陶瓷羥基磷灰石層析法純化b型流感嗜血桿菌莢膜多糖

高磊，蘇曉葉，石獻華，程亞君，張榮鋒，李倩，劉剛

北京智飛綠竹生物制藥有限公司生產(chǎn)管理部，北京 100176

流感嗜血桿菌為革蘭陰性菌，是引起小兒嚴重細菌感染的主要致病菌［1］，其中b型流感嗜血桿菌引起的病例最多，占95%左右。目前，利用b型流感嗜血桿菌多糖制備的多糖-蛋白結(jié)合疫苗被證明具有良好的安全性和有效性。我國自1997年開始接種b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗以來，b型流感嗜血桿菌引起的呼吸道感染呈下降趨勢［2］。

多糖的生產(chǎn)工藝包括發(fā)酵、粗制、精制3個工序。其中傳統(tǒng)的b型流感嗜血桿菌多糖精制工序與肺炎球菌多糖、腦膜炎球菌多糖、傷寒沙門菌多糖一樣采用苯酚抽提去除蛋白的方法，但苯酚對人體及環(huán)境存在較大危害。隨著科技的進步，其他萃取溶劑、酶解法、超濾、色譜層析已被用于多糖的純化過程中。有報道將TritonX-114等表面活性劑用于b型流感嗜血桿菌多糖的萃?。?］；也有報道通過核酸酶、蛋白酶酶解以及切向流超濾獲得b型流感嗜血桿菌多糖［4-6］；同時，現(xiàn)已利用層析技術成功純化獲得A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖［7］，通用電氣公司等利用層析柱開發(fā)了23價肺炎球菌多糖疫苗層析純化工藝［8-10］。但利用層析法進行b型流感嗜血桿菌莢膜多糖純化的報道較少。而羥基磷灰石可通過鈣離子金屬親和性作用和磷酸離子的陽離子作用結(jié)合蛋白［11-12］，被廣泛應用于單克隆抗體的純化［13］。本研究利用陶瓷羥基磷灰石（ceramic hydroxyapa tite，CHT）層析法純化b型流感嗜血桿菌莢膜多糖，以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的苯酚抽提法。

1 材料與方法

1.1多糖樣品 b型流感嗜血桿菌粗多糖由本公司發(fā)酵生產(chǎn)。

1.2主要試劑及儀器 AKTA pure系統(tǒng)和XK16/10層析柱為美國GE公司產(chǎn)品；CHT為美國伯樂公司產(chǎn)品；50 KD膜包為默克化工技術有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國藥集團化學試劑有限責任公司產(chǎn)品。

1.3粗多糖溶解 稱量500 mg b型流感嗜血桿菌粗多糖，用5 mmol/L PB溶液溶解至終濃度10 g/L，攪拌1 h左右至多糖完全溶解，置2～8℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4工藝路線的篩選 粗多糖溶解后，采用不同方案進行粗多糖純化，見表1。

表1 不同試驗方案步驟Tab.1 Procedures of various protocols

1.4.1層析前乙醇沉淀 向溶解后多糖溶液中加入乙醇至終濃度35%，混勻，使用大容量冷凍離心機6 000×g離心60 min；取上清，補加乙醇至終濃度80%，混勻，用大容量冷凍離心機6 000×g離心60 min；取沉淀，用5 mmol/L PB溶液溶解至終濃度1 g/L，置2～8℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2層析前切向流超濾 使用0.1 m2，50 KD超濾膜包，以5 mmol/L PB溶液作為補充液，對粗多糖溶解或?qū)游銮耙掖汲恋碇腥芤哼M行超濾，至原體積的1/10，重復10次。

1.4.3CHT層析 向CHT層析柱中加入30 mL濃度為1 g/L的多糖溶液，以200 cm/h的流速進行層析，收集流穿的層析液。

1.4.4層析后切向流超濾 使用0.1 m2，50 KD超濾膜包，以純化水作為補充液，對CHT層析中收集的層析液進行超濾，至原體積的1/10，重復10次。

1.4.5層析后乙醇沉淀 向?qū)游龊笄邢蛄鞒瑸V后的多糖溶液中加入乙醇至終濃度為25%，混勻，用大容量冷凍離心機6 000×g離心60 min；取上清，加入乙醇至終濃度為80%，混勻，用大容量冷凍離心機6 000×g離心60 min；收取沉淀。

1.4.6凍干 將收獲的溶液于-20℃條件下預凍干8 h；在-50℃、壓力為50 Pa條件下凍干48 h，收集固體粉末。

1.4.7磷、蛋白、核酸、核糖含量及多糖分子大小檢測 按照《中國藥典》三部（2015版）［14］方法進行檢測。

1.5工藝路線的優(yōu)化

1.5.1乙醇沉淀條件 對選擇的多糖純化路線中乙醇沉淀步驟的乙醇含量進行優(yōu)化。取溶解后多糖溶液，按1.4.1項分別加乙醇至終濃度為5%、15%、25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%進行沉淀，沉淀用純化水溶解后，檢測蛋白及核糖含量。

1.5.2切向流超濾條件 對選擇的多糖純化路線中切向流超濾次數(shù)進行優(yōu)化。按1.4.2項中條件進行切向流超濾，每次超濾后，取樣檢測蛋白、核酸、核糖含量及電導率值。

