基于近紅外顯微成像的豆粕和抗生素菌渣鑒別分析

楊增玲 林玉飛 梁 浩 李守學(xué)， 肖志明 樊 霞

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院， 北京 100083； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所， 北京 100081)

引言

目前，我國(guó)已經(jīng)成為世界上最大的抗生素生產(chǎn)國(guó)[1]。在抗生素生產(chǎn)過程中，大量抗生素菌渣(也稱藥渣、濾渣)隨之產(chǎn)生。抗生素菌渣中主要成分是微生物菌絲體、培養(yǎng)基殘?jiān)捌渌恍┪赐耆x利用的有機(jī)物，其粗蛋白含量較高[2-3]，基本接近常用的蛋白質(zhì)飼料原料[4]。20世紀(jì)90年代，國(guó)內(nèi)嘗試過將其進(jìn)行無害化處理后生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料，出現(xiàn)試圖直接利用抗生素菌渣作為飼料或飼料添加劑使用的現(xiàn)象[5-8]。但對(duì)于抗生素菌渣的利用，由于其未進(jìn)行充分的安全性評(píng)價(jià)，并存在誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)，因此所有種類抗生素濾渣在2002年被列入《禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥物品種目錄》[9]，2008年被列入《國(guó)家危險(xiǎn)廢物名錄》[10]。養(yǎng)殖過程使用含有抗生素菌渣的飼料具有以下潛在隱患：抗生素菌渣中含有殘留的抗生素，長(zhǎng)期飼喂動(dòng)物后造成抗生素在肉、蛋、奶等畜禽產(chǎn)品中殘留，誘發(fā)食品安全問題；抗生素菌渣中含有抗生素培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的未知成分中間產(chǎn)物，在沒有確定安全性之前，將其作為蛋白質(zhì)飼料原料應(yīng)用于飼料生產(chǎn)中存在潛在風(fēng)險(xiǎn)；長(zhǎng)期低劑量食用抗生素將會(huì)增加抗生素與動(dòng)物體內(nèi)細(xì)菌的接觸機(jī)會(huì)和時(shí)間，使細(xì)菌適應(yīng)了抗生素的環(huán)境，逐漸產(chǎn)生耐藥性。因此，研究飼料中抗生素菌渣的鑒別分析技術(shù)對(duì)于保障飼料安全、食品安全乃至人類健康具有重要意義。

由于抗生素菌渣中的主要成分含量與飼料中的部分基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)成分比較相近[11]，尤其是蛋白飼料中的蛋白含量[5]，僅通過常規(guī)的成分檢測(cè)很難辨別。目前可查閱到的檢測(cè)方法多為通過化學(xué)手段[12]或標(biāo)志物指示手段[13]檢測(cè)飼料中的抗生素殘留來評(píng)估飼料中是否添加抗生素菌渣，但是這些方法操作繁瑣、成本高、試驗(yàn)周期長(zhǎng)，且需要提前知道目標(biāo)檢測(cè)物，而抗生素菌渣品種繁多，性質(zhì)各異，僅依靠化學(xué)或標(biāo)志物指示的方法難以滿足飼料大規(guī)模檢測(cè)的要求。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)飼料中是否添加使用抗生素菌渣的檢測(cè)方法研究存在欠缺，尤其是快速便捷的檢測(cè)技術(shù)，難以適應(yīng)飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展需要。因此，需要探索一種便捷、高效、無損的檢測(cè)方法準(zhǔn)確鑒別飼料中的抗生素菌渣。

近紅外光譜已被廣泛應(yīng)用于異常分析[14]，而近紅外顯微成像技術(shù)則擴(kuò)展了傳統(tǒng)近紅外光譜的描述范圍，具有更高靈敏度，能夠獲取樣品在微區(qū)上的信息，增強(qiáng)了對(duì)樣品內(nèi)部異質(zhì)組分的分析能力[15-16]，因此可以提高檢測(cè)分析效率，減少樣本分析量?？股鼐瘜W(xué)成分復(fù)雜，近紅外特征峰重疊嚴(yán)重，單一譜峰很難將其與蛋白飼料區(qū)分開來，需要結(jié)合多元判別分析方法，構(gòu)建監(jiān)督校正模型，才能相對(duì)準(zhǔn)確地對(duì)樣品光譜定性判別。

