1株草地貪夜蛾寄生真菌的分離鑒定及活性測試

何俊烺 何景超 華宏偉 周易 程東美

摘要：為探明在玉米地被真菌感染的草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）幼蟲的致病菌種，豐富草地貪夜蛾病原真菌資源，為草地貪夜蛾生物防治研究以及生防菌劑的開發(fā)利用提供材料，對采集到的草地貪夜蛾僵蟲體進行常規(guī)分離純化，通過形態(tài)學和核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)間（ITS-rDNA）序列分析對分離得到的病原真菌進行鑒定，并采用浸蟲法研究病原真菌對2齡草地貪夜蛾幼蟲的室內(nèi)活性。經(jīng)鑒定，從感病的草地貪夜蛾幼蟲上分離獲得的病原真菌菌株ZHKUMR1為萊氏綠僵菌（Metarhizium rileyi）。菌株ZHKUMR1接種草地貪夜蛾2齡蟲后，幼蟲的致死中濃度（LC50）為4.24×105 CFU/mL，最適致病濃度為5×108 CFU/mL，接菌9 d后幼蟲半數(shù)致死時間（LT50）為4.39 d，累計校正死亡率達97.62%。自玉米地采集的草地貪夜蛾幼蟲上分離得到的病原真菌為萊氏綠僵菌，該菌株對草地貪夜蛾幼蟲具有高致病性，可作為對草地貪夜蛾的生防菌劑開發(fā)應用。

關(guān)鍵詞：草地貪夜蛾;病原真菌;萊氏綠僵菌;致病力

中圖分類號：S476.12 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）08-0032-05

草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）別稱秋黏蟲，是一種原產(chǎn)于美洲的跨境遷飛性重大害蟲，具有寄主范圍廣、繁殖能力強、遷飛擴散快、危害程度重和防控難度大等特點[1]。2019年1月，草地貪夜蛾首次入侵我國云南省，憑借極強的長距離遷飛能力迅速擴散至西南、華南、江南、長江中下游、黃淮、西北、華北等廣大地區(qū)為害，累計發(fā)生面積達108萬hm2，成為我國玉米上重大突發(fā)性、暴食性害蟲，對我國糧食生產(chǎn)安全構(gòu)成長期性威脅[2]。預計2021年將在西南、華南、長江中下游和江淮地區(qū)呈重發(fā)態(tài)勢，須重點防控，西北、黃淮、華北和東北須加強防范，全國發(fā)生面積可能達133.33萬hm2以上，防治面積200萬hm2次以上[3]。在草地貪夜蛾侵入我國后，化學防治在控制草地貪夜蛾的暴發(fā)危害、減緩其快速傳播、減輕玉米受害和保障糧食安全等方面發(fā)揮了重要作用[4]，是當前的主要防控手段。除化學防治外，生產(chǎn)上還可采用生物防治、理化誘控、生態(tài)調(diào)控等綜合措施進行防控。昆蟲病原真菌是生物農(nóng)藥的重要組成部分，對多種重要農(nóng)、林害蟲具有較好的防治效果，同時在減少化學農(nóng)藥使用量、減緩害蟲抗藥性和保護生態(tài)環(huán)境方面發(fā)揮著重要作用，球孢白僵菌和金龜子綠僵菌是研究應用最廣的種類，也是防治草地貪夜蛾的推薦藥劑，也是我國最早獲批登記的草地貪夜蛾防治藥劑。Cruz-Avalos 等通過比較分離得到的14種真菌對草地貪夜蛾卵和幼蟲的致病力發(fā)現(xiàn)，金龜子綠僵菌對草地貪夜蛾卵和幼蟲的致病率均為100%，球孢白僵菌引起的卵致病率最高可達到92%，引起的幼蟲死亡率最高為75%[5]。

