解淀粉芽孢桿菌L-H15的促生與抗病特性研究

張 瑩 秦宇軒 尚慶茂 張志剛 賴孟瑄 李平蘭

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院， 北京 100083； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所， 北京 100081)

引言

植物根際促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是指附生于植物根際的生防微生物，一般能夠促進(jìn)植物生長，增強(qiáng)礦質(zhì)營養(yǎng)吸收和利用，促進(jìn)有益微生物的根際定殖，抑制有害微生物[1]。PGPR可以通過多種機(jī)制來促進(jìn)植物的生長，如分泌植物激素、增強(qiáng)植物對(duì)水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、固氮作用、分泌ACC脫氨酶(1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶)降解乙烯、溶磷作用、分泌鐵載體等，并且還能夠通過分泌一些抗菌物質(zhì)來抑制病原菌的生長繁殖。目前已開發(fā)為生物防治劑和熱門研究的PGPR主要為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)和芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

芽孢桿菌作為一種重要的植物根際促生菌，主要優(yōu)勢在于其能夠產(chǎn)生抑制病原微生物的抗菌脂肽，主要包括Surfactin(表面活性素)、Iturin(伊枯草素)、Fengycin(豐原素)3大類[2]。此外，由于其具有產(chǎn)孢能力，能夠在胞內(nèi)形成抗逆性休眠體，具有耐熱、紫外線、多種有機(jī)溶劑、酸、堿等多重抗逆性，作為生防菌具有理想的保存優(yōu)勢。因此，將具有良好促生抗病效果的芽孢桿菌開發(fā)成生物防治劑具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) L-H15為實(shí)驗(yàn)室前期分離篩選自草炭土育苗基質(zhì)中的一株優(yōu)良的植物根際促生菌，該菌株能夠分泌高活性抗菌脂肽，對(duì)草酸青霉(Penicilliumoxalicum)、串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和黑曲霉(Aspergillusniger)等病原真菌均有抑制作用[3]。為了進(jìn)一步探究該菌株的生防潛力，本文主要分析菌株全基因組序列中與促生抗病相關(guān)的基因，測定菌株形成生物被膜、根際定殖、固氮溶磷解鉀、分泌鐵載體和植物激素等相關(guān)的促生抗病特性，證明該菌株具有良好的生防潛力，以期為該菌株的實(shí)際應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) L-H15，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院應(yīng)用微生物研究室提供。

立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)提供，編號(hào)分別為36124和37438。

黃瓜(CucumissativusL.)品種為“中農(nóng)6號(hào)”，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供。

1.2 基于全基因組測序的植物促生抗病相關(guān)基因分析

本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)完成了解淀粉芽孢桿菌L-H15(GenBank：CP010556)的全基因組測序工作，利用NCBI網(wǎng)站(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因組BLAST功能，將得到的全基因組測序結(jié)果中與標(biāo)準(zhǔn)菌株解淀粉芽孢桿菌FZB42(GenBank：CP000560)已報(bào)道的抗病促生相關(guān)的基因進(jìn)行對(duì)比分析并注釋。

1.3 菌株形成生物被膜能力的測定

將供試菌株培養(yǎng)至菌體數(shù)約為108CFU/mL后分別接種于新鮮的TSBG[4]和MSgg液體培養(yǎng)基中，按照每孔6 mL將菌液轉(zhuǎn)至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；將供試菌株菌液點(diǎn)接種于含有6 mL LB固體培養(yǎng)基的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。將細(xì)胞培養(yǎng)板在30℃靜置培養(yǎng)5 d，取出培養(yǎng)板后，觀察在TSBG培養(yǎng)基底部的潛底型(submerged)生物被膜、MSgg表面的薄皮型(pellicle)生物被膜及在LB固體培養(yǎng)基表面的群落型(colony)生物被膜的形成情況。

1.4 菌株根際表面定殖能力的測定

參照IDRIS等[5]的方法，將培養(yǎng)至活菌數(shù)為108CFU/mL菌液用生理鹽水洗滌2～3次后10倍稀釋，吸取1 mL至墊有無菌水潤濕的濾紙培養(yǎng)皿中，每皿放置15粒消毒的黃瓜種子，室溫放置1 h后轉(zhuǎn)至暗處，28℃生長4 d，待根長1 cm時(shí)，切取1 g置于9 mL無菌生理鹽水中，渦旋1 min，平板計(jì)數(shù)。

