新型冠狀病毒感染者6個(gè)月后抗體滴度分析

張卉，王文輝，盧佳，林鳳杰，劉漫，劉璋，萬(wàn)鑫，郭靖，段凱，李新國(guó)

1.硚口區(qū)疾病預(yù)防控制中心，湖北 武漢430035；2.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北 武漢430207；3.國(guó)家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430207；4.湖北省疾病預(yù)防控制中心，湖北武漢430079；5.湖北省大悟縣疾病預(yù)防控制中心，湖北孝感432800

WHO公布數(shù)據(jù)顯示，截至2021年10月10日，全球新型冠狀病毒肺炎（Ccoronavirus Disease 2019，COVID-19）累計(jì)確診病例達(dá)236 599 025例，其中死亡病例4 831 486例［1］。COVID-19康復(fù)者抗嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndromecoronavirus 2，SARS-CoV-2）抗體持久性仍是科學(xué)家關(guān)心的問(wèn)題。有研究者認(rèn)為，SARS-CoV-2感染者體內(nèi)誘導(dǎo)的體液免疫可能不會(huì)持久，無(wú)癥狀或癥狀輕微的個(gè)體可能會(huì)再次感染SARS-CoV-2［2-6］。本文對(duì)湖北省大悟縣166例經(jīng)醫(yī)院確診和疑似COVID-19患者康復(fù)出院6個(gè)月后抗SARS-CoV-2特異性IgG抗體及中和抗體滴度（EC50）進(jìn)行分析，同時(shí)也對(duì)抗體陽(yáng)性率及抗體持續(xù)時(shí)間進(jìn)行初步分析。

1 材料與方法

1.1倫理及生物安全聲明 根據(jù)湖北省疾病預(yù)防控制中心（湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院）倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)的方案收集樣本（批準(zhǔn)編號(hào)：2020-068-02）。獲得所有參與者簽字的知情同意書。所有涉及SARSCoV-2的實(shí)驗(yàn)均在在中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所生物安全3級(jí)（BSL3）實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

1.2樣本 于2020年9月由湖北省大悟縣疾病預(yù)防控制中心采集大悟縣166名疑似和確診COVID-19患者康復(fù)出院6個(gè)月后血清樣本，-20℃下運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室并在檢測(cè)前均冷凍保存。病例的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》，無(wú)癥狀感染者被定義為在觀察期間體溫＜37.5℃、核酸檢測(cè)陽(yáng)性、且無(wú)任何體征或癥狀（如無(wú)主觀發(fā)熱、肌痛、流鼻涕、喉嚨痛、咳嗽、咳痰或胸部不適等）的感染者。

1.3細(xì)胞及疫苗原液 Vero細(xì)胞及新型冠狀病毒疫苗原液（批號(hào)：202010Y002）均由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司提供。Vero細(xì)胞用含10%小牛血清的杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)。

1.4主要試劑 參考品由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：SR20200304；小牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司，批號(hào)：18070103；DMEM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：1953159；HRP標(biāo)記的兔抗人酶標(biāo)抗體由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司提供。

1.5抗S A R S-C o V-2中和抗體滴度的檢測(cè) 采用蝕斑減少中和試驗(yàn)（plaque reduction eutralization test，PRNT）。將待檢血清4倍系列稀釋（1∶20~1∶5 120），在待檢樣品及參考品中加入600 PFU/mL的攻擊病毒，0.3 mL/孔，37℃培養(yǎng)箱中和1 h；加至鋪滿單層Vero細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板中，0.5 m L/孔，37℃培養(yǎng)箱吸附1 h；棄上清，加入含0.9%甲基纖維素的DMEM維持培養(yǎng)基，1 mL/孔，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d；一旦斑塊形成并被肉眼確認(rèn)，室溫下用8%甲醛固定細(xì)胞60 min；6×亞甲藍(lán)溶液對(duì)細(xì)胞染色1 h以上。中和效價(jià)計(jì)算：首先計(jì)算空斑對(duì)照所有復(fù)孔出現(xiàn)的空斑數(shù)目的平均值（X）、待檢樣品每個(gè)稀釋度出現(xiàn)的空斑數(shù)目（M），1-M/X即為每個(gè)稀釋度樣品對(duì)中和用病毒的抑制效率。將數(shù)據(jù)輸入GraphPad Prism計(jì)算50%病毒抑制效率的血清稀釋度。中和抗體滴度（EC50）的計(jì)算需考慮梯度稀釋血清與攻擊病毒為等體積中和，中和效價(jià)為軟件GraphPad Prism計(jì)算出的50%病毒抑制效率的血清稀釋度乘以2之后取整數(shù)［7］。

1.6抗S A R S-C o V-2特異性IgG抗體滴度的檢測(cè)采用ELISA法。用滅活新型冠狀病毒疫苗原液（100 ng/100μL）包被96孔板，150μL/孔，4℃過(guò)夜；用含1%牛奶的PBS-T 37℃孵育1 h；將血清樣品用稀釋液（1%脫脂奶粉）稀釋至20倍后，加至微孔板，孔內(nèi)2倍系列稀釋，100μL/孔，每個(gè)稀釋度為單孔（1∶20~1∶2 560），設(shè)陰性對(duì)照、陽(yáng)性血清對(duì)照1孔，100μL/孔，置恒溫水浴箱37℃水浴1 h；洗滌液洗板5次，加入HRP標(biāo)記的兔抗人酶標(biāo)抗體（1∶20 000稀釋），100μL/孔，置恒溫水浴箱37℃水浴1 h；洗滌液洗板5次，按照先后順序分別加入A、B兩種顯色液，各50μL/孔，混勻，置37℃水浴避光顯色30 min；加入終止液，50μL/孔，450 nm/630 nm檢測(cè)A值。以A值0.15為Cut-off值，待檢樣品A值≥Cut-off值的最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)即為特異性IgG抗體滴度［7］。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism software version 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?？贵w滴度在所有統(tǒng)計(jì)過(guò)程之前均為對(duì)數(shù)變換，并被表示為幾何平均滴度（geometric mean titer，GMT）。EC50與特異性IgG抗體滴度間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。不同性別間陽(yáng)性率的差異、不同癥狀組間的差異采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1人群分布情況 共收集到166例自愿參與該研究的患者樣本，其中男性81例（48.8%），平均年齡為49.6歲；女性85例（51.2%），平均年齡為52.9歲；有癥狀確診病例101人，無(wú)癥狀確診病例9人，疑似病例56人。

