絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路在穿心蓮內(nèi)酯治療心肌缺血/再灌注損傷大鼠中的分子機(jī)制

田俊斌，趙 靜，呂建瑞，羅 斌，馬 磊

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710004)

心肌缺血/再灌注損傷(Myocardial ischemia reperfusion injury，MI/RI)是指冠狀動(dòng)脈的血流在恢復(fù)供應(yīng)之后，心臟的結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙進(jìn)一步加重的現(xiàn)象[1]。西醫(yī)認(rèn)為MI/RI與氧自由基損傷[2]、鈣超載[3]、炎性反應(yīng)[4]、線粒體損傷[5]等有著密切的關(guān)聯(lián)，但目前尚無(wú)成熟有效的技術(shù)或療效確切的藥物防治此病。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療 MI/RI效果較好，優(yōu)勢(shì)明顯[6-7]，但是中醫(yī)藥湯劑在治療MI/RI時(shí)存在有效藥理成分不明確的問(wèn)題，因此采用中藥提取物治療MI/RI是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。目前，研究顯示[8]多種中藥提取物在抑制MI/RI炎性反應(yīng)、降低心肌梗死面積等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，特別是萜類化合物[9-10]。穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide，AG)是從傳統(tǒng)中藥穿心蓮中提取出來(lái)的二萜內(nèi)酯類化合物，具有抗炎、抑菌、抗腫瘤、保護(hù)心血管系統(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)[11]等多種藥理活性。前期研究證實(shí)[12]AG可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，同時(shí)減少心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)MI/RI大鼠的心肌組織，基于其具有調(diào)節(jié)炎癥的作用，而絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Mitogen-activated protein kinase/Extracellular-regulated kinase，MAPK/ERK1/2)信號(hào)通路與炎癥密切相關(guān)，因此我們推測(cè)穿心蓮內(nèi)酯調(diào)節(jié)MI/RI可能與MAPK/ERK1/2信號(hào)通路相關(guān)。為此本研究擬通過(guò)常規(guī)手術(shù)構(gòu)建MI/RI大鼠模型，從MAPK/ERK1/2信號(hào)通路探究AG干預(yù)MI/RI可能的作用機(jī)制，以期為MI/RI的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠共60只，大鼠為SPF級(jí)，體重為180～220 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[SYXK(陜)2018-001]，大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼養(yǎng)間，日常光源為日光燈，光照時(shí)間為12 h，室溫由中央空調(diào)統(tǒng)一控制，溫度控制為 22～26 ℃，濕度也由中央空調(diào)控制，設(shè)置范圍為 45%～55%，所有大鼠均自由攝取食物和自由飲用水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 AG(含量97%，CAS號(hào)：5508-58-7)；銀杏內(nèi)酯B(含量98%，CAS號(hào):15291-77-7)；乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(批號(hào)：CSB-E11324r)；肌酸激酶同工酶(Creatine kinase isoenzymes，CK-MB)試劑盒(批號(hào)：CSB-E14403r)；心肌肌鈣蛋白(cardiac troponin,cTnI)試劑盒(批號(hào)：CSB-E08594r)；丙二醛(Malondialdehyde，MDA)試劑盒(批號(hào)：A003-1-2)；超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)試劑盒(批號(hào)：A001-3-2)；三磷酸腺苷酶(Ca2+-Mg2+-ATP和Na+-K+-ATP) 測(cè)定試劑盒(批號(hào)分別為ml076297和ml076296)；分裂原激活的蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases,p38-MAPK)抗體(批號(hào)：sc-33688)；磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular-regulated kinase，p-ERK1/2)抗體(批號(hào)：4370)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體[批號(hào)：(G-9)sc-365062]；引物購(gòu)于上海生物生工。

1.3 分組與給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，依隨機(jī)數(shù)字表法將其分為六組，每組10只，分別為假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性藥物銀杏內(nèi)酯B干預(yù)組、AG低、中和高劑量組，分組后于次日給予相應(yīng)藥物預(yù)防給藥治療，假手術(shù)組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液1 ml/(kg·d)灌胃給藥，銀杏內(nèi)酯B干預(yù)組給予銀杏內(nèi)酯B 2 mg/(kg·d)灌胃給藥，AG三個(gè)劑量組分別給予25 mg/(kg·d)、50 mg/(kg·d)和100 mg/(kg·d)灌胃給藥，劑量根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道確定[13]，連續(xù)給藥14 d。