萊氏綠僵菌（Metarhizium rileyi）是對鱗翅目幼蟲極具生防潛能的蟲生真菌，在適宜的環(huán)境條件下能引起害蟲的病害流行，有效地防治害蟲[6-7]，是重要的昆蟲病原真菌。Ruiz-Nájera等在墨西哥調(diào)查發(fā)現(xiàn)，萊氏綠僵菌可侵染草地貪夜蛾3～6齡幼蟲，對3齡幼蟲的侵染率最高[8]。草地貪夜蛾入侵我國云南省后，鄭亞強等從當?shù)馗腥居紫x上分離獲得了高活性的萊氏綠僵菌菌株ZYSP190701，以1×108 CFU/mL 濃度處理3齡幼蟲，7 d后的死亡率達100%[9]。雷妍圓等從廣州分離的萊氏綠僵菌菌株對草地貪夜蛾2齡幼蟲表現(xiàn)出較強的致病力[10]。本研究對從廣州市從化區(qū)玉米田采集的草地貪夜蛾僵蟲進行了致病菌的分離培養(yǎng)和種類鑒定，并測試了對草地貪夜蛾幼蟲的致病力。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)

草地貪夜蛾幼蟲由華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)藥學系徐漢虹團隊提供，并以人工飼料飼養(yǎng)至化蛹，待羽化產(chǎn)卵后作為實驗室供試蟲源。室內(nèi)飼養(yǎng)條件為溫度（28±1） ℃，相對濕度70%～90%，光—暗周期為16 h—8 h。

1.2 僵蟲采集及致病菌分離培養(yǎng)

于2019年12月自廣州從化地區(qū)玉米植株上采集草地貪夜蛾幼蟲僵蟲4頭，1頭綠色，3頭白色。發(fā)現(xiàn)僵蟲后，把僵蟲保存于指形管，每管1頭，以脫脂綿塞住瓶口，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

用接種環(huán)挑取蟲體上少量孢子，采用劃線法將孢子接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，于（25±1） ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出絨毛狀菌絲后，切新生菌絲轉(zhuǎn)移到水瓊脂（WA）培養(yǎng)基，生長 1 d 后，用小手術(shù)刀挑取單根菌絲接在新麥芽糖沙氏培養(yǎng)基（SMAY）培養(yǎng)基上。純化的菌株采用SMAY斜面培養(yǎng)基于4 ℃冰箱保存。由4頭僵蟲分離純化獲得4株真菌，經(jīng)形態(tài)學初步鑒定，每一株真菌都具有十分相似的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)，將其視為同一種菌，并命名為ZHKUMR1。

1.3 菌落培養(yǎng)及形態(tài)觀察

將分離并純化得到的菌株分別接于SMAY培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上，置于（25±1） ℃、光—暗周期為16 h—8 h的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～14 d，待菌落表面有孢子粉，記錄菌落特征及其直徑[11]。采用ICC50W光學顯微鏡（德國徠卡公司）觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子形態(tài)等顯微結(jié)構(gòu)，S-3000N掃描電鏡（日本日立公司）觀察超微結(jié)構(gòu)。

1.4 菌株的毒力測定

ZHKUMR1菌株以SMAY培養(yǎng)基培養(yǎng)至產(chǎn)生大量橄欖色孢子后，用0.2%吐溫-80無菌水配制成6個濃度的孢子懸浮液（1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108 CFU/mL ），用浸蟲法進行毒力測定。將大小一致、健康的草地貪夜蛾2齡幼蟲在供試孢子懸浮液中浸漬5 s后取出，置于濾紙上吸取多余水分，移至6孔細胞培養(yǎng)板以人工飼料飼養(yǎng)。從處理1 d后開始，連續(xù)觀察9 d，將死亡幼蟲移出，在（25±1） ℃、光—暗周期為16 h—8 h、相對濕度為85%條件下保濕培養(yǎng)，根據(jù)蟲體是否長出目的菌確定各幼蟲的死亡原因。每個處理重復3次，每次重復20頭蟲。

1.5 菌株的分子鑒定

DNA提取采用螯合樹脂Chelex-100提取法[12]。挑取少量菌絲于裝有10 L質(zhì)量濃度為10%螯合樹脂的指型管中，9 000 r/min振蕩離心5 min，95 ℃水浴加熱5 min，反復3次完成粗提DNA，取上清液備用。PCR反應體系：DNA模板1 μL、引物ITS1和ITS4 各1 μL、Taq PCR mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。用質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物由廣州天一輝遠基因科技有限公司測序。

