計(jì) FE28，梅 特勒-托利多有限公司 ； 傅 里 葉 變 換 紅 外 光 譜 儀 ，Nicolet IS 10，美國(guó)賽默飛公司；核磁共振氫譜儀，Avance Ⅲ-400 MHz，瑞士 Bruker 公司；紫外可見(jiàn)分光光 度 ，U-3900， 日 立 有 限 公 司 ；X 射 線 光 電 子 能 譜儀 ，250XI，美國(guó)賽默飛公司 ；場(chǎng) 發(fā) 射 掃 描 電 子 顯 微鏡，Helios G4 UC 型，美國(guó)賽默飛公司。

1.2 巰基乙醇還原法提取角蛋白

首先，將 100 g 制革廢棄牛毛浸入 1 L 含 1% 十二 烷 基 硫酸 鈉（SDS）的燒 杯 中，以 去除 牛 毛 中 所 含的油脂和有機(jī)物。然后，將洗凈后的牛毛浸入 1 L 含丙酮 / 乙 醇（體積比為 1∶1）的燒杯中，于 37 ℃條 件下水浴震蕩 48 h，牛毛撈出后，將其在 37 ℃的烘箱中干燥，直至恒重。

稱取干燥后的牛 毛10 g 于 250 mL 三 口 燒 瓶中，然后加入 10 mL 巰基乙醇、48 g 尿素、5 g SDS 及200 mL 去離子水于上述三頸燒瓶中。將其置于 10 0℃油浴條件下攪拌反應(yīng) 12 h 后，對(duì)牛毛水解液進(jìn)行抽濾、透析處理，之后將透析液冷凍干燥 2 d 得到牛毛還原角蛋白(K-SH)以備用。

1.3 甲基丙烯?；堑鞍姿z的制備

稱取 0.300 g K-SH 溶于 1 mL 磷酸緩沖液(pH 7.5)中，得到質(zhì)量濃度為 0.3 g/mL 的 K-SH 溶液。向其中加入 0.2 mL MA 溶液，將混合液在室溫下攪拌反應(yīng) 1 h，然后置于 50 ℃的水浴鍋中孵育 3 h，即可得到 KMA-Gel。將水凝膠樣品冷凍干燥后，對(duì)其表面進(jìn)行噴金處理，用掃描電子顯微鏡在 20 kV 條件下觀察其形貌特征。

1.4 甲基丙烯?；堑鞍姿z的化學(xué)交聯(lián)機(jī)理研究

理論上分析，在 K-SH 和 MA 的反應(yīng)體系中，K-SH 分子鏈中的 -NH2可發(fā)生?；磻?yīng)，從而引入C=C 雙鍵；進(jìn)一步地可與 K-SH 結(jié)構(gòu)上的 -SH 發(fā)生巰基 - 烯反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)首先氧化 K-SH 結(jié)構(gòu)上的巰基為磺酸基團(tuán)，得到氧化角蛋白，簡(jiǎn)稱為 K-SO3，并制備了甲基丙烯?；趸堑鞍?MA-K-SO3)，以封閉-SH 來(lái)探究水凝膠的成膠過(guò)程是否發(fā)生了?；磻?yīng)。然后，通過(guò)改變 MA 的用量，將不同比例的K-SH 與 MA 反應(yīng)制備了一系列甲基丙烯?；堑鞍祝↘MAx，x 表示反應(yīng)時(shí) MA 與 K-SH 的質(zhì)量比）以探究 K-SH 和 MA 的化學(xué)交聯(lián)機(jī)理。最后，實(shí)驗(yàn)將K-SH 與甲基丙烯酸 (MAA) 在相同條件下反應(yīng)，制備得到甲基丙烯酸化角蛋白(MAA-Keratin)，以探究K-SH 與 MA 發(fā)生酰化反應(yīng)生成的副產(chǎn)物 - 甲基丙烯酸(MAA)是否能與 K-SH 上的巰基發(fā)生巰基 - 烯反應(yīng)。

1.4.1 甲基丙烯?；趸堑鞍椎闹苽?/p>

首先，制備 3%K-SH 的水溶液，向其中加入 1 mL 30% 的 H2O2在 50 ℃ 下 反 應(yīng) 10 h， 以 氧 化K-SH 結(jié)構(gòu)上的巰基為磺酸基團(tuán)，得到 K-SO3，冷凍干燥以備用；然后，稱取 0.300 g K-SO3于 10 mL磷酸緩沖液 (pH 7.5) 中，并加入 0.2 mL MA，將混合液在室溫下攪拌反應(yīng) 5 h 后，加入 20 mL 磷酸緩沖液稀釋以終止反應(yīng) ， 最后，冷凍干燥得到MA-K-SO3以備用。

