S AR S-C oV-2 S蛋白單克隆抗體的制備及其雙抗體夾心E L I S A檢測(cè)方法的建立

李妮，龍柏霖，朱文勇，釧鴻云，宋紹輝，劉婧，吳雅楠，廖國(guó)陽(yáng)

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118；

2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110016

目前，由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征癥冠狀病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）（簡(jiǎn)稱(chēng)新冠病毒）引起的新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）在世界范圍內(nèi)流行，感染者已超過(guò)2億例，導(dǎo)致超過(guò)400萬(wàn)人死亡［1］。雖然美國(guó)食品藥品監(jiān)督局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）已批準(zhǔn)多種疫苗和藥物用于預(yù)防和治療SARS-CoV-2的感染和傳播，但SARSCoV-2的傳播感染仍在持續(xù)，目前在英國(guó)、南非、巴西、日本和印度均出現(xiàn)了多種新的SARS-CoV-2變異株［2］。因此，加速疫苗研發(fā)以控制疫情傳播勢(shì)在必行。

棘突蛋白（spike protein，S）是一類(lèi)融合糖蛋白，是冠狀病毒顆粒的主要表面蛋白和中和抗體的主要靶點(diǎn)［3］。新冠病毒S蛋白由S1和S2兩個(gè)亞基組成，其中S1亞基包含1個(gè)與宿主細(xì)胞受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）結(jié)合的受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD），該結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞膜上的hACE2和硫酸肝素相互作用，觸發(fā)S蛋白融合前狀態(tài)的不穩(wěn)定，并隨之轉(zhuǎn)變?yōu)槿诤虾髽?gòu)象；而S2亞基介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞膜的融合［4-7］。宿主感染SARS-CoV-2后，S蛋白在誘導(dǎo)中和抗體和T細(xì)胞應(yīng)答以及保護(hù)性免疫中起關(guān)鍵作用，其中S1亞基的RBD結(jié)構(gòu)域可作為疫苗研發(fā)的靶點(diǎn)。而且當(dāng)前國(guó)內(nèi)外上市及在研的新冠疫苗除滅活疫苗和減毒活疫苗外，大多數(shù)疫苗均以S蛋白作為靶點(diǎn)［8］，因此，制備抗新冠病毒S蛋白的單克隆抗體（簡(jiǎn)稱(chēng)單抗），建立S蛋白定量檢測(cè)體系，對(duì)于新冠疫苗定量十分必要。目前國(guó)內(nèi)外新冠病毒抗原定量檢測(cè)試劑盒價(jià)格均較昂貴，因此，本研究通過(guò)雜交瘤融合細(xì)胞技術(shù)制備高特異性的單抗，并建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法對(duì)新冠病毒S蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)，以期為新冠病毒疫苗定量檢測(cè)及S蛋白功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1病毒、細(xì)胞及疫苗 SARS-CoV-2武漢株滅活病毒液、滅活疫苗半成品、10份疫苗生產(chǎn)工藝不同階段已知S蛋白抗原含量的樣本、H3N2流感病毒液及H3N2單價(jià)原液均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供，SP2/0骨髓瘤細(xì)胞、Vero細(xì)胞碎片及培養(yǎng)上清均由該所生物制品五室提供。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康BALB/c小鼠嗎，雌性，6~8周齡，體重約20 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，動(dòng)物合格證號(hào)：XDWSYB20210366。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（XDWSYB20200409）。

1.3主要試劑及儀器 篩選用重組S蛋白（貨號(hào)：40589-V08B1）、重組N蛋白抗原（貨號(hào)：40588-V08B）、重組RBD抗原（貨號(hào)：40592-V08H）和小鼠免疫球蛋白亞型鑒定試劑盒（貨號(hào)：SEK003）均購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、HAT干粉、HT干粉、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和PEG-4000均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞篩、培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板及酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自德國(guó)BI公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；HRP標(biāo)記的兔抗新冠病毒S蛋白多克隆抗體和肺炎支原體由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所生物制品五室提供，SARS-CoV-2滅活疫苗標(biāo)準(zhǔn)品604（640 U）、0.01 mol/L PBS和青霉素/鏈霉素雙抗由該所提供；1、5、10 mL注射器和1.5、15、50 mL離心管均購(gòu)自上?？七M(jìn)生物技術(shù)有限公司；AKTA蛋白系統(tǒng)及Hi Trap Protein G HP親和層析柱購(gòu)自美國(guó)GE公司；BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：P0010S）；蛋白marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：DM131）；卵清蛋白購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；新生牛血清購(gòu)自蘭州民海生物技術(shù)公司。