對分離獲得菌株ITS-rDNA測序結(jié)果進行優(yōu)化，提交到NCBI 網(wǎng)站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行比對。下載與目的菌株具有同源性的多個菌株及其相關(guān)近緣屬菌株的相應序列，使用MEGA 7.0鄰接法（neighbor-joining method，簡稱NJ），應用最大似然法，運行1 000次自助法（bootstrap ）驗證，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合菌株形態(tài)生物學特征，確定菌株的系統(tǒng)分類地位。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2019整理后，使用DPS7.05進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計各處理幼蟲的累計死亡率和累計校正死亡率，并對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。使用SPSS 26.0進行回歸方程、半數(shù)致死時間（LT50）、致死中濃度（LC50）及相關(guān)系數(shù)的統(tǒng)計分析。累計死亡率=處理死亡總蟲數(shù)/處理總蟲數(shù)×100%;累計校正死亡率=（處理累計死亡率-對照累計死亡率）/（1-對照累計死亡率）×100%[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼蟲感染癥狀

從玉米卷葉中發(fā)現(xiàn)的自然感染寄生真菌的草地貪夜蛾幼蟲，感菌蟲體早期被白色菌絲包裹（圖1-a），中后期呈淡綠色，體表有大量橄欖綠色孢子粉（圖1-b）。將菌株ZHKUMR1分離純化培養(yǎng)14 d，菌落產(chǎn)生的孢子粉制備成孢子懸浮液，濃度為1×108 CFU/mL，接種到體型一致、健康的2齡草地貪夜蛾幼蟲上。接菌2 d后，幼蟲行動不活躍;4 d 后部分幼蟲死亡，蟲體顏色暗沉，變硬，7 d后蟲體長出白色菌絲（圖1-c）;接菌25 d后，蟲體干癟，蟲體外表有纖細菌絲和孢子粉包裹，孢子粉呈橄欖綠色（圖1-d）。

2.2 菌株ZHKUMR1的形態(tài)鑒定

PDA培養(yǎng)基（圖1-e至圖1-f）和SMAY培養(yǎng)基（圖1-g至圖1-h）的菌株均能正常生長，形態(tài)特征相似，菌落直徑、初產(chǎn)孢時間及產(chǎn)孢量有明顯差異。在PDA培養(yǎng)基上，菌落正面乳白色，呈棉絮狀凸起，背面淡黃棕色，培養(yǎng)20 d時的菌落直徑為（36.63±0.22） mm，表面中心至邊緣1/2處有環(huán)狀凹陷，邊緣菌絲呈輻射狀分布;在SMAY培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌落平均直徑為（43.6±0.42） mm，正面大部分覆蓋橄欖色孢子，近正圓形，菌落外緣為白色，邊緣平整，背面為淡黃棕色和白色，界線分明。顯微結(jié)果顯示，菌絲光滑，有分隔，分生孢子梗著生在營養(yǎng)菌絲上，直徑為1.3～1.5 μm，分生孢子梗上形成濃密的孢梗簇，其上著生4～5個瓶梗，圓柱形，基部較為膨大，頂部尖細;分生孢子成橄欖球狀，長橢圓形，外表光滑，大小為（2.9～3.3） μm×（1.8～2.7） μm。

2.3 分子生物學鑒定結(jié)果

利用引物對目的菌株的ITS-rDNA進行PCR擴增，獲得1條595 bp擴增片段（圖2），將該序列（登錄號：MZ151847）在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中的M. rileyi strain NIPHM MRF-1菌株同源性為100%。將其在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對得到的序列，上傳至MEGA 7.0構(gòu)建發(fā)育樹（圖3），結(jié)果表明，菌株ZHKUMR1與數(shù)據(jù)庫中其他萊氏綠僵菌菌株聚為一大支，與MK697304親緣關(guān)系最為相近。綜合形態(tài)學鑒定和ITS序列相似性分析，鑒定此菌株ZHKUMR1為萊氏綠僵菌（M. rileyi）。