1.4.2 甲基丙烯?；堑鞍椎闹苽?/p>

首先，稱取 0.300 g K-SH 溶于 10 mL 磷酸緩沖液（pH 7.5）中，得到質(zhì)量濃度為 0.03 g/mL 的 K-SH溶液。然后，分別向其中加入 0.1～0.3 mL MA 溶液，并將混合液在室溫下攪拌反應(yīng) 5 h 后，加入 20 mL磷酸緩沖液稀釋以終止反應(yīng)。最后，將所得溶液用去離子水在室溫下透析以移除未反應(yīng)的物質(zhì)，冷凍干燥后即得 KMAx。對(duì)樣品 K-SH 和 KMA2/3（mMA∶mK-SH= 2∶3）進(jìn)行紅外譜圖測(cè)試，分別將 1 mg 樣品與 150 mg KBr 研磨并壓片，再通過(guò)紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)試。

1.4.3 甲基丙烯酸化角蛋白的制備

首先稱取 0.300 g K-SH 溶于10 mL 磷酸緩沖液（pH 7.5）中，得到質(zhì)量濃度為 0.03 g/mL 的 K-SH溶液。向其中加入 0.2 mL MAA 溶液，并將混合液在室溫下攪拌反應(yīng) 5 h 后，加入 20 mL 磷酸緩沖液稀釋以終止反應(yīng)，透析并冷凍干燥后，即得甲基丙烯酸化角蛋白 (MAA-Keratin)。

1.4.4 氨基及巰基轉(zhuǎn)化度測(cè)定

氨基含量測(cè)試的方法采用三硝基苯磺酸法(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid sol, TNBS)[18]，量取1 mL 質(zhì)量濃度為 1.5 mg/mL（以 pH 7.4 的磷酸緩沖液作為溶劑） 的 K-SH 溶液以及不同反應(yīng)度的KMAx溶液于 25 mL 比色管中，依次加入 1 mL 4%的NaHCO3溶液和 1 mL 0.1%的 TNBS 溶液。然后將混合液置于 40 ℃水浴條件下避光反應(yīng) 2 h，并在波長(zhǎng)415 nm 處測(cè)定溶液的吸光度。

巰基含量的測(cè)定方法采用 Ellman 標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定[19]。配置反應(yīng)緩沖液 A（8 M 尿素，3 mM EDTA，1%SDS 和 0.2 M Tris-HCl，pH 8.0）。1 mL 反應(yīng)緩沖液 A 溶解 4 mg 5,5’- 二硫代雙 -（二硝基苯甲酸）配置成 Ellman 試劑溶液。將 15 mg K-SH 以及不同反應(yīng)度的 KMAx分別置于 1 mL 緩沖液 A 中，隨后將樣品在室溫下?lián)u動(dòng) 2 h 使蛋白質(zhì)溶解。取若干試管，每管含 50 μL Ellman 試劑和 2.5 mL 的反應(yīng)緩沖液A。在各試管中加入 250 μL 的待測(cè)物溶液，在室溫混合再次搖動(dòng) 1 h，并在 412 nm 處測(cè)量待測(cè)液的吸光度值。

最后根據(jù)公式計(jì)算 KMAx的取代度，研究了MA 與 K-SH 的質(zhì)量比對(duì) K-SH 結(jié)構(gòu)中 -NH2和-SH 的轉(zhuǎn)化度影響規(guī)律：

其中 DS 代表轉(zhuǎn)化度，ODg為角蛋白的吸光度，ODm為 KMAx的吸光度。

1.4.5 核磁氫譜1H NMR

對(duì) K-SO3、MA-K-SO3；K-SH 和 KMA2/3以 及MAA-Keratin 進(jìn)行核磁譜圖測(cè)試，分別稱取 10 mg樣品溶于 0.55 mL 氘代 DMSO 中，在 25 ℃下通過(guò)核磁共振氫譜儀測(cè)試。

