鴉蔥提取液對(duì)水痘-帶狀皰疹病毒體外增殖作用的影響

周瑩，張夫坤，孫躍秋，王夢(mèng)涵，袁琳，秦臻，岳瑋，顧建陽，沈德新

1.長(zhǎng)春祈健生物制品有限責(zé)任公司，吉林長(zhǎng)春 130000；

2.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八八醫(yī)院兒科，河南鄭州 450042

水痘-帶狀皰疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）是帶狀皰疹（herpes zoster，HZ）的病原體。HZ癥狀為單側(cè)皮膚簇集皰疹，常伴有劇烈的神經(jīng)病理性疼痛，易遺留頑固的后遺神經(jīng)痛。HZ及后遺神經(jīng)痛發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)［1］，且可反復(fù)發(fā)作，持續(xù)期長(zhǎng)，并發(fā)癥增多，嚴(yán)重影響患者的身心健康、勞動(dòng)能力及生活品質(zhì)。至今，臨床上尚無安全有效的特異性治療方法。

鴉蔥（Scorzonera albicaulis Wild）屬菊科鴉蔥屬，多年生草本植物，具有清熱解毒、消腫散結(jié)的功效［2］。鴉蔥中含有豐富的抗病毒活性成分，如黃酮類化合物、酚酸類（咖啡酸及其衍生物）、倍半萜及其苷類、三萜及三萜苷類、香豆素等［3-5］。有研究表明，鴉蔥鮮品白汁外敷可治療HZ，使疼痛明顯減輕，皮損消退65%以上，但作用機(jī)制尚未明確［2］。本實(shí)驗(yàn)通過水煎煮法制備鴉蔥提取液，探討其對(duì)VZV體外增殖的影響，以期為鴉蔥用于HZ的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、毒株及質(zhì)粒 人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞2BS株（2BS細(xì)胞）、VZV（病毒滴度為5.2 lgPFU/mL）及重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（ORF62）均由長(zhǎng)春祈健生物制品有限公司提供。

1.2鴉蔥 鴉蔥全草采自河南省駐馬店泌陽縣種植基地，由河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院董誠明教授鑒定為華北鴉蔥（Scorzonera albicaulis Bunge），曬干，備用。

1.3主要試劑 MEM培養(yǎng)液購自日本日水制藥株式會(huì)社；新生牛血清購自山西潤(rùn)生大業(yè)生物材料有限公司；CCK8試劑盒（貨號(hào)：C0038）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；病毒DNA提取試劑盒（貨號(hào)：Er201-01）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Premix Ex TaqTM（ProbeqPCR，貨號(hào)：RR390A）購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.4鴉蔥提取液的制備

1.4.1鴉蔥原液的制備 取500 g鴉蔥鮮葉洗凈曬干，截小段，勻漿破碎，得鮮汁200 mL，依次用脫脂棉和紗布將鮮汁過濾芯2次，經(jīng)150 mm定性濾紙過濾約12 h；過濾液經(jīng)9 168×g離心10 min，取上清，依次經(jīng)0.45和0.22μm微孔濾膜過濾，制備為鴉蔥原液，濃縮至1.4 g/mL，分裝小瓶，于115℃滅菌30 min；冷藏備用。

1.4.2鴉蔥水提液的制備 取30 g鴉蔥全草干燥品，截小段，用8.5倍水浸泡0.5 h；于800℃煮沸，400℃穩(wěn)火煎煮40 min；去渣，經(jīng)脫脂棉-定性濾紙-離心-砂芯過濾（同1.4.1項(xiàng)），制備為鴉蔥水提液，濃縮至0.12 g/mL，分裝小瓶，115℃滅菌30 min；冷藏備用。

1.5細(xì)胞培養(yǎng) 將2BS細(xì)胞用含10%新生牛血清的MEM培養(yǎng)液（含1%雙抗、1%谷氨酰胺和3%碳酸氫鈉），于37℃進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.6細(xì)胞毒性試驗(yàn) 將2BS細(xì)胞按5×105個(gè)/mL的濃度接種至96孔板，于37℃培養(yǎng)過夜；分別加入不同濃度的鴉蔥提取液（18.75、37.5、75、150、300、600、1 200、2 400和4 800μg/mL），同時(shí)設(shè)空白孔（僅加入MEM培養(yǎng)液）及對(duì)照孔（加入2BS細(xì)胞及MEM培養(yǎng)液），于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d；棄上清，每孔加入10μL CCK8溶液和90μL MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h；用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450，并按下式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)孔A450-空白孔A450）/（對(duì)照孔A450-空白孔A450）×100%