2.4 菌株ZHKUMR1對草地貪夜蛾幼蟲的毒力

萊氏綠僵菌菌株ZHKUMR1對草地貪夜蛾2齡幼蟲有較強的致病力，處理3 d后幼蟲出現(xiàn)死亡，死亡率隨孢子懸浮液濃度升高和處理時間的增加而增加，處理3～5 d草地貪夜蛾幼蟲死亡率快速上升（圖4）。處理9d后，不同濃度的孢子懸浮液對草地貪夜蛾幼蟲均有致病力，濃度為5×108 CFU/mL的孢子懸浮液對草地貪夜蛾幼蟲毒力最強，累計死亡率和校正死亡率分別為98.33%、97.62%，且LT50最短，為4.39 d（表1）;9 d后菌株ZHKUMR1對草地貪夜蛾幼蟲LC50為4.24×105 CFU/mL。綜上所述，萊氏綠僵菌菌株ZHKUMR1的孢子懸浮液對草地貪夜蛾幼蟲有較好的活性。

3 討論與結(jié)論

昆蟲病原真菌是指能夠直接侵入健康昆蟲體內(nèi)、迅速增殖和導致昆蟲死亡的真菌類群[9]。因其對環(huán)境友好，具有害蟲不易產(chǎn)生抗性、易流行，被認為是最有可能替代化學農(nóng)藥的下一代新型生物農(nóng)藥，且在草地貪夜蛾防治中具有很大的應用潛力[13-14]。本研究從玉米地田間采集的草地貪夜蛾僵蟲上分離得到1株病原真菌，經(jīng)形態(tài)學和生物分子學分析，鑒定該菌株為萊氏綠僵菌。菌株ZHKUMR1對2齡草地貪夜蛾幼蟲的致病力較強，在孢子懸浮液濃度為5×108 CFU/mL下，草地貪夜蛾的校正死亡率可達到97.62%，在4 d后出現(xiàn)半數(shù)試蟲死亡，表明萊氏綠僵菌對草地貪夜蛾低齡幼蟲具有較高的致死率，與鄭亞強等的結(jié)論[9-10]一致。雖然萊氏綠僵菌對草地貪夜蛾具有良好的生防潛力，但相對于其他昆蟲病原真菌，更容易受到環(huán)境因素的影響[15]，其產(chǎn)孢需要的營養(yǎng)條件較為嚴格[16-18]，加之真菌殺蟲劑相對于化學農(nóng)藥見效慢、生產(chǎn)效率低、成本高、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題，因此限制了該類菌劑的大規(guī)模生產(chǎn)[9]。然而，隨著真菌殺蟲劑的使用逐漸流行，真菌殺蟲劑有可能在大田作物蟲害綜合防治（IPM）中發(fā)揮作用，以實現(xiàn)有效和相對安全的害蟲管理。為了實現(xiàn)這一目標，須要采取積極的研究措施來改善它們在不良的環(huán)境條件下的性能，研制出具有持久性、更長的保質(zhì)期和易于應用的配方，以及使之具有更強的毒力和更廣的作用范圍[19]。一些研究表明，低毒、高效化學農(nóng)藥與諸如球孢白僵菌、金龜子綠僵菌等昆蟲病原真菌配合使用，能有效增強昆蟲病原真菌對草地貪夜蛾的侵染致病性，提高真菌在蟲體上的產(chǎn)孢量，并延緩化學農(nóng)藥對草地貪夜蛾的抗藥性，減少殺蟲劑對環(huán)境的影響[9，20]。本研究分離得到的萊氏綠僵菌菌株ZHKUMR1對草地貪夜蛾幼蟲在室內(nèi)適當?shù)脑囼灄l件下具有較強的致病力，證明其具有一定的生防潛力，但是在實際應用中是否能夠適應自然環(huán)境，從分離到應用在田間防治的過程中能否保持菌株毒力以及能否通過與化學藥劑的混配從而降低化學藥劑用藥量的同時提高對不同齡期草地貪夜蛾的防治效果，因此，開展真菌生物農(nóng)藥與化學農(nóng)藥混用技術(shù)研究，對減少化學農(nóng)藥的用藥量、保持菌株穩(wěn)定性以及降低害蟲對化學農(nóng)藥的抗藥性具有重要的價值。

參考文獻：

[1]吳孔明. 中國草地貪夜蛾的防控策略[J]. 植物保護，2020，46（2）：1-5.