1.5 菌株固氮、溶磷、解鉀能力的測定

菌株固氮能力的定性測定：取5 μL菌液(活菌數(shù)108CFU/mL)點(diǎn)接種于無氮固體培養(yǎng)基[6]表面的滅菌濾紙片上，待菌液晾干后置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，觀察能否在選擇培養(yǎng)基上生長。

菌株溶磷能力的測定：①定性測定：取5 μL菌液(活菌數(shù)108CFU/mL)點(diǎn)接種于PKO無機(jī)培養(yǎng)基[7]和蒙金娜有機(jī)培養(yǎng)基[8]表面的滅菌濾紙片上，待菌液晾干后置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，觀察有無溶磷圈，并根據(jù)溶磷圈的大小初步確定菌株解磷能力。②定量測定：將菌株以活菌數(shù)約為108CFU/mL按2%接種量(體積分?jǐn)?shù)，下同)接種于液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min培養(yǎng)5 d，以加入等量無菌水的培養(yǎng)基為對(duì)照，超聲波破碎20 min后4℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液采用鉬銻抗比色法測定可溶性磷的含量。

菌株解鉀能力的測定：①定性測定：取5 μL菌液(活菌數(shù)108CFU/mL)點(diǎn)接種于解鉀篩選培養(yǎng)基[9]表面的滅菌濾紙片上，待菌液晾干后置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，觀察挑選大型、透明、隆起、有粘性的菌落，即為有解鉀能力的菌株。②定量測定：將菌株以活菌數(shù)約為108CFU/mL按2%接種量于液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)7 d，以加入等量無菌水的培養(yǎng)基為對(duì)照，超聲破碎20 min后4℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液采用原子吸收法測定鉀的含量。

1.6 菌株分泌鐵載體能力的測定

定性測定：采用雙層平板法，下層平板采用CAS瓊脂，按5 mL CAS檢測液[10]+100 mL 1%的瓊脂的比例混合；上層平板LB固體。取5 μL菌液(活菌數(shù)108CFU/mL)點(diǎn)接種于雙層平板表面的滅菌濾紙片上，待菌液晾干后置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后觀察，若菌株產(chǎn)生鐵載體，下層CAS平板應(yīng)由藍(lán)色變?yōu)槌壬鶕?jù)橙色鐵載體暈圈的大小初步確定菌株分泌鐵載體的能力。

定量測定：MKB液體培養(yǎng)基[11]每瓶50 mL分裝備用，2%接種量(菌株用生理鹽水洗2次后加入)，28℃，150 r/min培養(yǎng)48 h，3 500 r/min離心15 min，將pH值調(diào)至6.8后取3 mL上清液與3 mL CAS檢測液混合均勻，室溫下反應(yīng)1 h，以去離子水作為對(duì)照調(diào)零，測定630 nm波長處的吸光度，以未接菌的MKB液體培養(yǎng)基上清液作為空白對(duì)照，菌株鐵載體的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算公式為

式中X——鐵載體的相對(duì)表達(dá)量

Ar——待測樣的吸光度，OD

As——空白對(duì)照的吸光度，OD

1.7 菌株分泌植物激素能力的測定

采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法(Sandwich ELISA)測定菌株分泌吲哚乙酸(IAA)、細(xì)胞分裂素(CTK)和赤霉素(GA)這3種植物激素的能力。將供試菌株(活菌數(shù)108CFU/mL)以0.5%的接種量在LB液體培養(yǎng)基中37℃、200 r/min培養(yǎng)6、12、24、36、48 h，3 000 r/min離心20 min，取上清液作為待測樣品。具體操作參照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.8 菌株抑菌能力的測定

將病原真菌轉(zhuǎn)接至PDA平板中央。采用對(duì)峙法將供試菌株菌液(活菌數(shù)108CFU/mL)5 μL點(diǎn)接在距病原真菌菌餅2.5 cm處的無菌濾紙片上，以LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，28℃培養(yǎng)。當(dāng)對(duì)照平板中病原真菌爬滿平板時(shí)計(jì)算抑制率，立枯絲核菌培養(yǎng)4 d，尖孢鐮刀菌培養(yǎng)7 d后，測量抑菌帶直徑，抑菌帶直徑為抑菌圈直徑與拮抗菌菌落直徑的差值。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于全基因組測序的植物促生抗病相關(guān)基因分析

基于NCBI網(wǎng)站上的BLAST功能比較分析，解淀粉芽孢桿菌L-H15與標(biāo)準(zhǔn)菌株FZB42在植物促生抗病相關(guān)的典型基因上具有很大的相似性，L-H15具有全部FZB42中已知功能的與植物互作相關(guān)的基因，具體注釋結(jié)果如表1～5所示。