1.7鴉蔥提取液對(duì)V Z V體外增殖影響的檢測(cè) 用含2%新生牛血清的MEM培養(yǎng)液將鴉蔥原液配制成200、100和50μg/mL 3個(gè)濃度，將鴉蔥水提液配制成50、25和5μg/mL 3個(gè)濃度。將2BS細(xì)胞按2×106個(gè)/mL的濃度接種至24孔板，37℃培養(yǎng)過夜；加入VZV，200μL/孔，37℃吸附1 h；棄培養(yǎng)液，加入含2%新生牛血清的MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于2、4、6、8 h加入不同濃度的鴉蔥原液和鴉蔥水提液，每個(gè)濃度均設(shè)3孔，同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照（僅加病毒，不加鴉蔥原液和鴉蔥提取液），置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，觀察并計(jì)數(shù)。選擇抑制率較好的藥物濃度和給藥時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果進(jìn)行拍照，隨機(jī)選取6個(gè)噬斑，24孔板的孔直徑為14.0 mm，采用Oplenic 10.1軟件對(duì)噬斑面積進(jìn)行測(cè)量計(jì)算。

1.8鴉蔥提取液對(duì)V Z V培養(yǎng)過程中病毒載量影響的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。qPCR擴(kuò)增上游引物（ORF62）：5′-TCTCGACTGGCTGGGACTTG-3′，下游引物（ORF62）：5′-CGCCGCGCGCTCTCTTT-3′，探針：5′-HEX-CGTAAACGATCATCCGGTGGACACACATAMRA-3′［6］，引物及探針由吉林省庫美生物科技有限公司合成。將2BS細(xì)胞以8×106個(gè)/mL濃度接種至6孔板，用含2%新生牛血清的MEM培養(yǎng)液將鴉蔥原液及鴉蔥水提液分別配制成200和50μg/mL，按1.7項(xiàng)中的方式加入VZV（0.1 mL，396.22 PFU/mL）和鴉蔥提取液，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照組（僅加VZV病毒，不加鴉蔥原液和鴉蔥提取液），置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d；收集細(xì)胞，經(jīng)-70℃凍融破碎后，92×g離心10 min，收集病毒，采用病毒DNA提取試劑盒提取病毒DNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：Premix Ex Taq（Probe qPCR）10μL，上下游引物各0.4μL，Probe0.8μL，模板2μL，ddH2O補(bǔ)足至20μL。PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，共40個(gè)循環(huán)。以重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（108copies/μL）作為VZV qPCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算病毒載量［7］。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、制作圖表及統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量值均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用Kruskal-Wallis-t檢驗(yàn)，均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞毒性試驗(yàn) 鴉蔥原液和鴉蔥水提液的半數(shù)毒性濃度（TC50）分別為501.9和239.1μg/mL，鴉蔥原液和水提液濃度分別為200和75μg/mL時(shí)，其細(xì)胞存活率均達(dá)80%以上，表明鴉蔥原液和水提液分別在200和75μg/mL濃度以下時(shí)對(duì)2BS細(xì)胞毒性較小。見圖1。

圖1 鴉蔥原液（A）和水提液（B）的半數(shù)毒性濃度Fig.1 TC50 of bulk（A）and extract（B）of Scorzonera albicaulis Bunge

2.2鴉蔥提取液對(duì)V Z V體外增殖的影響

2.2.12BS細(xì)胞形成的噬斑數(shù) 50、100和200μg/mL濃度的鴉蔥原液均能抑制VZV增殖，且呈濃度依賴性，VZV感染2 h后加入200μg/mL的鴉蔥原液對(duì)VZV增殖影響最明顯（t=10.41，P<0.01），其抑制率可達(dá)90%以上。50和25μg/mL的鴉蔥水提液可抑制VZV增殖，在VZV感染后2 h加入50μg/mL的鴉蔥水提液對(duì)VZV增殖影響最明顯（t=12.14，P<0.01），其抑制率可達(dá)75%以上。見圖2。上述結(jié)果表明，鴉蔥原液和鴉蔥水提液均可有效抑制VZV增殖，在感染后2 h給藥的抑制效果最佳。

