還原敏感接枝型兩親性聚氨酯的合成及其膠束性能研究*

陶旺旺 周 瑜 劉靜怡 陳紅祥 趙祖伊

(武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院煤轉(zhuǎn)化與新型炭材料湖北省重點實驗室 湖北武漢 430081)

兩親性聚氨酯具有良好的生物相容性、生物降解性和結(jié)構(gòu)易裁剪性，在水中還可自組裝形成納米膠束，因此在藥物載體領(lǐng)域得到廣泛研究[1-3]。目前用作藥物載體的兩親性聚氨酯以線型結(jié)構(gòu)居多，其自組裝時主要通過各疏水鏈段的物理相互作用聚集成核形成膠束，作用力有限，故注射到血液后其膠束結(jié)構(gòu)易遭破壞，從而出現(xiàn)所載藥物的早釋[4]。研究表明，膠束結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與聚合物的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)密切相關(guān)[5-6]。接枝型兩親性聚合物中親水和疏水鏈段相對集中，因此形成膠束的內(nèi)核較緊密，使得其在剪切和稀釋作用下比線型聚合物更穩(wěn)定[7-8]。如Bláhová等[9]研究發(fā)現(xiàn)接枝型兩親性聚合物膠束具有良好的儲存穩(wěn)定性，且無早釋現(xiàn)象。

除在血液中應(yīng)具有良好的穩(wěn)定性外，載藥體系在病灶部位能及時釋放藥物也是衡量其性能的一個重要指標(biāo)。本研究利用腫瘤細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)濃度較高和雙硫鍵可在GSH作用下被還原的特點[10]，將雙硫鍵引入聚合物，合成了一種具有還原敏感性的接枝型兩親性聚氨酯(PUSS-g-mPEG)，并對其性能進行了研究。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

聚己內(nèi)酯二醇(PCL，Mn＝2 000)、聚乙二醇單甲醚(mPEG，Mn＝1 000)、六亞甲基二異氰酸酯(HDI)、3-巰基丙酸、二苯甲酮(BP)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、2，2-二硫二乙醇、谷胱甘肽(GSH)、1，4-丁烯二醇，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其中PCL使用前需除水；鹽酸阿霉素(DOX·HCl)，分析純，武漢市澳康達生物科技有限公司；三乙胺(TEA)、N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)、四氫呋喃(THF)，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，其中DMAc和THF使用前需除水；牛血清白蛋白(BSA)，生物試劑，上海金穗生物科技有限公司。

1.2 測試與表征

核磁共振氫譜(1H-NMR):采用安捷倫科技(中國)有限公司的DD2-600MHz型核磁共振儀，溶劑為氘代氯仿，四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)。

熒光光譜:采用珀金埃爾默儀器(上海)有限公司的LS55型熒光光譜儀。芘做熒光探針時，激發(fā)波長為300～350 nm，發(fā)射波長為394 nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度分別為5 nm；測量DOX時，發(fā)射波長為500～800 nm，激發(fā)波長為478 nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度分別為10 nm。

凝膠滲透色譜(GPC):采用安捷倫科技(中國)有限公司PL-GPC50型凝膠色譜儀，溫度30℃，流速1 mL/min，溶劑為THF，標(biāo)樣為單分散聚苯乙烯。

膠束粒徑及其電位:采用美國 Particle Sizing Systems(PSS)粒度儀公司的Nicomp 380 ZLS型動態(tài)光散射儀(DLS)，散射角為90°。

1.3 PUSS-g-mPEG的合成

以 PCL、1，4-丁烯二醇、2，2-二硫二乙醇和 HDI為原料，通過預(yù)聚法合成主鏈含有碳碳雙鍵和二硫鍵的聚氨酯 (PUSS-ene)。將PUSS-ene與3-巰基丙酸發(fā)生巰基-烯反應(yīng)得到含羧酸側(cè)基的聚氨酯(PUSS-COOH)后，再與mPEG發(fā)生酯化反應(yīng)，合成具有還原敏感性的接枝型聚氨酯PUSS-g-mPEG。

1.3.1 PUSS-ene的合成

12.00 g PCL溶于5 mL DMAc后，加入4.27 g HDI，80 ℃下反應(yīng)2 h。 再加入0.24 g 2，2-二硫二乙醇反應(yīng)1 h后，繼續(xù)加入1.59 g 1，4-丁烯二醇，反應(yīng)11 h。結(jié)束后，經(jīng)透析、干燥得到白色蠟狀產(chǎn)物，即為PUSS-ene(產(chǎn)率為81.4%)。

1.3.2 PUSS-COOH的合成

將4.36 g PUSS-ene和2.77 g 3-巰基丙酸溶于DMAc后，再加入0.10 g二苯甲酮。在常溫攪拌條件下，使用紫外燈(波長為365 nm)照射6 h。結(jié)束后，經(jīng)透析、干燥得到淺黃色蠟狀物，即為 PUSSCOOH(產(chǎn)率為86.2%)。