1.4單抗的制備及純化

1.4.1動(dòng)物免疫及效價(jià)測(cè)定 以SARS-CoV-2武漢株滅活病毒液作為免疫原免疫BALB/c小鼠，初次免疫取病毒液和弗氏完全佐劑各100μL，經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射免疫；3周后取病毒液和弗氏不完全佐劑各100μL，經(jīng)腹腔注射免疫；2周后進(jìn)行第3次免疫，免疫劑量和方法同第2次免疫。免疫后1周經(jīng)小鼠尾部采血，分離血清，檢測(cè)血清抗體效價(jià)。對(duì)效價(jià)最高的小鼠取50μL病毒液進(jìn)行脾臟免疫后待融合用。

1.4.2陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆 脾臟免疫后3 d進(jìn)行融合。融合前1 d取空白BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和胸腺細(xì)胞，按每孔1×104個(gè)接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將待融合小鼠眼球采血后脫頸處死，按照文獻(xiàn)［9］方法分離小鼠脾細(xì)胞，通過(guò)50%PEG進(jìn)行融合，將融合細(xì)胞加入預(yù)先鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100μL/孔，繼續(xù)置37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿約1/2時(shí)，取細(xì)胞上清液，采用間接ELISA法篩選陽(yáng)性細(xì)胞株，選擇陽(yáng)性值較高的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆培養(yǎng)。

1.4.3單抗腹水的制備及純化 將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按1×106個(gè)/只注射入液體石蠟預(yù)先致敏的小鼠腹腔，7~14 d后無(wú)菌收集腹水，2 625×g離心10 min，分離腹水與上層油脂及下層沉淀，將腹水用0.45μm的濾膜過(guò)濾后，采用Protein G親和層析柱純化腹水，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度；10%SDS-PAGE分析單抗的純度。

1.5單抗的鑒定

1.5.1結(jié)合位點(diǎn)鑒定 采用Western blot法。重組S蛋白變性后經(jīng)10%SDS-PAGE分離，使用0.45μm PVDF膜200 V恒壓轉(zhuǎn)膜1.5 h；以5%脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜；加入獲得的單抗（1∶3 000稀釋?zhuān)?，室溫?fù)u床孵育1 h；用TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶8 000稀釋?zhuān)?，室溫?fù)u床孵育1 h；洗膜5次，采用ECL高靈敏度顯色液進(jìn)行顯色，凝膠成像儀拍照分析結(jié)果。

1.5.2亞型鑒定 利用小鼠抗體亞型檢測(cè)試劑盒對(duì)雜交瘤細(xì)胞制備的腹水抗體進(jìn)行亞型鑒定，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5.3效價(jià)及效應(yīng)濃度測(cè)定 采用間接ELISA法。將1μg/mL重組S蛋白加入96孔酶標(biāo)板，4℃包被過(guò)夜；加入純化后的單抗，100μL/孔，37℃孵育1 h；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶8 000稀釋?zhuān)?00μL/孔，37℃孵育1 h；加入TMB顯色，用2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，上酶標(biāo)儀測(cè)定A450值。將單抗按照2倍系列連續(xù)稀釋后，采用同樣方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算單抗的效應(yīng)濃度。

1.5.4特異性驗(yàn)證 采用間接ELISA法。將重組S蛋白、N蛋白、武漢株滅活病毒液、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、BSA、脫脂牛奶、新生牛血清、H3N2流感病毒液分別加入96孔酶標(biāo)板，100μL/孔，4℃包被過(guò)夜；加入純化的單抗（1∶3 000稀釋?zhuān)?00μL/孔，37℃孵育1 h；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶8 000稀釋?zhuān)?00μL/孔，37℃孵育1 h；加入TMB顯色，用2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，上酶標(biāo)儀測(cè)定A450值。

1.6雙抗體夾心E LI S A檢測(cè)方法的建立 將純化的單抗用包被緩沖液（pH 7.2的0.01 mol/L PBS）稀釋?zhuān)尤朊笜?biāo)板，100μL/孔，4℃包被過(guò)夜；PBST洗板3次，加入封閉液，250μL/孔，37℃封閉2 h；PBST洗板3次，加入SARS-CoV-2滅活疫苗標(biāo)準(zhǔn)品604（640 U）及待檢樣品，以0.01 mol/L PBS作為陰性對(duì)照，100μL/孔，37℃孵育1 h；PBST洗板3次，加入酶標(biāo)抗體稀釋液稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗S蛋白多克隆抗體，100μL/孔，37℃孵育1 h；洗板5次，加入TMB，100μL/孔，37℃避光顯色15 min；加入2 mol/L硫酸終止顯色，50μL/孔，上酶標(biāo)儀測(cè)定A450值。

