miR-21對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、凋亡及 PI3K/Akt 信號(hào)通路的影響

江秀玲 胡有根 彭建明 羅雪 蘇蘭娣 湯元杰

【摘要】目的：探討 miR-21對(duì)食管癌細(xì)胞增殖及凋亡影響與分子機(jī)制。方法：將食管癌細(xì)胞分成 miR-21- NC 組、miR-21組、LY294002組、LY294002+miR-21組、對(duì)照組5組，檢測(cè) miR-21表達(dá)情況及食管癌細(xì)胞系中 PI3K、Akt 與 p-Akt 表達(dá)情況。結(jié)果：食管癌細(xì)胞系的 miR-21相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常食管上皮細(xì)胞系（P<0.05）; miR-21組在 miR-21相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組、miR-21-NC 組（P<0.05）;在 Eca-109細(xì)胞增殖率上，結(jié)果顯示而 miR-21組的細(xì)胞增值率要遠(yuǎn)比對(duì)照組、miR-21-NC 組的指標(biāo)更高，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）; LY294002組在 Eca-109細(xì)胞增值率上比對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）; LY294002+miR-21組在 Eca-109細(xì)胞增值率上比 LY294002組明顯更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;miR-21組細(xì)胞中 PI3K、p-Akt 相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組， LY294002組 PI3K、p-Akt 相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論： miR-21可通過(guò)調(diào)節(jié) PI3K/Akt 信號(hào)通路，促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖及凋亡，為食管癌靶向治療提供一定理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】miR-21;食管癌;細(xì)胞增殖;凋亡; PI3K/Akt 信號(hào)通路

【中圖分類(lèi)號(hào)】R735.1【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-5249（2022）05-0015-03

食管癌現(xiàn)階段有著越來(lái)越高的發(fā)病率，該病隸屬食管腫瘤病變[1]。近年來(lái)隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，食管癌發(fā)病率雖然有所降低，經(jīng)手術(shù)及放化療治療提升療效，但是患者的預(yù)后仍舊比較差[2]。在分子生物技術(shù)發(fā)展背景下，醫(yī)學(xué)工作者積極尋求針對(duì)有效抑制食管癌細(xì)胞增殖及凋亡的治療靶點(diǎn)，目前根據(jù)相關(guān)研究得知，顯示微小RNA（microRNA）可引起食管癌的發(fā)生發(fā)展。 miR-21作為在食管癌病變組織、血清、唾液中高表達(dá)的物質(zhì)，可促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖及凋亡，并且在后續(xù)的相關(guān)研究中也顯示，miR-21對(duì) PI3K/Akt 信號(hào)通路也有一定的影響[3]，但是具體作用機(jī)制上尚且存在一些爭(zhēng)議，故本次研究就此進(jìn)行了具體的探討，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

試驗(yàn)材料為人正常食管上皮細(xì)胞系、食管癌細(xì)胞系。試劑與材料：培養(yǎng)基、培養(yǎng)板;抑制劑;反轉(zhuǎn)錄酶;鼠抗人磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）多克隆抗體;低溫高度離心機(jī)、熒光定量 PCR儀器;流式細(xì)胞儀; miR-21、miR-21- NC及引物序列。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

取正常食管上皮細(xì)胞系、食管癌細(xì)胞系，室溫下緩慢解凍，將解凍后的細(xì)胞系加胰蛋白酶，加入物質(zhì)后制備為細(xì)胞懸浮液，制成的懸浮液進(jìn)一步將其接種至培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的組成成分為10%胎牛血清+100mg/mL 鏈霉素+100 U/mL 青霉素，接種的培養(yǎng)基則是置入到培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱的環(huán)境控制為溫度37℃，5%CO2、濕度適宜。為了確保培養(yǎng)效果，培養(yǎng)基需要定時(shí)的更換，更換頻率為2 d一次，期間需要注意對(duì)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的基本情況檢查，當(dāng)發(fā)現(xiàn)瓶底的細(xì)胞數(shù)量繁殖至覆蓋瓶底85%的時(shí)候即可向其中加入胰蛋白酶做進(jìn)一步處理，具體是實(shí)施細(xì)胞培養(yǎng)及凍存處理。

1.2.2 miR-21表達(dá)水平檢測(cè)

