流感疫苗神經(jīng)氨酸酶活性熒光底物檢測法的建立及驗證

鄧濤，張家友，劉京，呂傳碩，楊曉明

1.國家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430207；

2.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北武漢 430207；

3.中國生物技術(shù)股份有限公司，北京 100029

流感是由流感病毒引起的一種急性呼吸道疾病，全球每年約有500萬感染病例及25萬～64萬死亡病例［1］，接種疫苗是預(yù)防流感最有效的方法［2］。流感疫苗主要抗原包括血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA），這兩種抗原在人和動物體內(nèi)均能誘導(dǎo)保護性免疫反應(yīng)［3-4］。

NA是流感病毒包膜上的兩種糖蛋白之一，具有切割唾液酸的酶活性，在病毒復(fù)制周期中發(fā)揮關(guān)鍵作用。NA抗原有助于提高疫苗效力，其特異性抗體可對疾病產(chǎn)生抵抗作用［5-6］。研究表明，無論是自然感染還是免疫接種產(chǎn)生的NA特異性抗體均具有獨立的保護作用［7-8］。在臨床前研究中，用NA抗原免疫動物可抵抗流感病毒致死劑量的攻擊［9-12］；另有臨床前研究表明，NA特異性免疫可限制流感病毒在人支氣管上皮細胞中的復(fù)制，從而保護受試者免受流感病毒感染［13-14］。與HA比較，NA可提供更廣泛的交叉保護作用，許多NA特異性抗體能夠結(jié)合至相應(yīng)亞型的保守表位上，從而保護機體免受異源病毒攻擊［8，15］。流感疫苗在生產(chǎn)過程中，使NA和HA的含量達到天然流感病毒包膜上的比例，才能夠誘導(dǎo)一種平衡反應(yīng)，從而更好地誘導(dǎo)免疫反應(yīng)［16］。HA可通過單向免疫擴散試驗（single radial immunodiffusion，SRID）進行定量檢測［17］，但目前尚無用于檢測NA的統(tǒng)一標準和方法，這也成為制約流感疫苗質(zhì)量評價的瓶頸之一。NA的酶活性（1個酶活性單位定義為在37℃，pH 7.5環(huán)境下，每分鐘催化1 nmol酶底物所需的酶量）是反映其天然結(jié)構(gòu)的較好指標，與免疫原性密切相關(guān)，因此NA的酶活性在疫苗研發(fā)和質(zhì)量控制中具有重要意義。本實驗旨在建立一種熒光底物法用于NA酶活性的檢測，并進行方法的驗證，以期為流感疫苗的生產(chǎn)提供一種可靠的質(zhì)控方法。

1 材料與方法

1.1樣品及參考品 MDCK細胞基質(zhì)四價流感裂解疫苗（批號：202012005）及該批次疫苗上游半成品（包括H1N1、H3N2、BV、BY各單價的病毒收獲液、純化液和原液）均由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司（簡稱武漢公司）病毒性疫苗研究二室提供；雞胚基質(zhì)四價流感裂解疫苗（批號：Z201912001）由武漢公司流感疫苗室提供；重組NA蛋白參考品（貨號：40017VNAHC1）購自北京義翹神州科技股份有限公司。

1.2主要試劑及儀器 唾液酸類似物4-MUNANA（貨號：M8639）購自美國Sigma公司；2-（N-嗎啡啉）乙磺酸［2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid，MES）］（貨號：30123760）及CaCl2（貨號：100-05817）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；黑色不透明96孔板（貨號：F605034）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；多功能微孔板檢測儀（型號：EnSight）購自德國Perkinelmer公司。

1.3溶液配制 酶底物母液：用超純水將4-MUNANA溶解至2 mmol/L，避光配制，-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融；MES緩沖液：用超純水將MES和CaCl2分別稀釋至終濃度32.5和4 mmol/L，用NaOH調(diào)節(jié)pH，經(jīng)0.22μm針頭濾器過濾，4℃保存。

1.4方法的建立 用無菌PBS（pH 7.2）將待檢樣品進行稀釋，加入96孔板，50μL/孔；酶活力依賴于反應(yīng)體系酸堿度，NA與4-MUNANA的酶促反應(yīng)通常使用MES溶液作為緩沖液［18］，因此用MES緩沖液稀釋酶底物母液，避光配制且現(xiàn)配現(xiàn)用，加入96孔板，50μL/孔，振蕩混勻，于一定溫度下反應(yīng)適當時間；以365 nm作為激發(fā)光，測定445 nm的發(fā)射光的熒光強度，即相對熒光值（relative fluorescence units，RFUs）。

1.5方法的優(yōu)化

1.5.1酶底物濃度的確定 將4種流感病毒單價原液進行100倍稀釋，以PBS作為對照；用pH為7.5的MES緩沖液將酶底物母液分別稀釋為10、20、30、40、50μmol/L。加入96孔板后，于37℃反應(yīng)40 min，測定熒光強度，選擇熒光強度高于3倍噪音且酶反應(yīng)未達飽和的濃度作為酶底物最佳濃度。