1.7方法的優(yōu)化

1.7.1包被抗體及酶標(biāo)抗體濃度的確定 采用棋盤(pán)滴定法。將單抗用包被緩沖液稀釋至10、5、2.5、1.25μg/mL，加入酶標(biāo)板，4℃包被過(guò)夜；PBST洗板3次，用1%BSA于37℃封閉2 h；洗板3次，加入SARS-CoV-2滅活疫苗標(biāo)準(zhǔn)品604（640 U）作為陽(yáng)性對(duì)照，0.01 mol/L PBS作為陰性對(duì)照，37℃孵育1 h；加入HRP標(biāo)記的兔抗S蛋白多克隆抗體（用酶標(biāo)抗體稀釋液稀釋至濃度為4、2、1μg/mL），37℃孵育1 h；其余步驟同1.6項(xiàng)。以陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)值（P）與陰性對(duì)照檢測(cè)值（N）的比值（P/N）最大時(shí)對(duì)應(yīng)的抗體濃度組合作為最適工作濃度。

1.7.2封閉液的確定 將包被抗體按1.7.1項(xiàng)確定的最適濃度加入酶標(biāo)板，于4℃包被過(guò)夜；分別以不同封閉液（未封閉、PBS稀釋的1%BSA、2%BSA、1%BSA+1%蔗糖、2%BSA+2%蔗糖）于37℃封閉2 h，每種封閉液設(shè)2個(gè)重復(fù)；加入1.7.1項(xiàng)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照以及確定的最適濃度酶標(biāo)抗體，其余步驟同1.6項(xiàng)。以P/N最大時(shí)對(duì)應(yīng)的封閉液配方作為最適封閉液。

1.8方法的驗(yàn)證

采用SARS-CoV-2滅活疫苗標(biāo)準(zhǔn)品604對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證。標(biāo)準(zhǔn)品中S蛋白抗原含量為640 U（1 U表示中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所疫苗定量檢測(cè)體系的最低檢測(cè)限）。

1.8.1線性范圍及靈敏度 將滅活抗原標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋為320、160、80、40、20、10、5、2.5 U（1 U為1個(gè)酶標(biāo)單位），采用優(yōu)化后的方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。以標(biāo)準(zhǔn)品中S蛋白抗原含量為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)（R2），確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍。并采用優(yōu)化后的體系檢測(cè)51份陰性樣本：Vero細(xì)胞碎片（11份）、0.01 mol/L PBS（10份）、MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（10份）、新生牛血清（10份）、Vero細(xì)胞培養(yǎng)上清液（10份）。在要求99%（單側(cè)）可信度條件下，以吸光度均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為陽(yáng)性判斷值［10］，計(jì)算Cut-off值作為陰陽(yáng)性樣本的判斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)Cutoff值判斷該體系的靈敏度。

1.8.2特異性 用建立的方法分別對(duì)重組S蛋白、重組N蛋白、重組RBD蛋白、SARS-CoV-2武漢株滅活病毒液、SARS-CoV-2滅活疫苗半成品、肺炎支原體抗原、脫脂奶粉、0.01 mol/L PBS、BSA、H3N2單價(jià)原液、Vero細(xì)胞碎片、Vero細(xì)胞上清液、RPMI1640培養(yǎng)基、新生牛血清等14份樣本進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.8.3準(zhǔn)確性 將SARS-CoV-2武漢株滅活病毒液稀釋至200 U后，2倍系列稀釋至高（100 U）、中（50 U）、低（25 U）3個(gè)濃度，將其作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用建立的方法對(duì)S蛋白含量進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，按下式計(jì)算加標(biāo)回收率［11］，驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。

1.9方法的初步應(yīng)用 用建立的方法對(duì)10份疫苗生產(chǎn)工藝不同階段已知S蛋白抗原含量的樣本進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算該方法與中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所新冠疫苗定量方法檢測(cè)結(jié)果的符合率，評(píng)價(jià)該方法的實(shí)用性。