表1 與根際定殖、集群運(yùn)動(dòng)、生物被膜形成相關(guān)基因Tab.1 Genes involved in root colonization, swarming motility and biofilm formation

續(xù)表1

表2 與植物可利用礦質(zhì)元素相關(guān)基因Tab.2 Genes involved in mineral availability for plants

表3 與植物生長調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性相關(guān)基因(植物激素及其他成分)Tab.3 Genes involved in production of plant growth regulators and induced systemic resistance

表4 與植物環(huán)境脅迫的抗逆能力相關(guān)基因Tab.4 Genes involved in response to environmental stress

表5 與抑菌功能相關(guān)基因Tab.5 Genes involved inantibiosis

2.2 L-H15形成生物被膜的能力

采用定性觀察的方式來確定解淀粉芽孢桿菌L-H15是否具有形成生物被膜的能力，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。L-H15不能夠在TSBG液態(tài)培養(yǎng)基的底部形成潛底型生物被膜，只能夠在培養(yǎng)基表面聚集形成物明顯褶皺狀的薄皮型生物被膜；而在MSgg液態(tài)培養(yǎng)基與LB固體培養(yǎng)基的表面，L-H15都能夠形成表面凹凸不平、布滿褶皺、立體結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的薄皮型生物被膜和群落型生物被膜。

圖1 L-H15形成生物被膜的能力Fig.1 Biofilm formation capability of L-H15

2.3 L-H15的根系表面定殖能力

通過活菌計(jì)數(shù)的方式測定解淀粉芽孢桿菌L-H15的根系在根系表面定殖的活菌數(shù)為1.39×105CFU/g，根據(jù)IDRIS等[5]的研究，超過105CFU/g可認(rèn)為該菌株具有在黃瓜植株根系表面定殖的能力。

2.4 L-H15的固氮、溶磷、解鉀能力

L-H15的固氮能力：將解淀粉芽孢桿菌L-H15接種于無氮培養(yǎng)基上，結(jié)果如圖2e所示，L-H15能夠在無氮培養(yǎng)基上生長且長勢良好，說明該菌株具有一定的固氮能力，但其具體的固氮能力需要進(jìn)一步通過定量試驗(yàn)進(jìn)行測定。

圖2 L-H15在無氮培養(yǎng)基、無機(jī)磷培養(yǎng)基、有機(jī)磷培養(yǎng)基及解鉀培養(yǎng)基上的生長情況Fig.2 Growth of L-H15 on nitrogen free medium plate, inorganic phosphorus medium plate, organic phosphorus medium plate and potassium solubilization medium plate

L-H15的溶磷能力：①定性試驗(yàn)：本試驗(yàn)將解淀粉芽孢桿菌L-H15接種于無機(jī)磷培養(yǎng)基及有機(jī)磷培養(yǎng)基上，結(jié)果如圖2f、2g所示，L-H15在無機(jī)磷培養(yǎng)基上無明顯的透明圈，說明該株菌無較強(qiáng)的溶解無機(jī)磷的能力；而在有機(jī)磷培養(yǎng)基上有顯著的透明圈，說明該菌株有較強(qiáng)的溶解有機(jī)磷能力。②定量試驗(yàn)：本試驗(yàn)采用鉬銻抗比色法進(jìn)行測定，L-H15對(duì)無機(jī)磷溶解量為(10.37±0.97) μg/mL，驗(yàn)證了定性試驗(yàn)中該菌株溶解無機(jī)磷的能力較弱的結(jié)果；而在溶解有機(jī)磷能力方面，該菌株對(duì)有機(jī)磷能力的溶解量為(-26.77±0.57) μg/mL，為負(fù)值，即L-H15培養(yǎng)液中可溶性磷的含量小于空白培養(yǎng)液，但L-H15定性試驗(yàn)的結(jié)果顯示其具有溶解有機(jī)磷的能力，所以推測可能是由于L-H15雖然具有很強(qiáng)的溶解有機(jī)磷能力但其對(duì)有機(jī)磷的利用能力和需求也很強(qiáng)，所以檢測值會(huì)小于空白對(duì)照。趙小蓉等[33]也發(fā)現(xiàn)某些微生物細(xì)胞能夠以多聚磷酸鹽的形態(tài)貯藏磷，用氯仿進(jìn)行熏蒸處理時(shí)，這部分磷會(huì)從細(xì)胞中釋放出來。