1.5.2反應(yīng)時間的確定 將4種流感病毒單價原液進行100倍稀釋，以PBS作為對照；用pH為7.5的MES緩沖液將酶底物母液稀釋至最佳濃度，加入96孔板后，于37℃反應(yīng)，每2 min測定1次熒光強度至90 min。以反應(yīng)時間為橫坐標，熒光強度為縱坐標，繪制反應(yīng)進程曲線。

1.5.3緩沖液pH的確定 將4種流感病毒單價原液進行100倍稀釋，以PBS作為對照；MES緩沖液pH分別調(diào)節(jié)為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5和9.5，用MES緩沖液將酶底物母液稀釋至最佳濃度，加入96孔板后，于37℃反應(yīng)40 min，測定熒光強度。

1.5.4反應(yīng)溫度的確定 將4種流感病毒單價原液進行100倍稀釋，以PBS作為對照；用pH為7.5的MES緩沖液將酶底物母液稀釋至最佳濃度，分別于4、25、37和45℃反應(yīng)40 min，測定熒光強度。

1.6方法的驗證

1.6.1線性范圍 將重組NA蛋白參考品用無菌PBS（pH 7.2）稀釋為2 000、1 000、500、250、125、62.5 U/L，每個樣品平行設(shè)3個孔，采用1.5項優(yōu)化的方法測定熒光強度，試驗重復(fù)3次，以參考品濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.6.2準確度 將重組NA蛋白參考品用無菌PBS（pH 7.2）稀釋為高（1 600 U/L）、中（800 U/L）、低（400 U/L）3個濃度，每個樣品平行設(shè)8個孔，采用1.5項優(yōu)化的方法測定熒光強度，試驗重復(fù)2次，計算樣品回收率。

1.6.3精密度 將重組NA蛋白參考品用無菌PBS（pH 7.2）稀釋為高（1 600 U/L）、中（800 U/L）、低（400 U/L）3個濃度，每個樣品平行設(shè)6個孔，于2個不同時間采用1.5項優(yōu)化的方法測定熒光強度，計算2個時間點共12次檢測結(jié)果的均數(shù)±標準差（±s）及變異系數(shù)（CV）。

1.7方法的應(yīng)用 將H1N1、H3N2、BV、BY相應(yīng)的病毒收獲液、純化液和原液進行總蛋白定量后，分別稀釋至線性范圍的相同蛋白濃度。通過相同方法對MDCK細胞基質(zhì)和雞胚基質(zhì)的四價流感裂解疫苗進行稀釋，分別以未接種病毒的MDCK細胞懸液和雞胚尿囊液作為相應(yīng)的陰性對照。采用優(yōu)化的方法對樣品進行檢測。

2 結(jié)果

2.1方法的優(yōu)化

2.1.1最佳酶底物濃度 4種單價流感病毒原液的熒光強度隨酶底物濃度增加而升高，該試驗噪音即本底約為700，見圖1。信號高于3倍噪音且酶反應(yīng)未達飽和的底物濃度為20μmol/L，即為酶底物最佳濃度。

圖1 不同濃度酶底物的熒光強度Fig.1 Fluorescent strengths of enzyme substrate at various concentrations

2.1.2最佳反應(yīng)時間 4種單價流感病毒原液在初始階段急劇上升，隨著時間的延長，曲線趨于平坦，反應(yīng)速度降低（曲線斜率為酶促反應(yīng)初速度），60 min后，熒光信號開始減弱，可能是由于產(chǎn)物增多抑制了酶活性，且出現(xiàn)了逆反應(yīng)。在30~60 min期間，4種樣品的熒光強度基本達到最大值且相對穩(wěn)定，酶促反應(yīng)達到飽和，因此選擇40 min為最佳反應(yīng)時間。見圖2。

圖2 酶促反應(yīng)進程曲線Fig.2 Progress curves of enzymatic reaction

2.1.3最佳反應(yīng)緩沖液pH 隨著pH的升高，PBS對照組的熒光強度逐漸升高，4種單價流感病毒原液的熒光強度在pH 6.5~8.5較為穩(wěn)定，因此選擇7.5作為緩沖液最佳pH，見圖3。

圖3 不同pH的熒光強度Fig.3 Fluorescent strengths of samples at various pH values

2.1.4最佳反應(yīng)溫度 4種單價流感病毒原液在4℃時熒光強度較低，25、37和45℃時的熒光強度差異較小，考慮到NA的天然催化環(huán)境為機體環(huán)境，因此選擇37℃作為最佳反應(yīng)溫度，見圖4。

圖4 不同反應(yīng)溫度的熒光強度Fig.4 Fluorescent strengths of samples at various reaction temperatures

