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    2012—2018年長(zhǎng)春市手足口病非腸道病毒A組71型腸道病毒V P1基因特征分析

    2022-05-13 06:46:18張智麗李晨光張興國(guó)孫宇崔薇喬鳳娟孫炳欣
    關(guān)鍵詞:腸道病毒長(zhǎng)春市毒株

    張智麗,李晨光,張興國(guó),孫宇,崔薇,喬鳳娟,孫炳欣

    長(zhǎng)春市疾病預(yù)防控制中心,吉林長(zhǎng)春 130033

    手足口?。╤and,foot and mouth disease,HFMD)是一種由多種腸道病毒引起的、我國(guó)法定報(bào)告管理的丙類傳染?。?],主要通過(guò)糞-口途徑傳播,也可通過(guò)呼吸道和接觸傳播,5歲以下嬰幼兒為主要易感人群,好發(fā)于夏秋季[2]。自從我國(guó)將HFMD列入丙類傳染病管理后,長(zhǎng)春市HFMD病例報(bào)告始終位于丙類傳染病前列[3]。2008—2012年,長(zhǎng)春地區(qū)HFMD優(yōu)勢(shì)病原為腸道病毒71型(enteroviruses 71,EV-71)[4],而近年來(lái)病原構(gòu)成逐漸發(fā)生變化,EV-71占比逐漸下降,柯薩奇病毒A組16型(coxsackievirus A16,CV-A16)及其他腸道病毒比重逐漸增加[5-6]。HFMD至今仍無(wú)有效疫苗及特異性治療手段。因此,加強(qiáng)疾病監(jiān)測(cè),準(zhǔn)確處置疫情,開(kāi)展健康教育是控制該病流行的關(guān)鍵[7]。本研究分析了2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例的病原學(xué)特征,為今后開(kāi)展本地區(qū)傳染病的預(yù)防控制工作提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1樣本 收集2012—2018年長(zhǎng)春市哨點(diǎn)醫(yī)院和長(zhǎng)春地區(qū)各縣(市)區(qū)疾控中心采集的HFMD病例的肛拭子、糞便、咽拭子樣本(獲得長(zhǎng)春市疾病預(yù)防控制中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn))。嚴(yán)格按照衛(wèi)生部印發(fā)的《手足口病預(yù)防控制指南(2009版)》[8]要求采集、運(yùn)輸、保存。納入標(biāo)準(zhǔn):①臨床診斷病例。在流行季節(jié)發(fā)病,常見(jiàn)于學(xué)齡前兒童,嬰幼兒多見(jiàn),發(fā)熱伴手、足、口、臀部皮疹,部分病例可無(wú)發(fā)熱;極少數(shù)重癥病例皮疹不典型,臨床診斷困難,需結(jié)合病原學(xué)或血清學(xué)檢查進(jìn)行診斷。②確診病例。臨床診斷病例具有下列之一者即可確診:腸道病毒(CV-A16、EV-71等)特異性核酸檢測(cè)陽(yáng)性;分離出腸道病毒,并鑒定為CV-A16、EV-71或其他可引起HFMD的腸道病毒;急性期及恢復(fù)期血清CV-A16、EV-71或其他可引起HFMD的腸道病毒中和抗體有4倍以上升高。

    1.2主要試劑及儀器 全自動(dòng)核酸提取儀、腸道病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碩世生物科技股份有限公司;RT-PCR試劑盒(210212)、毛細(xì)管電泳儀(卡夾QIAxcel,DNA Screening Cartridge)購(gòu)自德國(guó)凱杰(QIAGEN)公司。

    1.3病毒核酸提取及PCR檢測(cè) 采用全自動(dòng)核酸提取儀提取樣本核酸后,再利用腸道病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)樣本中總腸道病毒、腸道病毒A組71型(EV-A71)和CV-A16進(jìn)行熒光定量PCR。其中非EV-A71陽(yáng)性樣本VP1區(qū)利用引物[CV-A6-VP1-F:5′-TGTTGGGCACG(A)CACGTCTGGGA-3′,CV-A6-VP1-R:5′-CCAGCATAATTTGGGTTGGCT(C)TTG-3′;CV-A16-VP1-F:5′-CAGTAATACACACTAC(T)AGGGCA-3′,CV-A16-VP1-R:5′-ACCCTATAGTTGCCT(C)ACATATA-3′;CV-A10-VP1-F:5′-ATGGCDACAGGCAAGATGCT-3′,CV-A10-VP1-R:5′-ATAYCTAGCAGGGTAATACTC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增片段大小為1 000 bp。反應(yīng)條件為:55℃30 min;94℃2 min;94℃15 s,55℃30 s,68℃40 s,共35個(gè)循環(huán);72℃10 min。PCR產(chǎn)物用毛細(xì)管電泳儀(卡夾QIAxcel,DNA Screening Cartridge)進(jìn)行檢測(cè),并送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