2 結(jié)果

2.1雜交瘤細(xì)胞株的篩選 3次免疫后，1~5號(hào)小鼠的血清效價(jià)分別為1∶51 200、1∶25 600、1∶25 600、1∶51 200和1∶102 400，5號(hào)小鼠血清效價(jià)最高，取其進(jìn)行脾臟免疫后融合。經(jīng)兩輪亞克隆培養(yǎng)和篩選，最終獲得18株分泌抗S蛋白特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分別編號(hào)為：1E8A1、04B6D10、4G12A5、4G12A12、4G12D9、4G12D7、4G12G1、4G12G9、4G12-G10、5B10B5、5B10C11、5B10E12、5B10G2、5H10A4、5H10B11、5H10B12、7B10A1和7B10A2，對(duì)1E8A1、7B10A1和7B10A2細(xì)胞株繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)后制備小鼠腹水抗體，其余細(xì)胞株凍存保種。

2.2單抗的純度及濃度 7B10A2株單抗經(jīng)Protein G柱親和層析純化，可見(jiàn)明顯洗脫峰，且峰值較高，表明抗體含量較高，見(jiàn)圖1。純化后的單抗?jié)舛葹?.487 mg/mL。10%SDS-PAGE分析顯示，純化的單抗只可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量為53 100和25 490的重鏈和輕鏈2個(gè)條帶，抗體純度大于90%，見(jiàn)圖2。

圖1 7B10A2株單抗的親和層析圖譜Fig.1 Affinity chromatographic profile of McAb secreted by 7B10A2 cell strain

圖2 7B10A2株單抗純度的SDS-PAGE分析Fig.2 Analysis of purity of McAb secreted by 7B10A2 cell strain by SDS-PAGE

2.3單抗的鑒定

2.3.1結(jié)合位點(diǎn) Western blot分析顯示，7B10A2株單抗可特異性結(jié)合新冠病毒S蛋白上S1亞基，見(jiàn)圖3。

圖3 Western blot分析7B10A2株單抗的特異性Fig.3 Analysis of specificity of McAb secreted by 7B10A2 cell strain by Western blot

2.3.2亞型 經(jīng)鑒定，7B10A2株單抗為IgG2b型，見(jiàn)圖4。

圖4 7B10A2株單抗的亞型測(cè)定Fig.4 Determination of subtypeof McAb secreted by 7B10A2 cell strain

2.3.3效價(jià)及效應(yīng)濃度 間接ELISA法測(cè)得純化后7B10A2株單抗的效價(jià)為1∶128 000，效應(yīng)濃度為0.137μg/mL。

2.3.4特異性 間接ELISA結(jié)果顯示，7B10A2株單抗可特異性結(jié)合SARS-CoV-2重組S蛋白和武漢株滅活全病毒，而與重組N蛋白等其他成分不發(fā)生反應(yīng)，見(jiàn)圖5。表明該單抗為S蛋白特異性抗體。

圖5 7B10A2株單抗的特異性驗(yàn)證Fig.5 Verificationforspecificityof McAbsecreted by7B10A2 cell strain

2.4雙抗體夾心E LI S A法的優(yōu)化

2.4.1最適包被抗體和酶標(biāo)抗體濃度 當(dāng)包被抗體濃度為5μg/mL，酶標(biāo)抗體濃度為4μg/mL時(shí)，P/N值最大，為20.113，見(jiàn)表1。因此選擇包被抗體及酶標(biāo)抗體最適工作濃度分別為5和4.0μg/mL。

表1 包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度的優(yōu)化Tab.1 Optimization of working concentrations of coating and enzyme labeled antibodies

2.4.2最適封閉液 以2%BSA+2%蔗糖封閉時(shí)，P/N值最大，為42.000，見(jiàn)表2。因此選擇2%BSA+2%蔗糖作為最適封閉液配方。

表2 封閉液優(yōu)化結(jié)果Tab.2 Optimization of blocking reagent

2.5方法的驗(yàn)證

2.5.1線性范圍及靈敏度 標(biāo)準(zhǔn)品中S蛋白抗原含量在2.5～160 U范圍內(nèi)，A450值與樣品濃度呈良好的線性關(guān)系，且R2大于0.99，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖6。經(jīng)計(jì)算，Cut-off值為0.097，根據(jù)Cut-off值確定該方法的檢測(cè)下限為2.5 U，即靈敏度為2.5 U。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of ELISA

2.5.2特異性 用建立的方法對(duì)14份樣本進(jìn)行檢測(cè)，重組S蛋白、重組RBD蛋白、SARS-CoV-2武漢株滅活病毒液、SARS-CoV-2滅活疫苗半成品4份樣本為陽(yáng)性，其余10份樣本檢測(cè)結(jié)果為陰性，均與已知背景相符，表明建立的雙抗體夾心ELISA法具有良好的特異性。