1.5.3CHT層析條件 以蛋白去除率為響應條件，對CHT層析條件中的柱高、緩沖液離子濃度、緩沖液pH進行響應面分析，見表2。層析后取流穿樣，檢測蛋白含量。

表2 響應面分析因素與水平Tab.2 Factors and levels in response surface analysis

2 結(jié)果

2.1工藝路線的選擇 試驗結(jié)果顯示，粗多糖直接進行CHT層析（方案1），多糖與蛋白同時流穿，見圖1A；通過切向流超濾后層析（方案2），多糖流穿而蛋白與CHT層析柱結(jié)合，見圖1B。方案1獲得多糖的蛋白含量降至54.32 mg/g，相比于粗多糖僅降低了63.4%；而方案2獲得多糖的蛋白含量降至15.64 mg/g，蛋白去除率可達89.4%。因此，粗多糖在CHT層析前應進行切向流超濾，可有效增強CHT對粗多糖中蛋白的結(jié)合，但未達到藥典要求（＜10 mg/g）。層析后進行乙醇沉淀（方案3），多糖中蛋白含量相比于方案2稍微降低，蛋白含量為12.57 mg/g，但回收率僅為11.63%。在切向流超濾前增加乙醇沉淀（方案4），可進一步降低蛋白含量至8.75 mg/g，滿足藥典標準，且回收率均保持在20%以上。見表3。因此選擇方案4作為b型流感嗜血桿菌莢膜多糖純化路線。

表3 不同試驗方案多糖成分的比較Tab.3 Purification of polysaccharides by various protocols

圖1 直接層析（A）與切向流超濾后層析（B）圖譜Fig.1 Profiles of direct chromatography（A）and postultrafiltration tangential flow chromatography（B）

2.2工藝路線的優(yōu)化

2.2.1乙醇沉淀條件 試驗結(jié)果顯示，乙醇含量為35%時，蛋白沉淀率可達27.2%，多糖沉淀率僅為2.6%；乙醇含量為80%時，多糖沉淀率可達76.7%，蛋白沉淀率為62.9%。見圖2。因此選擇乙醇沉淀條件為：用35%乙醇沉淀去除蛋白，離心取上清后，用80%乙醇沉淀收集多糖。

圖2 不同乙醇含量對多糖和蛋白沉淀率的影響Fig.2 Effects of ethanol at different concentrations on precipitation rates of polysaccharide and protein

2.2.2切向流超濾條件 試驗結(jié)果顯示，超濾次數(shù)≥8時，蛋白含量可降至27.9μg/mL，去除率達81.1%，核酸去除率達86.1%，多糖（即核糖含量）僅損失18.9%，而且對CHT層析影響較大的鹽離子可大部分脫除，脫鹽率達89.0%。見圖3?？紤]到工藝的可靠性，超濾次數(shù)定為10次。2.2.3CHT層析條件 試驗結(jié)果顯示，離子濃度在5~15 mmol/L、pH 6.7~7.7之間變化，對蛋白去除率影響較低，柱高提高可增強蛋白去除率；在低pH、低離子濃度下，蛋白去除率較高。見圖4和表4。確定最適CHT條件為：柱高24 cm，PB濃度5 mmol/L，pH 6.7，該步驟蛋白去除率可達86%以上。

圖3 超濾對多糖成分的影響Fig.3 Effect of ultrafiltration on polysaccharide component

表4 條件優(yōu)化響應面試驗方案及結(jié)果Tab.4 Design and result of response surface test under optimized condition

圖4 柱高、離子濃度及pH對蛋白去除率的影響Fig.4 Effects of pH，ion concentration and column height on protein removal rate

2.3工藝路線的確定 根據(jù)工藝路線選擇及優(yōu)化結(jié)果，確定如下工藝路線：將b型流感嗜血桿菌粗多糖溶解后經(jīng)35%和80%濃度乙醇沉淀2次，沉淀物溶解后，經(jīng)切向流超濾10次，CHT層析收獲流穿液，再經(jīng)切向流超濾后凍干。最終獲得的b型流感嗜血桿菌多糖質(zhì)量符合《中國藥典》三部（2015版）要求，見表5。

表5 純化多糖成分表Tab.5 Ingredients of purified polysaccharide

3 討論

當前，b型流感嗜血桿菌莢膜多糖純化一直沿用苯酚抽提工藝。苯酚會對操作人員及環(huán)境造成危害，疫苗中殘留也會對疫苗使用者造成潛在威脅。本研究使用CHT層析純化b型流感嗜血桿菌莢膜多糖，避免了苯酚的使用。經(jīng)超濾后，低離子濃度下的多糖與CHT不結(jié)合而流穿，蛋白質(zhì)、核酸由于陽離子交換作用以及鈣離子螯合作用結(jié)合在CHT層析柱上，實現(xiàn)了多糖的純化。CHT結(jié)構(gòu)為鈣離子與磷酸離子，相較于苯酚具有環(huán)保、安全的優(yōu)勢。層析過程可通過檢測器進行實時監(jiān)測，避免了傳統(tǒng)抽提工藝無法在線監(jiān)測的問題；且自動化程度高，降低了批間差異。因此，使用CHT層析法純化b型流感嗜血桿菌莢膜多糖具有重要的社會價值。

本研究使用CHT層析法純化b型流感嗜血桿菌莢膜多糖，成功獲得了各項質(zhì)量指標均符合《中國藥典》三部（2015版）要求的多糖。但由于CHT與蛋白的結(jié)合能力相較于常規(guī)離子層析柱弱，該純化過程仍需乙醇沉淀加強蛋白的去除。乙醇作為易燃物，對生產(chǎn)廠房及設備要求嚴格。因此，為進一步優(yōu)化工藝，減少易燃易爆，易腐蝕溶劑的使用，還需進一步研究，以期實現(xiàn)b型流感嗜血桿菌莢膜多糖生產(chǎn)的無毒無害工藝。