1.3.3 PUSS-g-mPEG的合成

將3.10 g PUSS-COOH、5.24 g mPEG 和1.13 g DCC溶于60 mL DMAc后，再加入1.26 g DMAP，在氮氣條件下，于40℃攪拌反應(yīng)30 h。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)透析、真空干燥得到淺黃色蠟狀物，即為PUSS-gmPEG(產(chǎn)率為82.6%)。

1.4 PUSS-g-mPEG的膠束化行為研究

將10 mg PUSS-g-mPEG溶于3 mL THF后，在攪拌條件下逐滴加入20 mL芘分散液中，待THF完全揮發(fā)后，再用芘分散液稀釋得到含芘的一系列聚合物濃度溶液，避光靜置2 d后測其熒光。

1.5 PUSS-g-mPEG膠束的制備及穩(wěn)定性研究

30 mg PUSS-g-mPEG溶于5 mL THF后，攪拌滴加到60 mL pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，待THF完全揮發(fā)后，得到膠束溶液，測其粒徑和電位。

儲存穩(wěn)定性:取10 mL膠束溶液，放置于4℃冰箱中冷藏7 d后，測其粒徑。抗稀釋穩(wěn)定性:取1 mL膠束溶液，稀釋至500 mL，靜置1 h后，測其粒徑。血清穩(wěn)定性:取7 mL膠束溶液，加入2 mL BSA溶液，37℃下振蕩2 h后，測其粒徑。

1.6 PUSS-g-mPEG膠束的還原敏感性研究

取上述膠束溶液，分別加入GSH使其濃度為0(正常血液環(huán)境)、10 μmol/L(細(xì)胞外環(huán)境)和10 mmol/L(細(xì)胞內(nèi)環(huán)境)，于37℃下振蕩24 h后測其粒徑。

1.7 PUSS-g-mPEG膠束的載藥及釋藥性能研究

取6.4 mg DOX·HCl，加入15 mL DMF 和1 滴三乙胺溶解后，再加30 mg PUSS-g-mPEG使其溶解。在攪拌條件下逐滴加到45 mL pH＝7.4 PBS中，再轉(zhuǎn)移至透析袋(MWCO6000)內(nèi)，用pH＝7.4的PBS透析48 h，得載藥膠束PUSS-g-mPEG/DOX。

PUSS-g-mPEG/DOX膠束溶液凍干后，用DMF溶解，測其熒光，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其載藥量和包封率。向PUSS-g-mPEG/DOX膠束溶液中分別加入GSH使其濃度分別為 0、10 μmol/L和 10 mmol/L，轉(zhuǎn)入透析袋(MWCO6000)，并置于37℃、30 mL相應(yīng)GSH濃度的PBS中。每隔一定時間從透析袋外取5 mL樣品用于熒光檢測，并補充相同體積的新鮮緩沖液。根據(jù)DOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出不同時間段內(nèi)載藥膠束對DOX的累計釋放量。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合物的合成及表征

所得聚合物結(jié)構(gòu)用1H-NMR表征，結(jié)果見圖1。

圖1 所得聚合物的1H-NMR譜圖

從圖1可以觀察到PUSS-ene中各個鏈段上氫質(zhì)子的化學(xué)位移。另外，采用GPC測試得到其Mn為13 500，分子量分布指數(shù)為1.65。結(jié)果表明已成功合成PUSS-ene。

圖1 PUSS-COOH中歸屬于碳碳雙鍵的氫質(zhì)子峰已消失，表明 3-巰基丙酸已接枝到聚氨酯。PUSS-g-mPEG的圖中出現(xiàn)了mPEG鏈段亞甲基的氫質(zhì)子化學(xué)位移，說明已成功合成PUSS-g-mPEG；另外根據(jù)1H-NMR圖中各質(zhì)子的峰面積以及PUSS-ene的分子量，可計算出PUSS-g-mPEG中PCL和mPEG 鏈段摩爾比為 1∶2.44，Mn為 25 200。

2.2 PUSS-g-mPEG的膠束化行為

以芘為熒光探針，得到了含芘的一系列不同濃度聚合物溶液的熒光圖譜，再由圖中332 nm與335 nm處的熒光強度之比(I335/I332)對 PUSS-gmPEG濃度的對數(shù)(lgc)作圖，結(jié)果見圖2。

圖2 芘在聚合物溶液中的熒光圖譜(a)及I335/I332-lgc圖(b)

從圖2(a)可以看到，隨PUSS-g-mPEG溶液濃度增加，芘的熒光強度逐漸增強，且其熒光最大激發(fā)峰的位置從332 nm逐漸紅移至335 nm。說明隨著聚合物溶液濃度的增加，芘逐漸從親水環(huán)境轉(zhuǎn)移到了疏水環(huán)境中，表明在水中PUSS-g-mPEG達到一定濃度時可自組裝形成膠束。