    1.4生物信息學(xué)分析 用LaserGene軟件包中Mega-Align軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì),截取VP1區(qū)進(jìn)行后續(xù)分析。用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的非EV-A71各基因型代表株的參比序列均來(lái)自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。采用NJ(neighbor-joiningmethod)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),利用MEGA X軟件,設(shè)置bootstrap值為1 000。

    2 結(jié)果

    2.1VP1區(qū)基因進(jìn)化分析

    2012—2018年長(zhǎng)春市2 621例核酸檢測(cè)陽(yáng)性病例中,非EV-A71陽(yáng)性樣本VP1區(qū)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示,共獲得83條CV-A16序列、30條CV-A6序列和10條CV-A10序列。

    2.1.1CV-A16分離株VP1區(qū)基因進(jìn)化分析 基于VP1區(qū)(891 bp),對(duì)CV-A16序列及其各基因型和亞型參考株序列進(jìn)行進(jìn)化分析,結(jié)果顯示,2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A16毒株相對(duì)集中,83條序列均屬于B1亞型,其中8條屬于B1a亞型(2012年1條,2018年7條),其他均屬于B1b亞型。見(jiàn)圖1。

    圖1 2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A16型VP1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of VP1 protein of CV-A16 in Changchun City from 2012 to 2018

    2.1.2CV-A6分離株VP1區(qū)基因進(jìn)化分析 基于VP1區(qū)(915 bp),對(duì)CV-A6序列及其各基因型和亞型參考株序列進(jìn)行進(jìn)化分析,結(jié)果顯示,2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A6毒株相對(duì)集中,30條序列均屬于D3亞型。見(jiàn)圖2。

    圖2 2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A6型VP1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of VP1 protein of CV-A6 in Changchun City from 2012 to 2018

    2.1.3CV-A10分離株VP1區(qū)基因進(jìn)化分析 基于VP1區(qū)(894 bp),對(duì)CV-A10序列及其各基因型和亞型參考株序列進(jìn)行進(jìn)化分析,結(jié)果顯示,2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A10毒株相對(duì)集中,10條序列均屬于D2亞型。見(jiàn)圖3。

    圖3 2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A10型VP1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of VP1 protein of CV-A10 in Changchun City from 2012 to 2018

    2.2VP1區(qū)核苷酸序列同源性分析

    2.2.1CV-A16流行株VP1區(qū)同源性分析 結(jié)果顯示,CV-A16各流行株與CV-A16原型株的同源性為75.0%~77.0%,B1a亞型分支與B1a亞型參考株的同源性為92.3%~98.5%,B1b亞型分支與B1b亞型參考株的同源性為94.5%~99.2%,與B1c亞型同源性為88.4%~91.7%,與B2亞型同源性為89.3%~93.0%,其中與B1b亞型同源性較高,各株間同源性為88.2%~100.0%。見(jiàn)圖4。

    圖4 2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A16型基于VP1區(qū)序列的同源性分析Fig.4 Homology of CV-A16 based on sequence of VP1 region in HFMD cases in Changchun City from 2012 to 2018

    2.2.2CV-A6流行株VP1區(qū)同源性分析 結(jié)果顯示,CV-A6各流行株與CV-A6原型株的同源性為82.7%~83.5%,與B1亞型參考株的同源性為81.9%~93.7%,與B2亞型參考株的同源性為82.1%~84.5%,與C1亞型參考株的同源性為85.1%~86.5%,與C2亞型參考株的同源性為83.8%~84.8%,與D1亞型參考株的同源性為89.7%~91.1%,與D2亞型參考株的同源性為89.2%~91.3%,與D3亞型參考株的同源性為92.8%~98.1%,其中與D3亞型同源性較高,各株間同源性為91.6%~99.8%。見(jiàn)圖5。

    圖5 2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A6型基于VP1區(qū)序列的同源性分析Fig.5 Homology of CV-A6 based on sequence of VP1 region in HFMD cases in Changchun City from 2012 to 2018

    2.2.3CV-A10流行株VP1區(qū)同源性分析 結(jié)果顯示,CV-A10各流行株與CV-A10原型株的同源性為76.3%~77.0%,與B亞型參考株的同源性為78.9%~80.3%,與C亞型參考株的同源性為82.9%~83.8%,與D1亞型參考株的同源性為94.1%~95.4%,與D2亞型參考株得同源性為96.4%~98.4%,與D3亞型參考株的同源性為94.6%~96.1%,其中與D2亞型同源性較高,各株間同源性為96.4%~100.0%。見(jiàn)圖6。