本文主要利用傅里葉變換近紅外顯微成像系統(tǒng)，采集豆粕與抗生素菌渣樣品的可見光圖像和近紅外圖像，利用Duplex算法從樣品光譜中挑選具代表性光譜分別建立抗生素菌渣光譜庫和豆粕光譜庫，基于光譜庫結(jié)合偏最小二乘判別分析(Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)和支持向量機(jī)判別分析(Support vector machine discriminant analysis，SVM-DA)定性判別分析方法，建立豆粕和不同種類抗生素菌渣的定性判別分析模型，探究利用近紅外顯微成像技術(shù)對(duì)二者鑒別分析的可行性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與樣品制備

試驗(yàn)所用3種抗生素菌渣均采集于福建省不同的抗生素生產(chǎn)廠家，分別為硫酸鏈霉素菌渣、土霉素菌渣、硫酸粘桿菌素菌渣，所收樣品均為濕菌渣。濕菌渣易變質(zhì)，不易保存，因此統(tǒng)一將所有收到的濕菌渣樣品放置在空氣中自然晾曬風(fēng)干，然后置于105℃的干燥箱中干燥24 h，密封保存?zhèn)溆?。收集不同產(chǎn)地的豆粕樣品3個(gè)，其產(chǎn)地及其常規(guī)化學(xué)指標(biāo)如表1所示，3種豆粕的含水率以及粗脂肪、粗蛋白含量非常相近。

所有樣品經(jīng)粉碎后過0.5 mm分析篩，使所有樣品粒度在0.5 mm以下，密封包裝，貯存于4℃藥品冷藏箱中。試驗(yàn)前取出樣品，回溫放至室溫(20℃)。

表1 3種豆粕的產(chǎn)地及常規(guī)化學(xué)指標(biāo)Tab.1 Origin and conventional chemical indexesof three kinds of soybean meal

1.2 近紅外顯微圖像獲取

采用Spotlight 400型傅里葉近紅外顯微成像系統(tǒng)(美國(guó)Perkins Elmer公司)采集樣品的近紅外顯微圖像，針對(duì)樣品特點(diǎn)和近紅外顯微圖像掃描，設(shè)置圖像采集參數(shù)如下：光譜波數(shù)范圍為7 800～4 000 cm-1，光譜分辨率為32 cm-1，掃描次數(shù)為8次，空間分辨率為25 μm×25 μm，干涉儀動(dòng)鏡移動(dòng)速度為1 cm/s，圖像掃描面積為5 000 μm×5 000 μm。圖像采集軟件為Spectrum IMAGE。

分別將豆粕和抗生素菌渣樣品平鋪在聚四氟乙烯樣品板上，樣品厚度約為1 mm，以相同的聚四氟乙烯樣品板作為參比板，逐一采集樣品光譜。掃描過程中檢測(cè)室內(nèi)沖高純氮進(jìn)行空氣校正，以減少水蒸氣和二氧化碳造成的光譜吸收。

1.3 數(shù)據(jù)處理

近紅外顯微成像系統(tǒng)采集到的圖像為三維數(shù)據(jù)，圖像上的每個(gè)像素點(diǎn)代表一條光譜，圖像經(jīng)過重組成為二維的光譜。本試驗(yàn)所收集到的圖像為200×200×239，經(jīng)重組展開為40 000×239的光譜矩陣。

為消除獲取近紅外光譜圖像過程中所產(chǎn)生噪聲信號(hào)對(duì)定性判別模型的影響，需要合理選取光譜預(yù)處理方法。通過近紅外顯微圖像獲取的樣品的近紅外漫反射光譜存在基線漂移現(xiàn)象，光譜在小范圍內(nèi)存在較多的噪聲信號(hào)。對(duì)于基線漂移問題的有效預(yù)處理方法是求導(dǎo)數(shù)，對(duì)于樣品顆粒大小不均勻、表面散射及光程變化等問題的有效處理方法是標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(Standard normal variate transformation, SNV)。

由于近紅外顯微成像技術(shù)的特點(diǎn)，微區(qū)采集到的光譜存在很多信息一致的重復(fù)光譜，且光譜的數(shù)據(jù)量巨大。本試驗(yàn)中所獲取的每幅近紅外顯微圖像中包括40 000條光譜。為減少計(jì)算量，且保證光譜代表性，本試驗(yàn)利用Duplex算法[17-18]選取具有代表性的光譜用于模型建立和獨(dú)立驗(yàn)證。Duplex算法的主要目標(biāo)是在備選數(shù)據(jù)集合中選擇2個(gè)具有代表性的相似子數(shù)據(jù)集，所選出的2個(gè)數(shù)據(jù)集合具有相似的數(shù)據(jù)分布、性質(zhì)。首先對(duì)備選數(shù)據(jù)集進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和正交歸一化，求出各數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的歐氏距離，將距離最遠(yuǎn)的2個(gè)點(diǎn)放入第1個(gè)樣本集，然后將剩余樣品中距離最大的2個(gè)點(diǎn)放入第2個(gè)樣品集，重復(fù)以上步驟直至選到設(shè)定代表樣品數(shù)目。通過此算法分別獲得豆粕和抗生素菌渣樣品的光譜庫。