[2]齊國君，蘇湘寧，章玉蘋，等. 草地貪夜蛾監(jiān)測預警與防控研究進展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2020，47（12）：109-121.

[3]梁寶忠. 預計2021年我國農(nóng)作物主要病蟲害仍維持重發(fā)態(tài)勢[J]. 中國食品，2020（23）：157-158.

[4]王登杰，任茂瓊，姜繼紅，等. 草地貪夜蛾綠色防控技術(shù)研究進展[J]. 植物保護，2020，46（1）：1-9.

[5]Cruz-Avalos A M，de los ngeles Bivián-Hernández M，Ibarra J E，et al. High virulence of Mexican entomopathogenic fungi against fall armyworm，（Lepidoptera：Noctuidae）[J]. Journal of Economic Entomology，2018，112（1）：99-107.

[6]杜廣祖，鄭亞強，蘇錦堯，等. 云南萊氏野村菌田間自然發(fā)生流行動態(tài)研究[J]. 環(huán)境昆蟲學報，2018，40（5）：1119-1127.

[7]Perinotto W M S，Terra A L M，Angelo I C，et al. Nomuraea rileyi as biological control agents of Rhipicephalus microplus tick[J]. Parasitology Research，2012，111（4）：1743-1748.

[8]Ruiz-Nájera R E，Ruiz-Estudillo R A，Sánchez-Yáez J M，et al. Occurrence of entomopathogenic fungi and parasitic Nematodes on Spodoptera frugiperda（Lepidoptera：Noctuidae） larvae collected in central Chiapas，México[J]. Florida Entomologist，2013，96（2）：498-503.

[9]鄭亞強，胡惠芬，付玉飛，等. 草地貪夜蛾萊氏綠僵菌的分離鑒定[J]. 植物保護，2019，45（5）：65-70.

[10]雷妍圓，王德森，薛志洪，等. 廣州地區(qū)一株綠僵菌的鑒定及其對草地貪夜蛾的致病力測定[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報，2020，51（6）：1265-1273.

[11]蒲蟄龍，李增智. 昆蟲真菌學[M]. 合肥：安徽科學技術(shù)出版社，1996.

[12]陳吉良，黃小龍，吳安迪，等. 一種快速高效提取病原真菌DNA作為PCR模板的方法[J]. 菌物學報，2011，30（1）：147-149.

[13]劉春來. 昆蟲病原真菌在農(nóng)林害蟲生物防治中的應用[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2017（3）：68-73.

[14]張 維，彭國雄，夏玉先. 昆蟲病原真菌防控草地貪夜蛾的現(xiàn)狀、問題與展望[J]. 中國生物防治學報，2019，35（5）：674-681.

[15]Grijalba E P，Espinel C，Cuartas P E，et al. Metarhizium rileyi biopesticide to control Spodoptera frugiperda：stability and insecticidal activity under glasshouse conditions[J]. Fungal Biology，2018，122（11）：1069-1076.

[16]Edelstein J D，Lecuona R E，Trumper E V.Selection of culture media and in vitro assessment of temperature-dependent development of Nomuraea rileyi[J]. Neotropical Entomology，2004，33（6）：737-742.

[17]楊新軍，林華峰，李茂業(yè)，等. 萊氏野村菌Nr05菌株的培養(yǎng)性狀及其對斜紋夜蛾的毒力[J]. 中國生物防治，2007，23（1）：44-48.

[18]劉守柱，劉雙雙，姜武玲，等. 外源糖類和維生素對萊氏綠僵菌Metarhizium rileyi孢子萌發(fā)的促進作用[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學，2020，52（3）：97-101.

[19]Um M，Galadima I，Gambo F，et al.A review on the use of entomopathogenic fungi in the management of insect pests of field crops[J]. Journal of Entomology and Zoology Studies，2018，6：27-32.

[20]Rivero-Borja M，Guzmán-Franco A W，Rodríguez-Leyva E，et al. Interaction of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae with chlorpyrifos ethyl and spinosad in Spodoptera frugiperda larvae[J]. Pest Management Science，2018，74（9）：2047-2052.