1.4 模型制備 參照文獻(xiàn)報(bào)道[14]的方法，于給藥結(jié)束后構(gòu)建MI/RI大鼠模型。模型構(gòu)建時(shí)，所有大鼠均于前夜分批次給予禁食12 h，次日取出采用戊巴比妥鈉麻醉，待麻醉后固定四肢和頭部于解剖板，并將氣管切開(kāi)連接呼吸機(jī)，后由專業(yè)人員操作分離肌肉組織，找到心臟，缺血模型構(gòu)建：用5-0號(hào)絲線在心臟的分支起點(diǎn)處結(jié)扎(方法為冠狀動(dòng)脈左前將支法)，結(jié)扎后密切觀察心電圖，當(dāng)心電圖上顯示有明顯ST段抬高，同時(shí)肉眼可見(jiàn)心肌壁呈現(xiàn)出明顯膨出和發(fā)紺表明缺血構(gòu)建成功，此時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，結(jié)扎30 min；再灌注模型構(gòu)建：結(jié)扎30 min后，關(guān)閉大鼠胸腔，再灌注120 min，同時(shí)心電圖顯示為ST段回落>1/2，表明再灌注模型構(gòu)建成功。假手術(shù)組則只給予開(kāi)胸而不結(jié)扎。

1.5 標(biāo)本采集與相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 血清 LDH、CK-MB和cTnI檢測(cè)：MI/RI模型構(gòu)建成功后，采用10 ml注射器從腹主動(dòng)脈取血，血液收集后，采用低溫高速離心機(jī)4000 r/min離心10 min，離心后收集血清，采用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)LDH、CK-MB和cTnI即可，多余血清放入超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 心肌組織收集方法：血液收集后，即取出心臟，心臟收集后，立即將其切成4小塊(標(biāo)記為a、b、c和d)，其中a小塊用于心肌組織中的相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)，b小塊放入組織固定液中固定后用于病理學(xué)檢測(cè)，c小塊置入RNA保護(hù)液中固定用于RNA檢測(cè)，d小塊置于超低溫冰箱中用于相關(guān)蛋白檢測(cè)。

1.5.3 心肌組織MDA、SOD、Ca2+-Mg2+-ATP和Na+-K+-ATP的檢測(cè)：將a小塊的心肌組織取出并勻漿，完成后離心，收集上清液根據(jù)試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)MDA、SOD、Ca2+-Mg2+-ATP和Na+-K+-ATP含量即可。

1.5.4 心肌組織HE染色：將b小塊心肌組織從組織固定液中取出，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法[15]，依次經(jīng)脫水、透明、切片、封片，蘇木精伊紅染色、封片即完成，完成后采用光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖像，每張切片選取6個(gè)不同的視野。

1.5.5 p38-MAPK和p-ERK1/2蛋白檢測(cè)：從超低溫冰箱中取出d小塊心肌組織，采用總蛋白提取試劑盒按照試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)將心肌組織中總蛋白提取出來(lái)，后將其定量并調(diào)平，每組各取30 μg行SDS-PAGE凝膠電泳，完成后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，依次經(jīng)脫脂牛奶封閉、一抗(p38-MAPK為1∶1000、p-ERK1/2為1∶1000和GAPDH為1∶5000)過(guò)夜孵育、二抗(1∶5000)孵育后暗室曝光洗片、掃描儀掃描收集圖像后，Image J測(cè)算灰度值，結(jié)果以所測(cè)蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，結(jié)果比較分析均符合正態(tài)分布，采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 術(shù)中共死亡7只大鼠，其中5只發(fā)生心率失常，2只大出血，假手術(shù)組、模型組、銀杏內(nèi)酯B干預(yù)組、AG低、中和高劑量組分別死亡0、2、1、1、2和1只。其余造模均成功。

2.2 心肌組織病理學(xué)表現(xiàn) 心肌組織病理學(xué)可見(jiàn)，假手術(shù)組心肌細(xì)胞大小均勻，排列整齊，模型組大鼠心肌纖維斷裂，出現(xiàn)水腫、細(xì)胞排列無(wú)規(guī)則，同時(shí)細(xì)胞間隙增大，與模型組相比，各治療組均有所緩解(圖1)。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：銀杏內(nèi)酯B干預(yù)組；D：AG低劑量組；E：AG中劑量組； F：AG高劑量組

2.3 心功能指標(biāo)比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌梗死面積占心臟總面積百分比(IS/AAR)、血清 CK-MB和cTnI均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，銀杏內(nèi)酯B干預(yù)組和AG低、中高劑量組IS/AAR、CK-MB和cTnI 均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清心功能指標(biāo)LDH、CK-MB 和 cTnI比較

2.4 心肌組織能量代謝指標(biāo)比較 與假手術(shù)組相比，模型組心肌組織能量代謝指標(biāo)Ca2+-Mg2+-ATP和Na+-K+-ATP均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，銀杏內(nèi)酯B干預(yù)組和AG各劑量組上述指標(biāo)均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但AG三個(gè)劑量組和銀杏內(nèi)酯B干預(yù)組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心肌組織能量指標(biāo)Ca2+-Mg2+-ATP和Na+-K+-ATP比較(μmol/mgprot·h)