2.2抗體 166份樣本的中和抗體及特異性IgG抗體滴度檢測(cè)結(jié)果顯示，抗體總陽(yáng)性率分別為68.7%和77.7%，其中有癥狀確診人群抗體總陽(yáng)性率分別為82.2%和90.1%；無(wú)癥狀確診人群抗體總陽(yáng)性率分別為66.7%和88.9%；疑似人群抗體總陽(yáng)性率分別為44.6%和53.6%。見(jiàn)表1。抗體GMT見(jiàn)表2。

表1 166例出院6個(gè)月COVID-19康復(fù)者血清中和抗體及IgG抗體陽(yáng)性率Tab.1 Positive rates of neutralizing antibody and IgGin 116 patients with COVID-19 6 months after discharge from hospital

表2 166例出院6個(gè)月COVID-19康復(fù)者血清抗體GMTTab.2 GMTs of antibody in sera of 166 recovered patients from COVID-19 6 months after discharge from hospital

2.3中和抗體與IgG抗體的相關(guān)性 中和抗體滴度與特異性IgG抗體滴度間的相關(guān)性為93.0%，兩者抗體檢測(cè)方法高度相關(guān)，見(jiàn)圖1。有癥狀確診病例和疑似病例不同性別間的抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，抗體值取對(duì)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，不同性別間的中和抗體和IgG抗體差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=166，P＞0.05）。有癥狀確診病例和無(wú)癥狀確診病例間的中和抗體和IgG抗體差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=10，P＞0.05），而有癥狀確診病例和疑似病例間的中和抗體和IgG抗體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=159，P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖1 中和抗體及特異性IgG抗體滴度間的相關(guān)性Fig.1 Relationship between titers of neutralizing antibody and specific IgG

圖2 中和抗體（A、C）與特異性IgG抗體（B、D）滴度的檢測(cè)Fig.2 Determination of titers of neutralizing antibody（A，C）and specific IgG（B，D）

3 討論

SARS-CoV-2感染者體液免疫維持時(shí)間的研究對(duì)于預(yù)測(cè)新冠病毒疫苗群體免疫和解釋血清流行病學(xué)數(shù)據(jù)至關(guān)重要。早期的一項(xiàng)研究表明，在感染早期抗體呈陽(yáng)性的無(wú)癥狀人群中，通過(guò)化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法檢測(cè)，60%患者在2~3個(gè)月內(nèi)抗體呈陽(yáng)性［8］。有多項(xiàng)研究證實(shí)，在感染SARS-CoV-2 8個(gè)月后，采用3種試劑檢測(cè)的抗體陽(yáng)性率仍然較高，甚至在無(wú)癥狀或輕度癥狀感染者中也仍然較高（69.0%~91.4%）［9-11］。一項(xiàng)對(duì)2020年4—12月武漢市人群的研究數(shù)據(jù)表明，6.9%人群具有SARS-CoV-2抗體；在抗體陽(yáng)性人群中，40%檢測(cè)出中和抗體且穩(wěn)定保持9個(gè)月，82%為無(wú)癥狀感染［12］。另有研究表明，SARS-CoV-2感染的輕癥患者的抗體滴度下降速度較中度臨床癥狀患者的抗體滴度下降更快，并在確診感染5個(gè)月后免疫力下降［13-15］。

本研究表明，無(wú)癥狀者確診病例抗SARS-CoV-2中和抗體及特異性IgG抗體總陽(yáng)性率分別為66.67%和88.89%，有癥狀確診病例分別為82.2%和90.1%。兩種方法檢測(cè)結(jié)果存在一定差異，可能是不同檢測(cè)方法的特性不同造成的。表明對(duì)相同的樣本，特異性IgG抗體較中和抗體檢出敏感性更高。本研究無(wú)研究對(duì)象感染期間的血清樣本，僅收集出院6個(gè)月后樣本，因此，無(wú)法準(zhǔn)確獲得COVID-19患者6個(gè)月內(nèi)抗體的動(dòng)態(tài)變化情況。

至目前為止，我們對(duì)預(yù)防SARS-CoV-2的免疫相關(guān)性了解較少，這對(duì)受感染患者的長(zhǎng)期隨訪及新型冠狀病毒疫苗的臨床研究均很重要，同時(shí)也無(wú)法評(píng)估COVID-19康復(fù)者再次暴露或再次感染的可能性。綜上所述，用兩種抗體檢測(cè)方法均可在大多數(shù)確診為有癥狀或無(wú)癥狀人群感染后6個(gè)月的體內(nèi)檢測(cè)到抗SARS-CoV-2抗體，表明SARS-CoV-2感染者體液免疫至少可持續(xù)6個(gè)月。

志謝國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃2019-nCOV滅活疫苗2020YFC0-842100和湖北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃2019-nCoV滅活疫苗關(guān)鍵技術(shù)研究KTSI1800083A提供經(jīng)費(fèi)支持