    圖6 2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A10型基于VP1區(qū)序列的同源性分析Fig.6 Homology of CV-A10 based on sequence of VP1 region in HFMD cases in Changchun City from 2012 to 2018

    2.3CV-A16流行株變異位點(diǎn)分析 CV-A6和CVA10流行株突變位點(diǎn)并未發(fā)現(xiàn)明顯代表性,因此,選取CV-A16流行株進(jìn)行變異位點(diǎn)分析。將所獲序列中的代表序列經(jīng)MEGA X軟件翻譯獲得氨基酸序列后進(jìn)行變異位點(diǎn)分析,以病毒流行株JX068833.1 BJ08/07 B1b為參考株,結(jié)果顯示,CV-A16毒株中存在14個(gè)氨基酸位點(diǎn)變異,有12株在第14位點(diǎn)上發(fā)生N天冬酰胺→S絲氨酸(N14S)的變異,其中9株同時(shí)存在L215P變異,1株(ccHFMC2017030)同時(shí)存在N14S、L215P和F131S變異,另有1株(cc-HFMC-2017007)存在N14S、M23L和T94A 3個(gè)位點(diǎn)變異。有9株存在M23L變異,其中8株為B1a亞型,這8株除ccHFMC2012015外,均同時(shí)存在T164K和V251I變異,ccHFMC2012015則同時(shí)存在N218S變異。有2株同時(shí)存在T11A變異,其中ccHFMC2-016046同時(shí)存在I262V變異。在ccHFMC2017008、ccHFMC201430、ccHFMC201421這3株中則分別可見(jiàn)A22T、I235V和T289A變異。見(jiàn)表1。

    表1 2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A16型VP1區(qū)氨基酸變異位點(diǎn)Tab.1 Variation sites of amino acids in VP1 region of CV-A16 in HFMD cases in Changchun City from 2012 to 2018

    3 討論

    HFMD是一種常見(jiàn)于嬰幼兒和兒童的急性腸道傳染病,病程復(fù)雜、癥狀多樣,多數(shù)可自愈,少數(shù)病例會(huì)出現(xiàn)重癥,甚至危及生命[9]。由于HFMD的病原具有多樣性,且病原之間經(jīng)常發(fā)生重組變異,因此,隨著每年優(yōu)勢(shì)病原株發(fā)生變遷,就會(huì)引起新一輪HFMD的暴發(fā)流行[10],在世界范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)。

    在國(guó)外,CV-A16常是大規(guī)模HFMD流行時(shí)的主要病原體[11]。以往研究多認(rèn)為CV-A16僅引起輕癥患者,但近年來(lái),越來(lái)越多的報(bào)道顯示,CV-A16感染也可引起心肌、腦部和肺部等疾病,甚至引起死亡[12-14]。我國(guó)自1981年首次報(bào)道CV-A16型HFMD病例以來(lái),其他多個(gè)省份相繼出現(xiàn)關(guān)于CV-A16型腸道病毒引起的HFMD暴發(fā)報(bào)道[15-16]。CV-A16被分為2個(gè)基因型:A和B基因型,而B(niǎo)基因亞型又分為B1和B2 2個(gè)亞型。對(duì)2012—2018年長(zhǎng)春市83株CV-A16病原株VP1區(qū)的進(jìn)化分析結(jié)果顯示,近7年長(zhǎng)春市CV-A16病原株均屬于B1基因亞型,其中8條屬于B1a亞型,其他均屬于B1b亞型。從CV-A16 VP1區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上可以看出,B1b亞型上包括2012—2018年各年份的毒株,而B(niǎo)1a亞型的分支上僅有2012年的1條和2018年的7條流行株,表明2012—2018年長(zhǎng)春市內(nèi)B1a和B1b亞型屬于共循環(huán)、共進(jìn)化的過(guò)程,而B(niǎo)1b亞型的CV-A16一直是優(yōu)勢(shì)流行株,2018年B1a亞型與B1b亞型共同流行,這與其他省市的報(bào)道相同[17-19]。將B1a和B1b分流支分別進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)B1b亞型分支與B1b亞型參考株同源性為94.5%~99.2%,B1a亞型分支與B1a亞型參考株同源性為92.3%~98.5%,各株間同源性為88.2%~100.0%,與廣東、北京、河南等中國(guó)其他省份的CV-A16代表株來(lái)源相近,表明與其他病原體相比為區(qū)域性暴發(fā)。