豆粕和3種菌渣的成分差異較小，而光譜存在微小差異，若要更具體地說明豆粕和抗生素菌渣光譜的這些微小差異僅通過簡(jiǎn)單的差異性分析難以辨別，為此，本文使用皮爾遜相關(guān)系數(shù)計(jì)算豆粕和3種抗生素菌渣的光譜相似性。皮爾遜相關(guān)系數(shù)的計(jì)算公式為

(1)

式中K(x，y)——皮爾遜相關(guān)系數(shù)

x、y——待測(cè)樣本光譜

K值越接近1，2條光譜的相似性越大，越接近0則差異性越大。

基于樣品光譜庫光譜，分別采用PLS-DA和SVM-DA方法建立定性分析模型對(duì)豆粕和不同種類抗生素菌渣進(jìn)行鑒別分析。

偏最小二乘法(Partial least squares，PLS)[19]是基于對(duì)矩陣X和Y進(jìn)行分解消除噪聲信號(hào)而提出的多元因子回歸方法。在對(duì)X和Y分解的同時(shí)，將Y的信息引入到X矩陣分解過程中，使得X的主成分直接與Y關(guān)聯(lián)，在考慮主成分方差盡可能大的同時(shí)，還使主成分與Y最大程度地相關(guān)，目的是盡可能利用光譜變量與濃度之間的線性關(guān)系。PLS-DA模型[20]是基于PLS的判別分析，以Y變量為二進(jìn)制變量(類別變量)取代濃度變量，計(jì)算光譜矩陣X與類別矩陣Y的相關(guān)關(guān)系，取得X與Y的最大協(xié)方差Cov(X，Y)。

支持向量機(jī)(Support vector machine，SVM)[19，21]用于處理分類問題，找出距區(qū)分類別最大相位的超平面，以確保分類錯(cuò)誤率為最小。SVM分類法的核心思想是：通過線性或非線性映射(核函數(shù))，將輸入空間映射到高維特征空間，也將非線性問題通過核函數(shù)映射到高維空間轉(zhuǎn)換為線性問題，然后在高維特征空間中構(gòu)造最優(yōu)(線性)分類平面對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類。常用的核函數(shù)有線性函數(shù)、多項(xiàng)式函數(shù)、徑向基函數(shù)(Radial basis function，RBF)、層感知核函數(shù)等[19]，其中RBF計(jì)算量小，具有良好的學(xué)習(xí)能力。本研究采用nu-SVC算法，選擇非線性Gaussian-RBF核函數(shù)進(jìn)行SVM-DA模型構(gòu)建。在將原始數(shù)據(jù)映射到高維特征空間后，雖然轉(zhuǎn)換成線性數(shù)據(jù)，但是引入了一些冗余信息，為了在確保模型準(zhǔn)確的基礎(chǔ)上盡量減小數(shù)據(jù)量、簡(jiǎn)化計(jì)算過程[22-25]，需要對(duì)高維空間的線性數(shù)據(jù)進(jìn)行特征提取。常用的特征提取方法有PLS和主成分分析(Principal component analysis，PCA)，經(jīng)模型驗(yàn)證使用PLS特征提取所建模型比PCA效果好，因此本研究所建模型均采用PLS特征提取。

本文中所有數(shù)據(jù)處理與分析在Matlab R2013a(美國(guó)Mathworks公司)平臺(tái)中實(shí)現(xiàn)，其中PCA、PLS-DA及SVM-DA使用PLS_toolbox(美國(guó)Eigenvector公司)實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆粕和抗生素菌渣近紅外光譜特性分析

圖3 豆粕和3種抗生素菌渣的近紅外平均光譜及其二階導(dǎo)數(shù)光譜Fig.3 Near-infrared average spectra of soybean meal and three antibiotic mycelial residues and their second derivative spectra

圖1為3種抗生素菌渣和豆粕的近紅外顯微圖像，圖像均為Matlab處理后的重構(gòu)圖像。將三維的近紅外顯微圖像光譜進(jìn)行分解，可得到每個(gè)樣品的所有光譜。圖2為3種豆粕光譜和這3種豆粕的平均光譜，由圖2可知3個(gè)豆粕樣品光譜的吸光度及光譜形狀幾乎一致，且相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.990以上，因此將3個(gè)豆粕樣品的平均光譜作為豆粕樣品的光譜，分析與不同抗生素菌渣光譜之間的差異。