取正常食管上皮細(xì)胞系、食管癌細(xì)胞系，提取細(xì)胞總 RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，獲得上下游備用的引物，對(duì)于上游引物涵蓋如下的序列：5-AGCTGTACAAGTAAGTTATCAAATCCTGCCTGACTG-3。下游引物則是涵蓋以下序列：5-GGGAGAG GGGCTTAGTCCTCCCTCCATACTGCTG3。經(jīng)最大二階導(dǎo)數(shù)法得出細(xì)胞中歐 miR-21相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)總體系為50μL，其中模板cDNA 為1μL，上下游引物含量均各自為2μL，混合液量為12μL，其中加無(wú)菌的蒸餾水到總量為50μL。反應(yīng)的條件主要是95℃溫度下持續(xù)5 min預(yù)變形處理，之后在67℃溫度下持續(xù)延伸15 s，維持連續(xù)40循環(huán)的反應(yīng)處理。

1.2.3對(duì)pre-miR-21、pre-miR-21-NC慢病毒載體的構(gòu)建方法

構(gòu)建上應(yīng)用方式，具體是通過(guò)TRIzolreagent的方式，將人食管癌細(xì)胞中Eca-109的RNA提取出來(lái)，之后就將提取出的RNA 反轉(zhuǎn)錄呈為cDNA。合成與食管癌細(xì)胞Eca-109嵌合miRNA 序列，將不能相匹配的 miR-21-NC序列用作陰性的對(duì)照指標(biāo)。 miR-21-NC 的引物主要是：5-GTT CTT GCTTCG GCA GAA CATATA CTA AAA TTG GAA CGA TAC AGA GAA GATTAG CAT GGC CCC TGC GCAAGG ATG ACA CGC? AAA ATC GTG AAG CGT TCCACA TTT TT-3。序列均是攜帶有FITC的標(biāo)識(shí)，這樣主要是方便對(duì)轉(zhuǎn)染的效率進(jìn)行鑒定。根據(jù)序列以擴(kuò)增miR-21，經(jīng)DNA 產(chǎn)物純化試劑盒做純化處理，借助T4 DNA 連接酶對(duì)miR-21序列、GV254序列、miR-21-NC序列做酶切處理及酶接處理，根據(jù)以上的處理，建構(gòu)慢病毒載體為備用。

1.2.4細(xì)胞分組及處理

獲取對(duì)數(shù)細(xì)胞便于后續(xù)接種處理，接種的部位為包括24孔的培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%的時(shí)候分成以下5組： miR-21-NC組（慢病毒載體pre-miR-21- NC 和 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染液轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、 miR-21組（慢病毒載體pre-miR-21和 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染液轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、LY294002組（75μmol / L LY294002培養(yǎng)細(xì)胞）、LY294002+miR-21組（75μmol / L LY294002培養(yǎng)細(xì)胞+慢病毒載體pre-miR-21轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、對(duì)照組（DMSO 培養(yǎng)細(xì)胞）。上述分組上為確保數(shù)據(jù)科學(xué)性，均是選擇9孔，給予各組相應(yīng)的細(xì)胞載體配合干預(yù)，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，選擇對(duì)應(yīng)樣品。針對(duì)對(duì)照組予以 DMSO 培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理上，均是持續(xù)進(jìn)行48h的培養(yǎng)，在48h 的培養(yǎng)結(jié)束后就可做清洗處理，經(jīng)過(guò)清洗的培養(yǎng)基經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定的為顏色綠色的熒光細(xì)胞，并且還要進(jìn)一步進(jìn)行處理，處理內(nèi)容為獲得最合適轉(zhuǎn)染濃度數(shù)值范圍，以此作為參照。

1.2.5 MTT試驗(yàn)測(cè)定Eca-109細(xì)胞增殖情況

培養(yǎng)時(shí)間已滿(mǎn)就可以去除培養(yǎng)板做接下操作，主要是將原培養(yǎng)基去掉，對(duì)每一孔均是向內(nèi)部加入 DMEM培養(yǎng)液100μL，在避光條件下加 MTT溶液10μL，將溶液放到合適的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱環(huán)境的溫度主要是37℃，其中涵蓋濃度為5%的 CO2，持續(xù)放置4 h將細(xì)胞培養(yǎng)板取出，對(duì)各孔添加的培養(yǎng)液清除完全，清除的各孔則予以150μL 的二甲基亞砜溶液充填到清除的各孔當(dāng)中，進(jìn)行持續(xù)振蕩處理，到其中紫色結(jié)晶完全的被溶解結(jié)束，利用酶標(biāo)儀在570 nm 波長(zhǎng)的范圍之間，對(duì)各個(gè)孔吸光度情況進(jìn)行精確測(cè)定。通過(guò)酶標(biāo)儀以570 nm 波長(zhǎng)范圍測(cè)定各孔吸光度情況，對(duì)測(cè)定情況記錄，并且以對(duì)照組細(xì)胞增殖100%對(duì)各組細(xì)胞增值率計(jì)算。