L-H15的解鉀能力：①定性試驗(yàn)：將解淀粉芽孢桿菌L-H15接種于解鉀培養(yǎng)上，結(jié)果如圖2h所示，L-H15能夠在解鉀培養(yǎng)基上生長，但均無明顯的隆起狀態(tài)，推測該菌株無明顯的解鉀能力。②定量試驗(yàn)：采用原子吸收法進(jìn)行測定，L-H15對(duì)鉀的溶解量為(2.00±0.40) μg/mL，驗(yàn)證了定性試驗(yàn)中該菌株解鉀能力較為微弱的結(jié)果。

2.5 L-H15分泌鐵載體的能力

定性試驗(yàn)：將解淀粉芽孢桿菌L-H15接種于CAS雙層平板上，結(jié)果如圖3所示，解淀粉芽孢桿菌L-H15能夠在CAS檢測平板上產(chǎn)生橙色鐵載體暈圈，說明該菌株具有分泌鐵載體的能力。

圖3 L-H15在CAS檢測平板上的顯色情況Fig.3 Coloration of L-H15 on CAS test plate

定量試驗(yàn)：采用CAS檢測法測定菌株分泌鐵載體的能力，L-H15分泌鐵載體的相對(duì)表達(dá)量為(60.22±0.01)%，根據(jù)趙翔等[34]的研究結(jié)果，鐵載體相對(duì)表達(dá)量超過50%可認(rèn)為其作為植物根際促生菌具有較強(qiáng)分泌鐵載體的能力。

2.6 L-H15產(chǎn)植物激素能力的測定

采用ELISA試劑盒測定解淀粉芽孢桿菌L-H15產(chǎn)生植物激素的能力，由圖4可知， 解淀粉芽孢桿菌L-H15具有分泌IAA、CTK、GA這3種植物激素的能力。在LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時(shí)間為12 h時(shí)，L-H15分泌IAA的量最多，可達(dá)61.35 pmol/L；培養(yǎng)時(shí)間為24 h時(shí)，分泌CTK的量最多，可達(dá)48.93 ng/mL；培養(yǎng)時(shí)間為36 h時(shí)，分泌GA的量最多，可達(dá)82.46 pmol/L。而隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，這3種植物激素的含量均出現(xiàn)逐漸降低的現(xiàn)象。

圖4 L-H15分泌IAA、CTK和GA的能力Fig.4 Capabilities of L-H15 to produce IAA, CTK and GA

2.7 L-H15的抑菌能力

采用平板對(duì)峙法測定L-H15的抑菌能力，抑菌效果見圖5，解淀粉芽孢桿菌L-H15對(duì)尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌均有較強(qiáng)的抑制效果。其中，L-H15拮抗立枯絲核菌能力較強(qiáng)，抑菌帶直徑為(8.67±1.15) mm，而拮抗尖孢鐮刀菌的能力相對(duì)較弱，抑菌帶直徑為(2.50±0.50) mm。

圖5 L-H15對(duì)立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌的抑菌效果Fig.5 Inhibiting effects of L-H15 against Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum

3 討論

3.1 基于全基因組測序的植物促生抗病相關(guān)基因分析

基于全基因組序列分析的結(jié)果說明，解淀粉芽孢桿菌L-H15具有與植物互作相關(guān)的基因。該菌株的基因組中包含與生物被膜形成相關(guān)的一套完整的基因及基因簇，例如其中非常重要的產(chǎn)孢的全局調(diào)控因子spo0A及生物被膜重要組分胞外多糖合成操縱子epsA-O，說明從基因的角度上分析，該菌株具有形成生物被膜的能力，且能夠在植物根系表面定殖，發(fā)揮其生防作用；L-H15含有植酸酶基因phy和合成Bacillibactin(嗜鐵素)的dhb操縱子，能夠促進(jìn)植物對(duì)于礦質(zhì)元素的吸收；L-H15含有合成植物生長素IAA的關(guān)鍵基因dhaS、ysnE和yhcX，以及合成2,3-丁二醇的關(guān)鍵基因alsD、alsS和alsR，促進(jìn)植物生長并且誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性；L-H15含有的非核糖體合成酶srfA操縱子、bmy操縱子和fen操縱子分別合成Surfactin、Bacillomycin D和Fengycin，含有的bac操縱子能夠合成二肽類抗生素Bacilysin，含有聚酮類合成酶mln操縱子、bae操縱子和dfn操縱子分別合成Macrolactin、Bacillaene和Difficidin，這些物質(zhì)均能夠起到抑制病原微生物的作用。綜合以上分析結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌L-H15從基因分析的角度上均具有促生抗病的能力，作為植物生防菌具有很大的應(yīng)用潛力。