2.2方法的驗證

2.2.1線性范圍 NA檢測標準曲線見圖5。重組NA蛋白參考品濃度在62.5~2 000 U/L范圍內(nèi)，與熒光強度呈良好的線性關(guān)系，重復(fù)檢測3次的標準曲線方程分別為y=15.39x+466.33、y=15.68x+155.07、y=15.98x+378.62，R2分別為0.992 7、0.997 0、0.995 1，均＞0.99。

圖5 NA檢測的標準曲線Fig.5 Standard curve for determination of NA activity

2.2.2準確度 1 600、800、400 U/L 3個濃度參考品的回收率分別為92.60%~106.96%、85.54%~113.11%、87.00%~114.54%，均在85%~115%范圍內(nèi)，表明該方法具有良好的準確度，見表1。

表1 準確度驗證結(jié)果Tab.1 Verification for accuracy

2.2.3精密度 1 600、800、400 U/L 3個濃度參考品于2個時間點共12次檢測結(jié)果的CV分別為6.40%、8.25%、6.92%，CV均＜15%，見表2。表明該方法具有良好的精密度。

表2 精密度驗證結(jié)果Tab.2 Verification for precision

2.3方法的應(yīng)用 保持總蛋白濃度一致的情況下，H1N1、H3N2、BV和BY 4種型別的流感疫苗半成品在不同階段（病毒收獲液、純化液和原液）NA活性逐漸降低，H1N1、H3N2、BV和BY原液中的NA酶活性分別為20 440.06、23 010.87、19 546.90、18 714.87 U/L，其中H3N2原液NA活性高于其他3種原液，見圖6。表明在疫苗生產(chǎn)過程中損失了部分有活性的NA。細胞基質(zhì)及雞胚基質(zhì)四價流感裂解疫苗的NA活性分別為61 585.82和69 583.51 U/L（相應(yīng)陰性對照分別為116.58和111.44 U/L），前者低于后者。

圖6 四價流感裂解疫苗半成品的NA活性Fig.6 NA activity of final bulk of tetravalent influenza split vaccine

3 討論

NA含量測定的最簡單方法是將疫苗樣品進行SDS-PAGE分析，再使用相同毒株/亞型的NA特異型抗體進行Western blot檢測，通過掃描灰度對NA進行半定量［19］。該方法可用于比較不同廠家及不同批次疫苗制劑的NA相對含量，但不能評估NA的結(jié)構(gòu)完整性，也不能精確定量。另有一種方法是采用毒株/亞型特異性抗體的ELISA法直接定量NA，可用于測量正確折疊的NA蛋白含量［20］。目前，已開發(fā)出基于高效液相色譜和質(zhì)譜的方法，但操作復(fù)雜，不能確定所分析NA是否具有完整的蛋白結(jié)構(gòu)［21］。僅有四聚體形式的NA才具有較強的唾液酸酶活性，而酶活性與免疫原性密切相關(guān)，因此酶活性檢測在分析疫苗NA的質(zhì)量方面具有重要意義［22］。

本研究采用唾液酸類似物4-MUNANA作為酶底物，特異性與NA反應(yīng)并產(chǎn)生熒光物質(zhì)，即四甲基傘形酮（4-methylumbelliferone，4-MU），通過檢測4-MU的熒光強度來評價NA活性。考慮到酶促反應(yīng)影響因素主要包括底物濃度、反應(yīng)時間、緩沖液pH及反應(yīng)溫度，因此應(yīng)用細胞基質(zhì)四價流感疫苗各單價原液作為樣品，對這4種反應(yīng)條件進行優(yōu)化，得到最佳反應(yīng)條件為：酶底物濃度為20μmol/L，反應(yīng)時間為40 min，反應(yīng)緩沖液pH為7.5，反應(yīng)溫度為37℃，該結(jié)果與相關(guān)文獻報道基本相符［18］。本研究采用已知酶活的重組NA蛋白作為參考品，對優(yōu)化的方法進行方法驗證，結(jié)果顯示，重組NA蛋白參考品濃度在62.5~2 000 U/L范圍內(nèi)，與熒光強度呈良好線性關(guān)系，R2均＞0.99。采用優(yōu)化的方法對細胞基質(zhì)四價流感疫苗各階段工藝過程的樣品進行分析顯示，疫苗制劑中的NA活性在不同階段產(chǎn)生不同程度的損失，其原因可能是疫苗制劑在超濾濃縮、病毒裂解及層析純化等程序中損傷NA的四聚體結(jié)構(gòu)，從而影響其活性。不同基質(zhì)流感疫苗中NA活性遠超過相應(yīng)對照品，活性較高。

綜上所述，本研究建立了檢測NA活性的熒光底物法，該方法具有良好的準確度和精密度，可用于不同基質(zhì)生產(chǎn)的流感疫苗及不同生產(chǎn)階段的半成品中具有酶活性NA的定量檢測，為流感疫苗的質(zhì)控提供了一種簡便實用的方法。