由圖2(b)可見，經(jīng)擬合得到其臨界膠束濃度(CMC)為7.74×10-4mg/mL。 PUSS-g-mPEG 具有較低的CMC，表明其在水溶液中易形成膠束，且在血液循環(huán)中可具有良好的抗稀釋穩(wěn)定性。

2.3 PUSS-g-mPEG膠束及其穩(wěn)定性研究

利用DLS儀對PUSS-g-mPEG膠束粒徑及其電位進行了測試。測得膠束粒徑約為186 nm，分散指數(shù)約為0.18，粒徑分布較均一。說明PUSS-g-mPEG可自組裝形成納米膠束，有利于其在血液循環(huán)中通過高滲透長滯留效應(yīng)聚集到腫瘤部位，以減少藥物在正常組織的聚集而產(chǎn)生毒副作用。且PUSS-gmPEG膠束在pH＝7.4 PBS中的電位為-0.94 mV，其微弱的負(fù)電荷可與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜以及血清成分產(chǎn)生靜電排斥作用，有助其在血液中長效循環(huán)。

為了進一步表征PUSS-g-mPEG膠束在生理條件下的穩(wěn)定性，在體外分別進行抗稀釋穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性和血清穩(wěn)定性測試，結(jié)果見圖3。

圖3 PUSS-g-mPEG膠束的穩(wěn)定性試驗

由圖3可知，膠束在4℃下放置7 d或加入BSA后，其粒徑幾乎沒有變化；當(dāng)膠束濃度稀釋到1/500倍后，其粒徑變化不大，分布仍然較集中。說明PUSS-g-mPEG膠束具有良好的穩(wěn)定性，這可能與接枝型結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其膠束疏水內(nèi)核纏結(jié)較緊密以及表面帶微弱的負(fù)電荷有關(guān)。PUSS-g-mPEG膠束優(yōu)異的穩(wěn)定性可延長其在體液中的循環(huán)時間，有助于增加其在腫瘤部位的聚集，從而提高療效。

2.4 PUSS-g-mPEG膠束的還原敏感性研究

在模擬正常血液(pH＝7.4 PBS)和細(xì)胞內(nèi)外GSH 濃度(0、10 μmol/L、10 mmol/L)條件下，采用DLS儀測試了PUSS-g-mPEG膠束的粒徑及其分布，以此衡量其還原敏感性，結(jié)果見圖4。

圖4 PUSS-g-mPEG膠束在不同條件下的DLS圖

當(dāng)PBS中 GSH濃度為 0或 10 μmol/L時，PUSS-g-mPEG膠束的粒徑基本一致；當(dāng)PBS中GSH濃度增大為10 mmol/L時，膠束粒徑分布呈現(xiàn)雙峰，有較大粒子出現(xiàn)。說明在正常生理條件或細(xì)胞外GSH濃度較低時，PUSS-g-mPEG膠束具有良好穩(wěn)定性；而在細(xì)胞內(nèi)GSH濃度較高時，由于GSH的還原作用使聚合物中二硫鍵斷裂，導(dǎo)致膠束解離，并重新聚集產(chǎn)生較大粒子，表明膠束有良好的還原敏感性。

2.5 PUSS-g-mPEG膠束的載藥與釋藥性能研究

經(jīng)計算得到PUSS-g-mPEG膠束對DOX的包封率和載藥量分別為11%和1.9%。在37℃下PUSS-g-mPEG/DOX的體外釋藥結(jié)果見圖5。

圖5 PUSS-g-mPEG/DOX膠束的體外釋藥情況

在pH＝7.4的PBS中，純DOX在24 h內(nèi)的累積釋放量為84%，而載藥膠束的累積藥物釋放量為23%，說明在正常生理條件下聚合物載藥膠束無明顯早釋。當(dāng)釋藥體系中GSH濃度分別為10 μmol/L和10 mmol/L時，60 h內(nèi)載藥膠束對DOX的累計釋放量為41%和86%?？梢?，在GSH濃度為10 mmol/L時PUSS-g-mPEG載藥膠束的釋藥速率明顯增大，表現(xiàn)出良好的還原敏感釋藥性能，可實現(xiàn)對DOX的控制釋放。

3 結(jié)論

通過預(yù)聚法、巰基-烯反應(yīng)和酯化反應(yīng)合成了具有還原敏感性的接枝型兩親性聚氨酯PUSS-gmPEG。PUSS-g-mPEG可自組裝形成納米膠束，在模擬生理條件下表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。該膠束對DOX具有一定的包載能力，相對于不含GSH或GSH濃度為10 μmol/L時，其載藥膠束在GSH濃度為10 mmol/L時釋藥速率明顯增大，表明 PUSS-gmPEG/DOX載藥膠束具有良好的還原敏感釋藥性能。