桑葚醋發(fā)酵優(yōu)化及提取物抗氧化能力分析

趙 鑫， 任朝琴， 戴先芝

桑葚醋發(fā)酵優(yōu)化及提取物抗氧化能力分析

趙 鑫， 任朝琴*， 戴先芝*

（阿壩師范學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院，四川 阿壩 623000）

采用鐵氰化鉀（K3Fe(CN)6）還原法，以正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別確定發(fā)酵時(shí)間、酵母菌含量、醋酸菌含量、發(fā)酵溫度對(duì)桑葚人工發(fā)酵階段的影響；實(shí)驗(yàn)表明，桑葚酒精發(fā)酵過(guò)程中總抗氧化能力最優(yōu)的條件為：蔗糖含量14 g/100 mL，酵母菌含量5%，溫度30℃；桑葚醋發(fā)酵過(guò)程中總抗氧化能力最優(yōu)的條件為：酒精發(fā)酵時(shí)間為5 d，醋酸菌含量1%，溫度32℃；分別采用水楊酸法和DPPH法測(cè)得桑葚醋提取物對(duì)（?OH）自由基和DPPH自由基有很好的清除作用，其清除率分別可達(dá)92.63%、94.48%。實(shí)驗(yàn)分析發(fā)酵型桑葚醋抗氧化能力變化的可能原因，并為發(fā)酵型桑葚醋能夠成為新型植物型提取天然抗氧化劑提供理論基礎(chǔ)。

桑葚；發(fā)酵工藝；抗氧化能力；自由基

桑葚（），系?？疲ǎ┥伲ǎ┥?shù)（L.）的干燥果穗[1]，使用價(jià)值很高，既可食用又可入藥，味甜汁多，酸甜可口，被譽(yù)為“民間圣果”[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桑葚對(duì)人體有很好的補(bǔ)血、抗氧化、消除自由基等保健功效，因此，現(xiàn)階段被廣泛應(yīng)用于人體造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化等方面的研究。

研究發(fā)現(xiàn)，桑葚營(yíng)養(yǎng)豐富，富含白藜蘆醇、花青素、蝦青素、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分[3]，既可以鮮食又可用作中藥材，作為水果和保健品具有廣泛的應(yīng)用。但新鮮的桑葚果實(shí)運(yùn)輸困難、不易保存、上市時(shí)間短；在食用方面并不能得到廣大消費(fèi)者的喜歡，且桑葚成熟周期短，保存條件苛刻，上市周期短，且不方便運(yùn)輸也成為了限制桑葚鮮果進(jìn)一步發(fā)展的重要影響因素，因此將桑葚開(kāi)發(fā)加工成其他產(chǎn)品很有必要的。

孫佳勰等[4]以桑葚為實(shí)驗(yàn)原料，探究了相關(guān)物質(zhì)在桑葚酒精發(fā)酵中的變化情況，分析了構(gòu)成桑葚果酒的相關(guān)物質(zhì)；孔燕等[5]以酵母菌株考察了對(duì)桑葚果酒感官品質(zhì)的影響，確定了釀制桑葚果酒的較優(yōu)酵母菌株；陳麒等[6]研究了酵母接種量對(duì)桑葚果酒中甲醇含量的影響；呂行等[7]通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)研究了桑葚不同發(fā)酵階段的抗氧化活性能力變化規(guī)律，通過(guò)乳酸發(fā)酵的方式能有效提高產(chǎn)物的總抗氧化能力；決登偉等[8]研究了在高壓環(huán)境下分析了桑葚總酚、總黃酮和花色苷的變化情況，表明高壓環(huán)境下桑葚的抗氧化成分會(huì)不斷流失，進(jìn)而影響其抗氧化能力；李柏榆等[9]通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)比較了純化前后的桑葚多酚含量，且純化后的桑葚多酚抗氧化能力較強(qiáng)。