1.2.6檢測(cè)食管癌細(xì)胞系中PI3K、Akt與p-Akt表達(dá)情況

在食管癌細(xì)胞系內(nèi)，混合細(xì)胞裂解液，加入的量結(jié)合需求確定，經(jīng)裂解液的融合使得其中總蛋白泌出，對(duì)蛋白樣品做加熱以及煮沸處理，同時(shí)還做進(jìn)一步離心，獲取蛋白樣品，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)模后加入鼠抗人 PI3K、 Akt、p-Akt 多克隆抗體，充分混合置入大合適條件下存儲(chǔ)，具體在溫度4℃環(huán)境下過(guò)夜，之后則是置于 37℃溫度下1小時(shí)，其中混合發(fā)光液做顯影獲得所需影像信息，對(duì)灰度值測(cè)定，測(cè)定的方法主要是用軟件，進(jìn)行表達(dá)情況的觀察，主要觀察 PI3K、Akt、p-Akt 蛋白水平，最終結(jié)果通過(guò)多次測(cè)定結(jié)果平均值表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用（±s）表示，使用 t檢驗(yàn)。以 P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1正常食管上皮細(xì)胞系、食管癌細(xì)胞系中的miR-21相對(duì)表達(dá)量

miR-21表達(dá)情況上，同正常食管上皮細(xì)胞系進(jìn)行對(duì)比，食管癌細(xì)胞中的miR-21數(shù)值明顯更高，存在組間差異（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2各組食管癌細(xì)胞系miR-21相對(duì)表達(dá)量

miR-21-NC組、LY294002組與對(duì)照組在miR-21相對(duì)表達(dá)量上比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;miR-21組與LY294002+miR-21組在miR-21相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組、miR-21-NC 組與LY294002組（P<0.05），見(jiàn)表2。2.3 MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定人食管癌細(xì)胞Eca-109增殖情況MTT 的試驗(yàn)測(cè)定指標(biāo)上，表現(xiàn)為Eca-109細(xì)胞增值率上，對(duì)照組、 miR-21-NC 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;而miR-21組的細(xì)胞增值率要遠(yuǎn)比對(duì)照組、miR-21-NC組的指標(biāo)更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;LY294002組在Eca-109細(xì)胞增值率上比對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;LY294002+miR-21組在 Eca-109細(xì)胞增值率上比 LY294002組明顯更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3。

2.4各組食管癌細(xì)胞系PI3K、Akt、p-Akt表達(dá)情況

miR-21組細(xì)胞中PI3K、p-Akt表達(dá)水平均高于對(duì)照組， LY294002組PI3K、p-Akt表達(dá)水平要較對(duì)照組的水平更低（P<0.05），miR-21-NC 組、LY294002+miR-21組在PI3K、Akt、p-Akt表達(dá)水平上均與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）見(jiàn)表4。