圖1 豆粕和3種抗生素菌渣的近紅外顯微圖像Fig.1 Near infrared microscopic images of soybean meal and three antibioticmycelial residues

圖2 3種豆粕光譜及其平均光譜Fig.2 Spectra and average spectra of three kinds of soybean meal

由豆粕光譜與3種抗生素菌渣光譜的皮爾遜相關(guān)系數(shù)，豆粕與3種抗生素菌渣的相似性由大到小依次為硫酸鏈霉素(0.991)、硫酸粘桿菌素(0.972)、土霉素(0.960)。

圖3a為3種抗生素菌渣與豆粕的光譜圖像，為使不同樣品的差異性更明顯，圖3b展示了樣品的近紅外二階導(dǎo)數(shù)光譜，從二階導(dǎo)數(shù)光譜中能夠看出，在6 200～5 800 cm-1和5 500～5 000 cm-1區(qū)域存在顯著差異，這些區(qū)間主要反映水(5 200～5 100 cm-1)、蛋白(4 870～4 400 cm-1)、多糖(4 400～4 300 cm-1)、脂肪(5 790～5 690 cm-1和4 340～4 260 cm-1)等含氫基團(tuán)的近紅外光譜特征，通過對(duì)豆粕和3種抗生素菌渣的近紅外二階導(dǎo)數(shù)光譜分析可知，兩種物料之間存在差異，因此可以使用合適的判別模型對(duì)二者進(jìn)行鑒別分析。

2.2 基于不同預(yù)處理方法和建模方法建立相應(yīng)判別模型

表2 基于不同預(yù)處理方法的豆粕與抗生素菌渣PLS-DA判別模型結(jié)果Tab.2 Qualitative discriminant results of soybean meal and antibiotic mycelial residue in PLS-DA model withdifferent pretreatment methods

表3 基于不同預(yù)處理方法的豆粕與抗生素菌渣SVM-DA定性判別模型結(jié)果Tab.3 Qualitative discriminant results of soybean meal and antibiotic mycelial residue in SVM-DA model PLSwith different pretreatment methods

2.3 近紅外顯微成像定性判別模型的外部獨(dú)立驗(yàn)證

為驗(yàn)證所建立的定性判別模型的準(zhǔn)確性，本研究采用外部獨(dú)立驗(yàn)證對(duì)所建立模型的準(zhǔn)確性加以驗(yàn)證，驗(yàn)證集的結(jié)果如表2和表3所示。PLS-DA模型的判別正確率在99.4%以上，其中判別2、3、4的判別正確率達(dá)到100%。SVM-DA模型的正確率幾乎為100%，僅有判別1中的二階導(dǎo)數(shù)處理模型存在判別錯(cuò)誤。從驗(yàn)證集的結(jié)果分析，也可驗(yàn)證SVM-DA模型的定性鑒別結(jié)果優(yōu)于PLS-DA模型，判別2和判別3的判別效果優(yōu)于判別1和判別4。

3 結(jié)束語

針對(duì)目前缺乏對(duì)飼料中抗生素菌渣快速檢測(cè)手段的問題，在豆粕與抗生素菌渣具有相似成分組成的前提下，本文提出了采用近紅外顯微成像技術(shù)從樣品微區(qū)光譜入手分析飼料樣品，旨在以豆粕和3種抗生素菌渣(硫酸鏈霉素菌渣、土霉素菌渣、硫酸粘桿菌素菌渣)為例論證基于近紅外顯微成像技術(shù)快速檢測(cè)飼料中抗生素菌渣的可行性。采用PLS-DA和SVM-DA的定性判別模型，對(duì)豆粕和抗生素菌渣的種類進(jìn)行鑒別分析。研究表明，豆粕和3種抗生素菌渣的主要成分雖然相似，但是利用近紅外顯微成像技術(shù)結(jié)合定性判別模型的種類鑒別效果比較理想。PLS-DA和SVM-DA模型分析及其外部獨(dú)立驗(yàn)證表明，基于近紅外顯微成像光譜數(shù)據(jù)可以有效對(duì)豆粕和抗生素菌渣進(jìn)行鑒別分析，SVM-DA模型優(yōu)于PLS-DA模型，定性判別正確率達(dá)到99.4%以上。通過該研究可知：近紅外顯微成像光譜能夠定性區(qū)分豆粕和抗生素菌渣，為飼料中抗生素菌渣鑒別提供了思路，有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

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