針對(duì)“桑葚醋發(fā)酵”、“桑葚醋提取物”的現(xiàn)有研究現(xiàn)狀，本文歸納總結(jié)桑葚醋發(fā)酵過(guò)程的影響因素，通過(guò)單因素和正交水平實(shí)驗(yàn)分析了桑葚酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵過(guò)程中的產(chǎn)物生成情況確定桑葚醋的最適發(fā)酵條件，對(duì)能影響桑葚醋總抗氧化能力的相關(guān)因素做重點(diǎn)研究，在最適發(fā)酵條件下分析其桑葚醋提取物的抗氧化能力變化情況，研究了桑葚醋提取物其對(duì)（?OH）、DPPH自由基的清除能力，為桑葚醋提取物作為植物型抗氧化劑提供了一定的理論數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)采用的桑葚鮮果購(gòu)置于汶川縣水磨鎮(zhèn)市場(chǎng)，經(jīng)戴先芝副教授鑒定合格后低溫保存處理。

實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自制一次性蒸餾水；實(shí)驗(yàn)試劑：磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、蔗糖、水楊酸、70 %乙醇、DPPH自由基醇溶液、乙酸乙酯、冰醋酸、無(wú)水乙醇、95 %乙醇均為實(shí)驗(yàn)室購(gòu)置的分析純?cè)噭?/p>

酵母菌種為安琪葡萄酒酵母，購(gòu)置于安琪酵母股份有限公司；醋酸菌種為醋酸菌，購(gòu)置于濟(jì)寧祥園生物科技。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

UV-1800PC紫外可見(jiàn)光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司），JJ324BC分析天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠），HH?S11-2-S電熱恒溫水浴鍋（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），R-1001-VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.4 桑葚醋提取方法

實(shí)驗(yàn)發(fā)酵階段結(jié)束后，將發(fā)酵得到的桑葚醋利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮處理，在恒溫25℃的條件下，加入乙酸乙酯萃取進(jìn)行萃取2次，萃取結(jié)束后加入無(wú)水乙醇進(jìn)行離心處理，過(guò)濾上層清液，水浴加熱得到桑葚醋提取物。

1.5 總抗氧化能力檢測(cè)[10-12]

取1 mL桑葚醋提取物樣品，加入2.5 mL pH＝7.5的磷酸鹽溶液，2.5 mL K3Fe(CN)6溶液（1%），振蕩混合均勻，水浴反應(yīng)30 min；加入3.0 mL三氯乙酸溶液（10%），離心處理600 s；取離心完成的上層清液1.5 mL，加入3.5 mL蒸餾水，0.5 mL FeCl3（1%），震蕩混合均勻。在吸光度為700 nm平行測(cè)定3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，樣品溶液的吸光值越大，則表征待測(cè)液的還原力越強(qiáng)。

1.6 自由基清除能力測(cè)定

1.6.1（?OH）自由基清除能力測(cè)定[13-15]

在1 mL中蒸餾水中加入9 mmol/L FeSO4溶液2 mL、9 mmol/L H2O2溶液2 mL、振蕩混合均勻后靜置600 s，加入9 mmol/L水楊酸溶液2 mL、振蕩混合均勻后靜置0.5 h，以蒸餾水為參比溶液，在510 nm下測(cè)定吸光度0。取1 mL不同體積梯度的樣品為實(shí)驗(yàn)組，按照上述步驟，在510 nm條件下平行測(cè)定3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，然后按照式（1）計(jì)算樣品對(duì)（?OH）自由基的消除率1。

式中，0為空白對(duì)照液的吸光值，A為加入待測(cè)樣品后的吸光值，A為不加入水楊酸時(shí)待測(cè)樣品的吸光值。

1.6.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定[16-18]