1.4.6 X- 光電子能譜儀 (XPS)

對(duì) K-SH 及 KMA2/3中的元素種類采用 XPS 進(jìn)行分析，分析室真空度為 8×10-10Pa，激發(fā)源采用Al Kα 射線（hv=1486.6 eV）。

2 結(jié)果與討論

2.1 KMA-Gel的制備

甲基丙烯?；堑鞍姿z（KMA-Gel）的制備方法簡(jiǎn)單，通過(guò)向 K-SH 中加入 MA 后孵育 3 h即可生成水凝膠，MA 可作為交聯(lián)劑將角蛋白分子鏈連接起來(lái)，如圖 1 為冷凍干燥后的 KMA-Gel 的SEM 圖，從中可以看出該水凝膠是一種多孔性的材料，具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

圖1 甲基丙烯酰化角蛋白水凝膠的 SEM 圖Fig.1 SEM image of KMA-Gel

2.2 KMA-Gel的化學(xué)交聯(lián)機(jī)理表征

2.2.1 角蛋白中氨基及巰基的轉(zhuǎn)化率測(cè)定

為了探究 KMA-Gel 的合成機(jī)理，實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變 MA 的用量，制備了系列不同的 KMAx，并用TNBS 和 Ellman 法測(cè)定 KMAx中氨基和巰基的轉(zhuǎn)化率(DC)。結(jié)果如圖 2 所示，K-SH 結(jié)構(gòu)中氨基和巰基轉(zhuǎn)化度的變化初步表明了其氨基和巰基均與 MA發(fā)生了反應(yīng)。隨著 MA 用量的增加，KMAx 中氨基的轉(zhuǎn)化率(DC)基本不變，保持在 60%左右；巰基的轉(zhuǎn)化率從 37%提高到 67%。并且從圖 2 中可看出，在不添加 MA 的情況下，K-SH 結(jié)構(gòu)中巰基的轉(zhuǎn)化率約為 19%，這是由于巰基可能部分氧化形成二硫鍵。因此推測(cè)在 K-SH 與 MA 的反應(yīng)體系中，主要發(fā)生的反應(yīng)為 K-SH 結(jié)構(gòu)中的氨基發(fā)生的酰化反應(yīng)和巰基發(fā)生的巰基 - 烯反應(yīng)。

圖2 MA 用量對(duì) KMAx 中 -NH2 和 -SH 轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 The influence of the dosage of methacrylic anhydride on the conversion rates of -NH2 和-SH in KMAx

2.2.2 紅外光譜圖分析

圖3為 K-SH 和 KMA2/3的紅外圖譜，可進(jìn)一步確認(rèn) K-SH 和 MA 之間發(fā)生的化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)。結(jié)果如圖3所示，K-SH 的紅外譜圖中 3300 cm-1處的寬吸收峰為 N-H 鍵的伸縮振動(dòng)引起的，可歸屬于酰胺A 的特征吸收峰。1645 cm-1為 C=O 伸縮振動(dòng)、1540 cm-1為 N-H 彎曲和 C-H 伸縮振動(dòng)，1200 cm-1主要是 C-N 伸縮振動(dòng)，分別對(duì)應(yīng)角蛋白的酰胺 I、酰胺 II和酰胺 III[20]。K-SH 與 KMA2/3的吸收峰幾乎一致，都表現(xiàn)出角蛋白的特征吸收帶，此外，KMA2/3光譜中3300 cm-1、1645 cm-1、1540 cm-1、1225 cm-1處的峰強(qiáng)增加，這可能是由于 K-SH 與 MA 之間通過(guò)?；磻?yīng)生成更多酰胺鍵引起的。