圖2 鴉蔥原液（A）及鴉蔥水提液（B）對(duì)VZV在2BS細(xì)胞上產(chǎn)生噬斑數(shù)量的影響Fig.2 Effect of bulk（A）and extract（B）of Scorzonera albicaulis Bunge on count of plaques on 2BScells infected with VZV

2.2.22BS細(xì)胞形成的噬斑面積 根據(jù)2.2.1項(xiàng)結(jié)果，選擇200μg/mL鴉蔥原液2h給藥、50μg/mL鴉蔥水提液2 h給藥及病毒對(duì)照的結(jié)果進(jìn)行拍照，計(jì)算VZV在2BS細(xì)胞形成的噬斑面積。鴉蔥原液組、鴉蔥水提液組及病毒對(duì)照組噬斑面積分別為（0.42±0.21）、（0.95±0.32）和為（1.62±0.47）mm2，鴉蔥原液組和鴉蔥水提液組噬斑面積明顯小于病毒對(duì)照組（t分別為5.710和5.710，P分別＜0.001和＜0.05）。見圖3。

圖3 各組2BS細(xì)胞形成噬斑Fig.3 Plaques formed on 2BScells in various groups

2.3鴉蔥提取液對(duì)病毒載量的影響 鴉蔥原液和鴉蔥水提液均可抑制VZV的病毒數(shù)量，病毒載量明顯低于病毒對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為4.343和2.437，P分別＜0.01和＜0.05）。在VZV感染2 h時(shí)給藥的病毒載量最低，與2.1項(xiàng)結(jié)果相符，見表1。

表1 各組2BS細(xì)胞于不同時(shí)間點(diǎn)的病毒載量（log10 copies/μL，±s，n=3）Tab.1 Virus loads of 2BS cells in various groups at various time points（log10 copies/μL，±s，n=3）

表1 各組2BS細(xì)胞于不同時(shí)間點(diǎn)的病毒載量（log10 copies/μL，±s，n=3）Tab.1 Virus loads of 2BS cells in various groups at various time points（log10 copies/μL，±s，n=3）

注：與病毒對(duì)照組比較，a表示P＜0.05，aa表示P＜0.01。

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3 討論

我國(guó)中藥藥材種類繁多，多種中草藥提取物均具有良好的抗病毒活性［6，8-12］。新鮮鴉蔥白汁外敷可治療HZ，應(yīng)用前景廣泛。

病毒的生命周期包括吸附、穿入、脫殼、生物合成及裝配分泌等不同階段，每個(gè)階段均是潛在的藥物靶點(diǎn)。以阿昔洛韋為代表的抗皰疹西藥抑制病毒DNA的復(fù)制和合成，藥物靶點(diǎn)為病毒DNA聚合酶。而鴉蔥含有多種抗病毒活性成分較多，其中黃酮類可影響皰疹病毒的吸附、進(jìn)入、復(fù)制、病毒蛋白翻譯、病毒衣殼糖蛋白的形成及病毒的釋放等多個(gè)過程［13］；酚酸類阻止病毒蛋白與宿主細(xì)胞表面的吸附從而阻礙病毒進(jìn)入細(xì)胞［13］；三萜及其苷類能強(qiáng)烈抑制VZV吸附宿主細(xì)胞［14］；醌類化合物可持續(xù)提供自由基，與親核氨基酸形成不可逆結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的正常功能［15］；多糖類-硬葡聚糖多糖能夠阻止病毒與細(xì)胞質(zhì)膜復(fù)雜的相互作用［16］。

本實(shí)驗(yàn)通過噬斑形成和qPCR試驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度的鴉蔥原液、鴉蔥水提液均可抑制VZV在2BS細(xì)胞中的增殖，可直接破壞VZV感染2BS細(xì)胞的能力，表明鴉蔥具有良好的抗VZV活性，在細(xì)胞水平多環(huán)節(jié)中起到抑制效果，但具體的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究，同時(shí)需開展模式動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體內(nèi)效果驗(yàn)證。另外，本實(shí)驗(yàn)使用的鴉蔥原液及鴉蔥水提液僅為粗提物質(zhì)，需進(jìn)一步精細(xì)分離提取有效成分，進(jìn)行更深入的研究，以期篩選出低毒性、高藥效、新靶點(diǎn)的抗病毒中藥成分。