移取5 mL蒸餾水，加入 0.5 mmol /L DPPH自由基醇溶液5 mL，振蕩混合均勻后避光0.5 h，以蒸餾水為參比溶液，在517 nm下測(cè)定吸光度0。取5 mL不同體積梯度的樣品為實(shí)驗(yàn)組，按照上述步驟，在517 nm條件下平行測(cè)定3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，然后按照式（2）計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的消除率2。

式中，0為DPPH溶液與無(wú)水乙醇混合后測(cè)定的OD517值，A為DPPH溶液與稀釋后樣品反應(yīng)測(cè)得OD517值，A為無(wú)水乙醇與稀釋后樣品混合反應(yīng)后測(cè)得OD517值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1酒精發(fā)酵及正交試驗(yàn)

在酒精發(fā)酵過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了蔗糖加入量（10 g/100 mL、12 g/100 mL、14 g/100 mL、16 g/100 mL、18 g/100 mL）、酵母菌含量（1%、5%、10%、15%、20%）、發(fā)酵溫度（20、23、26、29、32℃）三個(gè)單因素，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，考察桑葚酒精發(fā)酵過(guò)程中總抗氧化能力的變化情況。酒精發(fā)酵過(guò)程單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表1 酒精發(fā)酵過(guò)程單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 酒精發(fā)酵L9(33)正交實(shí)驗(yàn)因素設(shè)計(jì)

2.1.2醋酸發(fā)酵及正交試驗(yàn)

在酒精發(fā)酵的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)考慮酒精發(fā)酵時(shí)間（3、5、7、9、11 d）、醋酸菌含量（0.05%、1%、5%、7%、9%）、發(fā)酵溫度（26、28、30、32、34℃）三個(gè)單因素，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，考察桑葚醋酸發(fā)酵過(guò)程中總抗氧化能力的變化情況。醋酸發(fā)酵過(guò)程單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表4。

表3 醋酸發(fā)酵過(guò)程單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 醋酸發(fā)酵L9(33)正交實(shí)驗(yàn)因素設(shè)計(jì)表

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1酒精發(fā)酵

在單因素?cái)?shù)據(jù)基礎(chǔ)上，以正交水平實(shí)驗(yàn)考慮蔗糖加入量、酵母菌含量、發(fā)酵溫度3水平對(duì)桑葚酒精發(fā)酵過(guò)程總抗氧化能力的影響，尋找最適的酒精發(fā)酵條件，其正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和顯著性分析如表5、表6所示。

表5 酒精發(fā)酵L9(33)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

（續(xù)表5）

表6 酒精發(fā)酵過(guò)程正交試驗(yàn)的F值和顯著性分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以總抗氧化能力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，分析R值，可知三者影響其酒精發(fā)酵的順序?yàn)锳（蔗糖加入量）＞C（發(fā)酵溫度）＞B（酵母菌含量），且條件為蔗糖含量14 g/100 mL，酵母菌含量5%，溫度30℃，可較好的進(jìn)行后續(xù)的醋酸發(fā)酵過(guò)程。

2.2.2醋酸發(fā)酵

在單因素?cái)?shù)據(jù)基礎(chǔ)上，以正交水平實(shí)驗(yàn)考慮酒精發(fā)酵時(shí)間、醋酸菌含量、發(fā)酵溫度3水平對(duì)桑葚醋酸發(fā)酵過(guò)程總抗氧化能力的影響，尋找最適的醋酸發(fā)酵條件，其正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和顯著性分析如表7、8所示。

表7 醋酸發(fā)酵L9(33)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表8 醋酸發(fā)酵過(guò)程正交試驗(yàn)的F值和顯著性分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以總抗氧化能力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，分析R值，可知三者影響其醋酸發(fā)酵的順序?yàn)锳（酒精發(fā)酵時(shí)間）＞B（醋酸菌含量）＞C（發(fā)酵溫度），且條件為酒精發(fā)酵時(shí)間為5 d，醋酸菌含量1%，溫度32℃，可較好的進(jìn)行后續(xù)的桑葚醋提取物分析研究過(guò)程。