圖3 K-SH 和 KMA2/3 的 FT-IR 譜圖Fig.3 FT-IR spectras of K-SH and KMA2/3

2.2.31H NMR 分析

當(dāng) K-SH 上成功引入碳碳雙鍵(C=C)后，C=C 雙鍵可能會(huì)與其自身結(jié)構(gòu)中的巰基發(fā)生巰基 - 烯反應(yīng)進(jìn)一步自交聯(lián)。因此，為了驗(yàn)證是否引入了 C=C雙鍵，實(shí)驗(yàn)中通過(guò)使用氧化劑 H2O2將 K-SH 上的巰基氧化為磺酸基團(tuán)，從而封閉巰基，得到了氧化角蛋白 (K-SO3)，將其與 MA 反應(yīng)得到 MA-K-SO3。圖4 為 K-SO3和 MA-K-SO3的1H NMR 圖譜。結(jié)果如圖所示，δ =5.2～5.6 處(即 A)為甲基丙烯酸的碳碳雙鍵上氫的化學(xué)位移，δ =1.7(即 B)處為甲基丙烯酸的甲基 結(jié) 構(gòu) 上氫 的 化學(xué) 位 移[21]。 與 K-SO3相 比 ，MA-K-SO3的圖譜中 5.2＜δ＜5.6 和 δ =1.7 處出現(xiàn)相應(yīng)的吸收峰，從而證實(shí)了 MA 與 K-SO3上的氨基發(fā)生了酰化反應(yīng)，角蛋白分子結(jié)構(gòu)中成功引入了碳碳雙鍵(C=C)。

圖4 氧化角蛋白和改性氧化角蛋白的 1H NMR 譜圖Fig.4 1HNMR spectras of K-SO3 and MA-K-SO3

圖5 為 K-SH 和 KMA2/3的1H NMR 圖譜。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[22]，MA 結(jié)構(gòu)中碳碳雙鍵(C=C)的氫化學(xué)位移在 5.7＜δ＜6.2 的位置。從圖 5 中可看出，在 d =2.8處 （即 C） 為 K-SH 結(jié)構(gòu)中游離氨基上氫的化學(xué)位移。d =1.9 處（即 D）為巰基氫的化學(xué)位移。結(jié)果顯示，與 K-SH 相比，在 KMA2/3的氫譜中游離氨基上氫(C)的特征吸收峰消失，推測(cè) K-SH 結(jié)構(gòu)中的氨基與 MA 發(fā)生了?；磻?yīng)。然而在 KMA2/3的氫譜中并未觀察到 C=C 雙鍵的特征吸收峰，與此同時(shí)，從插圖中可看出 K-SH 在與 MA 反應(yīng)后，其結(jié)構(gòu)中巰基氫的特征吸收峰消失，因此推測(cè)這是因?yàn)?K-SH 上成功接枝的 C=C 雙鍵與 K-SH 結(jié)構(gòu)中的巰基發(fā)生了巰基 - 烯反應(yīng)。

圖5 K-SH 和 KMA2/3 的 1H-NMR 譜圖Fig.5 1H-NMR images of K-SH and KMA2/3

K-SH 與 MA 通過(guò)?；磻?yīng)會(huì)生成副產(chǎn)物 -甲基丙烯酸(MAA)[23]，并且從理論上分析 MAA 結(jié)構(gòu)中存在的 C=C 雙鍵也可與 K-SH 上的巰基發(fā)生巰基 - 烯反應(yīng)。因此實(shí)驗(yàn)制備了甲基丙烯酸化角蛋白(MAA-Keratin) 以驗(yàn)證該推論。圖 6 為 K-SH、MAA-Keratin 和 MAA 的1H NMR 圖譜。從圖中可知，MAA 結(jié)構(gòu)中碳碳雙鍵(C=C)上氫的化學(xué)位移在5.7＜d＜6.2 的位置，甲基上氫的化學(xué)位移為 d =1.7。在 d =1.8 處（即 E）為 K-SH 中巰基氫的化學(xué)位移。結(jié)果顯示，與 MAA 相比，MAA-Keratin 核磁氫譜圖中未出現(xiàn) C=C 雙鍵上氫的特征吸收峰，并且從插圖中可以看出 K-SH 與 MAA 反應(yīng)后結(jié)構(gòu)中巰基氫的特征吸收峰消失。推測(cè)在該反應(yīng)條件下，K-SH 結(jié)構(gòu)中的巰基可與 MAA 發(fā)生巰基 - 烯反應(yīng)。

圖6 K-SH、MAA-Keratin 和 MAA 的 1H-NMR 譜圖Fig.6 1H-NMR images of K-SH、MAA-Keratin and MAA