3.2 解淀粉芽孢桿菌L-H15形成生物被膜及根際定殖的能力

在自然環(huán)境中，植物的生長與微生物密切相關(guān)，植物根系分泌營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)微生物的生長并驅(qū)使微生物在根系表面形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物被膜，牢固地定殖于植物根系[35]。因此，植物根際促生菌的根系定殖能力是起到生防作用的前提，是限制植物根際促生菌發(fā)揮促生作用的重要因素，是植物根際促生菌拮抗作用和競爭作用的基礎(chǔ)，而生物被膜則是根際定殖的重要表現(xiàn)形式。綜上所述，衡量植物根際促生菌形成生物被膜及根際定殖能力具有非常重要的意義。本試驗(yàn)測定結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌L-H15具有一定的形成生物被膜的能力及植物根系定殖能力，在實(shí)際應(yīng)用于植物根際時(shí)具有發(fā)揮生防作用的潛力。

3.3 解淀粉芽孢桿菌L-H15分泌鐵載體的能力

鐵是植物生長必需的營養(yǎng)元素，但土壤中的鐵多為氧化物，植物卻只能吸收利用可溶性的鐵離子。而一些植物根際促生菌具有分泌高特異螯合鐵離子小分子化合物(分子量1 000)的能力，即分泌鐵載體的能力[34]。植物根際促生菌分泌的鐵載體所形成的鐵-鐵載體復(fù)合物具有可溶性，能被植物細(xì)胞外膜上的特異性受體識(shí)別和吸收，利于植物攝入鐵元素，為植物的生長發(fā)育起到促進(jìn)作用。此外，鐵元素對(duì)于微生物來說也是生長必須的營養(yǎng)元素，而這些由植物根際促生菌分泌的鐵載體能夠與病原微生物爭奪有限的鐵營養(yǎng)，進(jìn)而起到拮抗病原微生物的作用。本試驗(yàn)測定結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌L-H15具有較強(qiáng)分泌鐵載體的能力，具有良好的促生及抗病潛力。

3.4 解淀粉芽孢桿菌L-H15分泌植物激素的能力

植物激素是由植物自身代謝產(chǎn)生的一類有機(jī)物質(zhì)，在低濃度的情況下調(diào)控著植物的多種發(fā)育及生理過程，如種子的萌發(fā)、葉綠體的分化、頂端優(yōu)勢、植物-病原菌間的互作、花和果實(shí)的發(fā)育以及葉片的衰老等生理過程。而研究表明，很多植物根際促生菌會(huì)通過分泌植物激素的方式直接起到促進(jìn)植物生長的作用，例如Acetobacterdiazotrophicus和Herbaspirillumseropedicae具有分泌吲哚乙酸(IAA)的能力[36]；Azospirillumsp.具有分泌細(xì)胞分裂素(CTK)的能力[37]；Azospirillumlipoferumop33具有分泌赤霉素(GA3)的能力[38]。這些植物激素經(jīng)由定殖在植物根系表面及內(nèi)部的植物根際促生菌分泌并且被植物根系吸收，進(jìn)而起到調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的作用。本試驗(yàn)測定結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌L-H15具有分泌IAA、CTK、GA這3種植物激素的能力，在促進(jìn)植物生長方面具有極大的應(yīng)用潛力。

4 結(jié)束語

通過對(duì)解淀粉芽孢桿菌L-H15的促生抗病特性研究，確定了L-H15具有與植物互作相關(guān)的基因，從基因分析的角度上具有促生抗病的潛力。通過對(duì)L-H15促生抗病相關(guān)特性測定的結(jié)果可以確定，該菌株具有形成生物被膜的能力，且在根系表面定殖的菌數(shù)超過105CFU/g，分泌鐵載體的相對(duì)表達(dá)量為60.22%，分泌IAA、CTK和GA的含量最多可達(dá)到61.35 pmol/L、48.93 ng/mL和82.46 pmol/L，對(duì)立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌的抑菌帶直徑分別為(8.67±1.15) mm和(2.50±0.50) mm。綜上所述，解淀粉芽孢桿菌L-H15具有多重促生抗病能力，具有良好的生防潛力及未來開發(fā)成植物促生菌劑的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)然，該菌株的具體促生抗病機(jī)制及實(shí)際生防應(yīng)用效果需要進(jìn)一步的研究與驗(yàn)證。

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