2.2.3驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

在正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)桑葚酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵的總抗氧化能力進(jìn)行平行試驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酒精發(fā)酵A2B3C3和醋酸發(fā)酵A1B1C2組合都有較好的總抗氧化能力，其結(jié)果分別為54.45 mg/mL、77.61 mg/mL。從驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵的相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組合對(duì)后續(xù)的自由基清除率實(shí)驗(yàn)是可靠有效的。

2.3 （·OH）自由基消除率測(cè)定結(jié)果

圖1為桑葚醋提取物清除（?OH）自由基的能力。由圖1可以看出，桑葚醋提取物濃度在2～10 mg/mL范圍時(shí)，清除能力隨濃度的提高而增加；在10～12 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，清除能力隨濃度的提高而減少，其提取物濃度達(dá)到10 mg/mL時(shí)，樣品濃度的對(duì)（?OH）自由基消除能力最強(qiáng)，為92.63%，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知桑葚醋提取物對(duì)（?OH）自由基具有很好的清除率，具有較好的抗氧化性能。

圖1 桑葚醋提取物清除（?OH）自由基的能力

圖2 桑葚醋提取物清除DPPH自由基的能力

2.4 DPPH自由基消除率測(cè)定結(jié)果

由圖2可以看出，桑葚醋提取物濃度在2～10 mg/mL范圍時(shí)，清除能力隨濃度的提高而增加；在10～12 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，清除能力隨濃度的提高而減少，其提取物濃度達(dá)到10 mg/mL時(shí)，樣品濃度的對(duì)DPPH自由基消除能力最強(qiáng)，為94.48%，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知桑葚醋提取物對(duì)DPPH自由基具有很好的清除率，具有較好的抗氧化性能。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)以桑葚鮮果為原料，采用人工發(fā)酵的方法，根據(jù)單因素和正交水平實(shí)驗(yàn)，以SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到桑葚酒精發(fā)酵最優(yōu)因素為：蔗糖含量14 g/100 mL，酵母菌含量5%，溫度30℃，在該實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行桑葚醋酸發(fā)酵，可知在酒精發(fā)酵時(shí)間為5 d，醋酸菌含量1%，溫度32℃是其發(fā)酵的最優(yōu)因素。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀獲得桑葚果醋提取物，以紫外分光光度法測(cè)得桑葚醋提取物對(duì)（?OH）自由基和DPPH自由基有較強(qiáng)的清除效果，其清除率分別可達(dá)92.63%、94.48%，同時(shí)通過(guò)（?OH）自由基和DPPH的清除效率佐證了旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀是提取桑葚醋提取物的一種有效方法。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2020: 313.

[2] 金杰, 李志西, 張鋒, 等. 桑葚醋提取物抗氧化性的研究[J]. 中國(guó)釀造, 2005(10): 20-22.

[3] 謝小花, 陳靜, 安曉婷, 等. 桑葚的化學(xué)成分和功效作用研究進(jìn)展[J]. 吉林工程技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào), 2017, 33(9): 85-87.

[4] 孫佳勰, 康文懷, 李慧, 等. 桑葚果酒發(fā)酵過(guò)程中的香氣成分變化[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2020, 36(8): 307-316+201.

[5] 孔燕, 秦凡平, 覃俊, 等. 不同酵母對(duì)桑葚酒品質(zhì)的影響及菌株篩選[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2020, 46(22): 64-70.

[6] 陳麒, 梁艷玲, 伍彥華, 等. 不同廠家的商品活性干酵母對(duì)桑葚果酒發(fā)酵影響的研究[J]. 釀酒科技, 2020(5): 22-26.

[7] 呂行, 黃繼紅, 馮中瑩, 等. 桑葚發(fā)酵工藝及其抗氧化活性[J]. 食品工業(yè), 2019, 40(9): 93-97.