2.5 心肌組織中MDA和SOD比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織中SOD活力明顯降低，MDA含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，銀杏內(nèi)酯B干預(yù)組和AG低、中和高劑量組大鼠心肌組織 MDA降低，SOD升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠心肌組織抗氧化指標(biāo)MDA和SOD比較

2.6 p38-MAPK和 p-ERK1/2蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌中p38-MAPK蛋白表達(dá)明顯升高，p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，銀杏內(nèi)酯B干預(yù)組和AG三個(gè)劑量組p38-MAPK蛋白表達(dá)降低，p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表4(圖2)。

表4 各組大鼠心肌組織p38-MAPK和p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)比較

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：銀杏內(nèi)酯B干預(yù)組；D：AG低劑量組；E：AG中劑量組； F：AG高劑量組

3 討 論

穿心蓮又名春蓮秋柳，藥性歸心、肺、大腸以及膀胱經(jīng)，是中醫(yī)藥常用的中草藥植株之一。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[16]，穿心蓮具有極高的藥用價(jià)值，特別是其含有多種保護(hù)心血管病的有效藥理活性物質(zhì)，近年來(lái)在心血管病領(lǐng)域得到了較多的研究。AG是從穿心蓮全草或葉中提取的一種二萜內(nèi)酯類化合物，為穿心蓮的主要活性成分。黃志華等[17]構(gòu)建了異丙腎上腺素?fù)p傷的心肌梗死大鼠模型，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予上述大鼠穿心蓮內(nèi)酯注射可有效保護(hù)心功能。此外，我們課題組在前期工作中也發(fā)現(xiàn)，AG可以通過(guò)降低血脂，同時(shí)抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)高脂血癥大鼠MI/RI的心肌組織[12]。

一般而言，血清心肌酶譜的表達(dá)異?？梢耘袛嘈募p傷的嚴(yán)重程度，而代表性的蛋白酶主要有LDH、CK-MB和cTnI等[18]。本課題采用AG預(yù)防給藥干預(yù)MI/RI大鼠，首先評(píng)價(jià)了其對(duì)心肌相關(guān)指標(biāo)的影響。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，AG可以明顯降低MI/RI大鼠血清LDH、CK-MB和cTnI的含量，同時(shí)心肌組織病理學(xué)有明顯改善，這提示AG預(yù)防給藥能夠改善MI/RI大鼠心功能，進(jìn)而保護(hù)心肌。之后我們觀察了AG對(duì)心肌組織能量代謝指標(biāo)Ca2+-Mg2+-ATP和Na+-K+-ATP的影響，Ca2+-Mg2+-ATP和Na+-K+-ATP是心臟發(fā)揮作用的代表因子，二者可直接反應(yīng)心肌的功能[19]，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AG預(yù)防給藥可明顯提高心肌組織能量代謝指標(biāo)Ca2+-Mg2+-ATP和Na+-K+-ATP的表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)心肌。

MI/RI發(fā)生后可引起機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，而在氧化應(yīng)激發(fā)生過(guò)程中蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與其關(guān)系密切，其中與心肌氧化應(yīng)激密切相關(guān)的主要有p38-MAPK和p-ERK1/2兩個(gè)蛋白[20-21]。有研究顯示p38-MAPK和p-ERK1/2可直接反應(yīng)MI/RI心肌的損傷特點(diǎn)，可以作為MI/RI的標(biāo)志[22]。此外p38-MAPK和p-ERK1/2可以直接調(diào)控MDA和SOD的表達(dá)，其中MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，其含量越高表明心肌損傷越嚴(yán)重，而SOD是機(jī)體主要的抗氧化酶，其可有效的清除自由基，進(jìn)而減輕機(jī)體對(duì)組織的傷害[23]。本研究結(jié)果顯示，AG可明顯降低MI/RI大鼠心肌組織 MDA含量，同時(shí)提高SOD活力，這提示AG可通過(guò)降低心肌氧化應(yīng)激進(jìn)而減緩心肌損傷。此外研究結(jié)果還顯示，AG可明顯降低心肌細(xì)胞中p38-MAPK蛋白表達(dá)，同時(shí)升高p-ERK1/2蛋白表達(dá)，提示AG可能通過(guò)調(diào)節(jié)p38-MAPK和p-ERK1/2蛋白進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激，最終減輕MI/RI。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，AG對(duì)MI/RI大鼠心肌具有明顯的保護(hù)作用，同時(shí)改善心肌酶譜相關(guān)表達(dá)，提高心肌組織能量代謝，其作用機(jī)制可能與AG改善p38-MAPK和p-ERK1/2蛋白表達(dá)，進(jìn)而提高心肌抗氧化能力有關(guān)。