3? 討論

食管癌主要分成食管鱗癌及食管腺癌，主要由亞硝酸鹽及遺傳等因素所致，近年來(lái)研究表明miR-21同食管癌發(fā)生發(fā)展、預(yù)后有緊密聯(lián)系[4-5]。張瑩等[6]的研究中，探討miR-21對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和凋亡影響及分子機(jī)制，在研究結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中P13K、p-Akt數(shù)值上，表現(xiàn)為L(zhǎng)Y294002+miR-21組要比于LY294002組明顯更高，這一結(jié)果主要是提示miR-21通過(guò)對(duì)P13K/Akt調(diào)節(jié)，引導(dǎo)信號(hào)的表達(dá)，這樣就為食管癌細(xì)胞大量增殖提供基礎(chǔ)，同時(shí)也對(duì)癌細(xì)胞凋亡進(jìn)行阻止，使得食管癌長(zhǎng)期存在。 miRNA作為一種內(nèi)源性調(diào)控因子，其中的一個(gè)重要成員就是miR-21，miR-21可見(jiàn)機(jī)體多個(gè)部位的表達(dá)，多個(gè)組織中均可見(jiàn)這一因子，該因子關(guān)系到機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分裂、組織分化等等，調(diào)節(jié)人體代謝。國(guó)內(nèi)外的研究中也已經(jīng)正式，對(duì)于食管癌的患者， miR-21參與細(xì)胞分裂、增殖以及凋亡的全程，但是具體關(guān)于參加增殖及凋亡的機(jī)制尚不明確[7-8]。在本研究中，顯示食管癌細(xì)胞系中，在miR-21表達(dá)上明顯較正常食管上皮細(xì)胞更高，提示在進(jìn)行食管癌的診斷上，臨床中可以將miR-21作為關(guān)鍵診斷靶點(diǎn)。分析原因主要是miR-21是引起食管癌增殖及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵通路，若miR-21表達(dá)量減少使得食管癌細(xì)胞也可發(fā)生凋亡，因此miR-21也是重要的治療靶點(diǎn)。

食管癌屬于多基因以及多因素引起的消化系統(tǒng)腫瘤疾病，關(guān)于疾病的病因尚且不明確，在相關(guān)的研究中，顯示食管癌的患者上調(diào)的miR-21的作用在于提供細(xì)胞增殖以及轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，此外也能對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡進(jìn)行有效抑制，屬于關(guān)鍵過(guò)程[9]。而被 miR-21作用的細(xì)胞則是Eca-109，顯示在食管癌細(xì)胞中 Eca-109的 miR-21表達(dá)值明顯降低，這樣可進(jìn)一步引起人食管癌細(xì)胞Eca-109凋亡[10]。本次研究的結(jié)果中，顯示經(jīng)慢病毒載體的構(gòu)建，在載體pre-miR-21上，能夠同時(shí)被轉(zhuǎn)染至食管癌細(xì)胞Eca-109，結(jié)果表明 LY294002組在 Eca-109細(xì)胞增值率上比對(duì)照組低， LY294002+miR-21組在 Eca-109細(xì)胞增值率上比 LY294002組明顯更高，根據(jù)這一結(jié)果，能夠發(fā)現(xiàn)miR-21是致癌的重要轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)，屬于食管癌持續(xù)增殖的關(guān)鍵，食管癌可在此基礎(chǔ)上持續(xù)發(fā)生及發(fā)展。

本次研究結(jié)果表明， miR-21組在miR-21相對(duì)表達(dá)量非常高，此外miR-21組的細(xì)胞內(nèi)PI3K、p-Akt 在相對(duì)的表達(dá)量指標(biāo)上明顯更低對(duì)照組表達(dá)量，表明miR-21在食管癌細(xì)胞的增殖及凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 PI3K/Akt 信號(hào)通路也是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵，在既往的研究中，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt 信號(hào)通路在一些常見(jiàn)疾病如卵巢癌、小腸癌等的組織部位呈現(xiàn)高表達(dá)情況，并且細(xì)胞活化明顯，起到的一個(gè)很重要的作用是誘導(dǎo)腫瘤增殖、侵襲以及凋亡[11]。在現(xiàn)有的研究中，結(jié)果顯示miR-21可調(diào)控多種靶基因物質(zhì)的表達(dá)，諸如PDCD4、PTEN、TIMP3、 PI3K、AKT等，其中PTEN 屬于PTEN/PI3K/Akt 信號(hào)通路重要的組成部分，關(guān)鍵性作用在于明顯的抑制患者腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路PI3K/P-Akt 表達(dá)，如此對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞增殖的價(jià)值突出，避免腫瘤轉(zhuǎn)移以及傾斜情況的發(fā)生[12]。而對(duì)于miR-21若是出現(xiàn)過(guò)表達(dá)情況，可增強(qiáng)PI3K/Akt 信號(hào)通路，這樣使得食管癌細(xì)胞也相應(yīng)的增殖及病變出現(xiàn)持續(xù)進(jìn)展。

綜上所述，在食管癌的發(fā)生發(fā)展中，關(guān)鍵機(jī)制在于miR-21通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路，如此為食管癌細(xì)胞發(fā)生及繁殖奠定基礎(chǔ)，并且還對(duì)細(xì)胞凋亡起到抑制的作用，如此提供給疾病治療重要靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2021-10-23）