    變異位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn),2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例CV-A16毒株中存在14個(gè)氨基酸位點(diǎn)變異,12株發(fā)現(xiàn)在第14位點(diǎn)上發(fā)生N天冬酰胺→S絲氨酸(N14S)的變異,這與2016年成都流行株(MW179030.1 ZG2016 B1b)相同,其中有9株同時(shí)存在L215P變異(2017年8株,2018年1株),提示該位點(diǎn)變異可能已演變?yōu)檩^穩(wěn)定的基因特征被流行傳遞下來(lái)。有9株存在M23L變異,其中8株為B1a亞型,這8株除ccHFMC2012015外,均同時(shí)存在T164K和V251I變異,這與2018年廣州流行株(MT119437.1 CHN/GZ/2018 B1a)相同。長(zhǎng)春市有1株(ccHFMC2017-007)存在N14S、M23L和T94A 3個(gè)位點(diǎn)變異,VP1第94~108位氨基酸肽段是一個(gè)保守型線性中和抗體,可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗CV-A16感染的中和抗體[20],這可能降低親和力和免疫優(yōu)勢(shì),影響中和抗體結(jié)合。

    自2008年,芬蘭暴發(fā)了1起由CV-A6引起的HFMD疫情后[21],全球各地均有CV-A6引起HFMD暴發(fā)流行的報(bào)道[22-23],長(zhǎng)春市2013年也曾暴發(fā)過(guò)由CV-A6引起的HFMD疫情[24]。目前國(guó)內(nèi)將CVA6主要?jiǎng)澐譃锳~D 4個(gè)基因型別,CV-A6原型株為A分支,未在國(guó)內(nèi)流行。對(duì)2012—2018年長(zhǎng)春市30株CV-A6病原株VP1區(qū)的進(jìn)化分析結(jié)果顯示,近7年長(zhǎng)春市CV-A6病原株均屬于D3基因亞型。2012—2018年長(zhǎng)春市CV-A6流行株與CV-A6原型株的同源性為82.7%~83.5%,與B1亞型參考株的同源性為81.9%~93.7%,與B2亞型參考株的同源性為82.1%~84.5%,與C1亞型的同源性為85.1%~86.5%,與C2亞型的同源性為83.8%~84.8%,與D1亞型的同源性為89.7%~91.1%,與D2亞型的同源性為89.2%~91.3%,與D3亞型的同源性為92.8%~98.1%,其中與D3亞型的同源性較高,各株間同源性為91.6%~99.8%。目前長(zhǎng)春主要流行的CV-A6毒株與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)流行的型別相同[25],均為D3亞型,并未進(jìn)化出新的型別。

    雖然CV-A10并不是長(zhǎng)春市HFMD的主要優(yōu)勢(shì)型別,但有研究表明,CV-A10與EV71相似,其感染導(dǎo)致重癥和死亡的頻率相對(duì)較高[26]。根據(jù)CV-A10的VP1基因序列,將CV-A10分為A~D 4個(gè)基因型,目前國(guó)內(nèi)主要流行從B型和C型亞型逐漸轉(zhuǎn)為D型亞型[26-27]。對(duì)2012—2018年長(zhǎng)春市10株CVA10病原株VP1區(qū)的進(jìn)化分析結(jié)果顯示,與CV-A10原型株的同源性為76.3%~77.0%,與B亞型參考株的同源性為78.9%~80.3%,與C亞型參考株的同源性為82.9%~83.8%,與D1亞型參考株的同源性為94.1%~95.4%,與D2亞型參考株的同源性為96.4%~98.4%,與D3亞型參考株的同源性為94.6%~96.1%,其中與D2亞型同源性較高,各株間同源性為96.4%~100.0%。表明長(zhǎng)春市2012—2018年CV-A10毒株為D2亞型,與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)主要流行的型別相同[28],較為穩(wěn)定。

    目前,非EV-A71型腸道病毒引起的HFMD疫情日益加重,而對(duì)其研究相對(duì)較少,疫苗研發(fā)基礎(chǔ)薄弱,研發(fā)難度大[29]。只有通過(guò)加強(qiáng)對(duì)HFMD病毒株的進(jìn)一步研究,掌握病毒變異及進(jìn)化狀態(tài),才能控制HFMD的流行。本研究通過(guò)對(duì)2012—2018年長(zhǎng)春市非EV-A71毒株進(jìn)行分析,探討其傳播規(guī)律和進(jìn)化情況,對(duì)疾病防控具有重要意義。

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