[8] 決登偉, 桑雪蓮. 高壓均質(zhì)對(duì)桑葚汁中抗氧化成分與抗氧化活性的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2017, 38(12): 2261-2265.

[9] 李柏榆, 楊美蓮, 曹建新, 等. 超聲輔助提取桑葚多酚及抗氧化活性分析[J]. 云南民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）, 2017, 26(2): 97-102.

[10] 周麗. 山藥葉中迷迭香酸和黃酮苷元的提取分離與抗氧化活性研究[D]. 中國(guó)礦業(yè)大學(xué), 2016.

[11] 段賓賓. 信陽(yáng)毛尖致香物質(zhì)的提取分離與加香效應(yīng)研究[D]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[12] 姚麗娜. 猴頭菌素的提取、微膠囊制備及其生物活性研究[D]. 浙江工業(yè)大學(xué), 2016.

[13] 王雪涵. 銅綠假單胞菌dsbM基因相關(guān)研究[D]. 南開(kāi)大學(xué), 2012.

[14] 王元, 徐新, 李佳川. 土家藥食資源藤茶黃酮類(lèi)化合物體內(nèi)外抗氧化活性研究[J]. 食品科技, 2020, 45(1): 274-279.

[15] 侯麗娟, 何思魯, 趙翡, 等. 藍(lán)莓醋、石榴醋、桑葚醋抗氧化活性成分的研究與比較[J]. 中國(guó)調(diào)味品, 2016, 41(9): 5-9.

[16] 李榮. 菲律賓蛤仔酶解寡肽抗氧化活性研究[D]. 浙江海洋學(xué)院, 2013.

[17] 張巖巖, 蘇悅. 超聲波輔助提取血橙皮渣中橙皮苷及抗氧化研究[J]. 包裝與食品機(jī)械, 2021, 39(1): 12-17.

[18] 鈕成拓, 李正學(xué), 范林旭, 等. 桑葚果酒發(fā)酵過(guò)程中功能性物質(zhì)的檢測(cè)及其變化情況[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2019, 45(3): 83-88.

Optimization of Mulberry Vinegar Fermentation and Analysis of Antioxidant Capacity of Extract

ZHAO Xin, REN Chao-qin*, DAI Xian-zhi*

（Institute of Resources and Environment, Aba Teacher University, Aba 623000, China）

In this article, potassium ferricyanide reduction method was used to determine the effects of fermentation time, yeast content, acetic acid bacteria content and fermentation temperature on artificial fermentation process of mulberry through the orthogonal experiment results. The experimental results show that the optimal conditions of total antioxidant capacity were sucrose content of 14 g/100 mL, yeast content of 5% and temperature of 30℃. The optimal conditions of total antioxidant capacity in acetic acid fermentation of mulberry were as follows: Alcohol fermentation time was 5 d, acetic acid bacteria content was 1%, temperature was 32℃; Salicylic acid method and DPPH method were used to determine the hydroxyl radical and DPPH radical scavenging activity of Fructose Fruccini Vinegar extract. The scavenging rates were 92.63% and 94.48%, respectively. The experiment analyzed the possible reasons for the change of antioxidant capacity of fermented mulberry vinegar, and provided a theoretical basis for the fermented mulberry vinegar to be a new type of natural antioxidant extracted from plants.

mulberry; fermentation process; antioxidant capacity; free radical

O656.6

A

1009-220X(2022)01-0057-08

10.16560/j.cnki.gzhx.20220108

2021-06-21

2019年四川省阿壩師范學(xué)院省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)S201910646099）；2020年四川省阿壩師范學(xué)院國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)202010646027）。

趙鑫（1998～），男，漢族，四川資陽(yáng)人，本科；主要從事化學(xué)研究。

任朝琴（1982～），女，藏族，四川小金人，副教授；主要從事民族藥物學(xué)研究。

戴先芝（1983～），男，漢族，山東東平人，碩士，副教授；主要從事民族藥物學(xué)研究。