2.5.3準(zhǔn)確性 將標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至高、中、低3個(gè)不同濃度進(jìn)行檢測(cè)，S蛋白抗原加樣回收率在92.10%~111.58%之間，見(jiàn)表3。表明建立的方法準(zhǔn)確性較高。

表3 準(zhǔn)確性驗(yàn)證結(jié)果Tab.3 Validation for accuracy

2.6方法的初步應(yīng)用 用建立的方法對(duì)10份疫苗生產(chǎn)工藝不同階段樣本進(jìn)行檢測(cè)，與中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所新冠疫苗定量檢測(cè)方法的符合率在94.2%～109.0%之間，見(jiàn)表4。表明該方法可應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)工藝中樣本的定量檢測(cè)。

表4 符合率驗(yàn)證結(jié)果Tab.4 Validation for coincidence rate

3 討論

SARS-CoV-2的感染傳播給世界公共衛(wèi)生安全造成了極大威脅，也給全球各國(guó)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)影響［12］，截至目前，Delta、Lambda等突變株的傳播仍威脅著人類(lèi)健康［13］。疫苗是目前控制全球疫情蔓延最經(jīng)濟(jì)、有效的手段。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，疫情至今共有近200種新冠疫苗處于研發(fā)階段，并已批準(zhǔn)10余種疫苗在1個(gè)或多個(gè)地區(qū)上市。這些疫苗基本均以S蛋白或RBD為靶點(diǎn)，因此，建立針對(duì)S蛋白的定量檢測(cè)體系對(duì)于疫苗定量具有重要意義。

本研究通過(guò)雜交瘤技術(shù)篩選制備了18株S蛋白特異性單抗，并通過(guò)7B10A2細(xì)胞株制備了腹水單抗，建立了定量檢測(cè)S蛋白的雙抗體夾心ELISA方法。該方法可特異性檢測(cè)新冠病毒S蛋白，在2.5~160 U范圍內(nèi)，R2大于0.99，線性良好，檢測(cè)靈敏度可達(dá)1.25 U，且樣品檢測(cè)回收率在92.10%~111.58%之間，檢測(cè)來(lái)自疫苗生產(chǎn)工藝的已知S蛋白抗原含量樣本符合率在94.2%～109.0%之間。表明該方法可對(duì)滅活疫苗生產(chǎn)工藝中的樣本準(zhǔn)確定量，且該方法可特異性檢測(cè)新冠病毒RBD蛋白，有望應(yīng)用于重組疫苗中RBD蛋白抗原含量測(cè)定。

本研究采用有限稀釋法進(jìn)行單克隆篩選，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，操作繁瑣，且易造成陽(yáng)性細(xì)胞株丟失。目前，已有單個(gè)B細(xì)胞分選技術(shù)以及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分選，可快速篩選出陽(yáng)性細(xì)胞株，且不易造成陽(yáng)性細(xì)胞株丟失，可有效提高篩選效率。另外，雜交瘤細(xì)胞制備單抗的方法較為成熟，但存在制備抗體所需時(shí)間較長(zhǎng)，單抗的抗性易丟失等問(wèn)題［14］，目前已開(kāi)發(fā)出噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)、基因工程抗體技術(shù)等多種抗體制備平臺(tái)，可供比較選擇。

綜上所述，本研究通過(guò)制備單抗建立了簡(jiǎn)便、快速、低成本的S蛋白定量檢測(cè)雙抗體夾心ELISA方法，有望應(yīng)用于新冠病毒滅活疫苗中S蛋白含量和重組疫苗中RBD蛋白含量檢測(cè)。但隨著疫情傳播，多種變異毒株相繼出現(xiàn)，給疫苗的保護(hù)性帶來(lái)了挑戰(zhàn)，因此，開(kāi)發(fā)對(duì)多種變異毒株均具有保護(hù)作用的廣譜疫苗成為疫情防控的關(guān)鍵。近期的一項(xiàng)研究表明［15］，基于多種冠狀病毒共同存在的RBD開(kāi)發(fā)納米疫苗，可促使猴體產(chǎn)生針對(duì)多種變異株及其他冠狀病毒的中和抗體，從而達(dá)到100%的保護(hù)效果。同時(shí)，新的研究表明［16］，mRNA疫苗可對(duì)包括突變株在內(nèi)的新冠病毒產(chǎn)生長(zhǎng)期保護(hù)效力，這為開(kāi)發(fā)應(yīng)對(duì)多種突變株的“廣譜”新冠病毒疫苗帶來(lái)了希望。通過(guò)進(jìn)一步的驗(yàn)證和完善，希望“全能疫苗”能夠有效控制疫情的傳播。