2.2.4 XPS 分析

通過(guò) XPS 測(cè)試進(jìn)一步研究了角蛋白改性后的元素和鍵能變化，如圖 7 所示。在角蛋白改性前后，N 1s 的特征峰 （～400 eV） 和 S 2p 的特征峰（～164 eV）[24]均發(fā)生了變化。通過(guò)對(duì)氮硫元素進(jìn)行分峰擬合，從 N 的分峰擬合圖 7(b)中可以看出，在 400 eV結(jié)合能處對(duì)應(yīng)官能團(tuán)為 N-C=O，經(jīng)過(guò)改性后 KMA2/3中該處的峰面積顯著增大，進(jìn)一步證明了角蛋白改性過(guò)程中確實(shí)發(fā)生了?；磻?yīng)生成更多的酰胺鍵。圖 7(c)為 K-SH 與 KMA2/3中 S 的分峰擬合圖，從中可 以 看出 在 164 eV 結(jié)合能 處對(duì) 應(yīng) K-SH 中 的R-SH，而 KMA2/3圖譜并沒(méi)有此峰，表明 K-SH 中R-SH 與 MA 中的 C=C 雙鍵之間發(fā)生了巰基 - 烯反應(yīng)[25]。

圖7 K-SH 與 KMA2/3 的 XPS 全譜圖(a)；N 的分峰擬合圖 (b)；S 的分峰擬合圖 (c)Fig.7 XPS spectrum of K-SH and KMA2/3 (a)；Peak fitting of N (b) and S (c)

2.3 KMA-Gel的反應(yīng)交聯(lián)機(jī)理分析

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)分析，K-SH 與 MA 反應(yīng)形成的化學(xué)交聯(lián)結(jié)構(gòu)如圖 8 所示，K-SH 分子鏈上的氨基可與 MA 發(fā)生?；磻?yīng)以引入乙烯基，形成改性角蛋白中間體 (KIN)。KIN 結(jié)構(gòu)中的乙烯基與巰基之間產(chǎn)生巰基 - 烯反應(yīng)形成自交聯(lián)結(jié)構(gòu)。與此同時(shí)，在形成 KIN 的過(guò)程中會(huì)生成甲基丙烯酸，也可以與KIN 結(jié)構(gòu)中的巰基發(fā)生巰基 - 烯反應(yīng)，從而得到三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

圖8 K-SH 與 MA 反應(yīng)交聯(lián)機(jī)理圖Fig.8 Diagram of reaction mechanism between K-SH and MA

并且從理論分析的角度上講，在 K-SH 和 MA的反應(yīng)體系中，產(chǎn)生的 KIN 和甲基丙烯酸結(jié)構(gòu)中均含有 C=C 雙鍵，也可能會(huì)發(fā)生自由基聚合反應(yīng)，但是由于自由基聚合反應(yīng)需要引發(fā)劑引發(fā)且會(huì)受到氧的抑制作用[26]，因此在該成膠條件下可排除 C=C雙鍵的自由基聚合反應(yīng)。此外，在凝膠化過(guò)程中，除了化學(xué)交聯(lián)外，也可能發(fā)生物理相互作用，如氫鍵、疏水鍵和靜電相互作用[16]。

3 結(jié)論

基于制革廢棄牛毛角蛋白與甲基丙烯酸酐(MA) 開(kāi)發(fā)了一種 KMA-Gel 的制備方法。相比 MA用于改性明膠以引入 C=C 雙鍵，并通過(guò)引發(fā)劑引發(fā)C=C 雙 鍵 的 自 由 基 聚 合 反 應(yīng) 制 備 的 水 凝 膠 ，KMA-Gel 的制備方法簡(jiǎn)單，所需的反應(yīng)條件低，不需引發(fā)劑的引發(fā)即可生成水凝膠，這取決于兩種制備方法的化學(xué)交聯(lián)機(jī)理的不同。本文通過(guò)測(cè)定K-SH 結(jié)構(gòu)中氨基及巰基轉(zhuǎn)化度、FT-IR、1H-NMR和 XPS 對(duì)改性角蛋白的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，推測(cè)出甲基丙烯?；堑鞍姿z的 化 學(xué) 反應(yīng)機(jī)理為：K-SH 結(jié)構(gòu)中的伯氨基可與 MA 發(fā)生酰化反應(yīng)引入C=C 鍵，其與角蛋白分子自身結(jié)構(gòu)中的巰基可發(fā)生巰基 - 乙烯基反應(yīng)；同時(shí) MA 改性角蛋白的酰化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的甲基丙烯酸副產(chǎn)物，也可與角蛋白中的巰基發(fā)生巰基 - 烯反應(yīng)，結(jié)合角蛋白分子鏈之間的氫鍵等其它相互作用，從而得到多重交聯(lián)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即生成交聯(lián)型甲基丙烯?；堑鞍姿z KMA-Gel。