“丙二酸對琥珀酸脫氫酶競爭性抑制作用”實驗的改進(jìn)及分析★

陳舒麗，鄧秋紅，黎威巍，金科華，劉漢才

（湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部，湖北 咸寧 437100）

酶的抑制劑是與酶結(jié)合使酶催化活性降低或消失，但酶分子不發(fā)生變性的一類化合物。根據(jù)抑制劑與酶是否共價結(jié)合，可將酶的抑制作用分為可逆性抑制作用和不可逆性抑制作用[1]。競爭性抑制作用是可逆性抑制作用的一種，即抑制劑與底物競爭同一酶的活性中心，使底物分子無法與酶的活性中心結(jié)合，從而抑制酶的活性。競爭性抑制劑的抑制程度取決于抑制劑與酶的相對親和力和抑制劑與底物濃度的相對比例[2]。當(dāng)抑制劑濃度不變時，抑制程度隨底物濃度的增加而減弱，最終可以通過加大底物濃度，消除競爭性抑制劑的抑制作用[3]。

丙二酸對琥珀酸脫氫酶競爭性抑制作用是生物化學(xué)實驗里面的一個研究酶的抑制作用的經(jīng)典實驗。琥珀酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)過程中一個重要的酶，能催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，脫下的2H 由輔基FAD 接受還原成FADH2，然后琥珀酸氧化呼吸鏈將2H 傳遞給氧生成水[4]。丙二酸與琥珀酸結(jié)構(gòu)類似，是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑，如果有丙二酸存在時，此酶的活性受到抑制。丙二酸與琥酸脫氫酶的親和力遠(yuǎn)大于琥珀酸本身對它的親和力，當(dāng)丙二酸濃度僅為琥珀酸濃度的1/50 時，酶的活性便被抑制50%[5]，因此抑制作用很強(qiáng)。實驗中用甲烯藍(lán)（MB）作為受氫體。在隔絕空氣的條件下,脫下的氫被藍(lán)色的甲烯藍(lán)接受還原成無色的甲烯白（MBH+H），在總的反應(yīng)體系體積相同時，通過觀察甲烯藍(lán)顏色消退的快慢來衡量反應(yīng)體系內(nèi)部脫氫反應(yīng)的快慢，同時判斷丙二酸對琥珀酸脫氫酶活性的抑制程度。

該實驗傳統(tǒng)做法實驗結(jié)果欠佳、現(xiàn)象不明顯，從而影響了實驗成功率。為了更有效、經(jīng)濟(jì)地開展該實驗，針對以上實際問題，在以往教學(xué)研究的基礎(chǔ)上，對實驗進(jìn)行了一些改進(jìn)，并取得了良好的效果。

1 傳統(tǒng)的競爭性抑制作用實驗

1.1 實驗器材

手術(shù)剪；玻璃研缽；離心機(jī)；恒溫水箱。

1.2 實驗試劑

1/15 mol/L（pH=7.4）磷酸緩沖液；0.2 mol/L 琥珀酸溶液：稱取琥珀酸23.62 g，加蒸餾水溶解后定容至1000 mL；0.02 mol/L 丙二酸溶液：稱取丙二酸22.92 g，加蒸餾水溶解后定容至1 000 mL；0.01%甲烯藍(lán)溶液；液體石蠟。

所用磷酸鹽、琥珀酸、丙二酸、甲烯藍(lán)等試劑均為市售化學(xué)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實驗步驟[6]

取小白鼠一只，頸椎脫臼法處死，取出肝臟，約1.5 g，加入7 mL pH=7.4 磷酸緩沖液，充分研磨至糊狀。將肝勻漿離心，取上清液備用，此即含琥珀酸脫氫酶的肝糜液。取試管5 支，按第8 頁表1 操作。

將上述各管搖勻，于各管滴加液體石蠟隔絕空氣（第8 頁圖1），置37℃水浴中保溫，隨時觀察各管甲烯藍(lán)褪色情況，記錄時間。

圖1 反應(yīng)前各管顏色

1.4 實驗結(jié)果

按表1 操作，重復(fù)3 次，實驗結(jié)果見第8 頁圖2（第一支試管完全褪色時拍攝）。

圖2 各管顏色變化情況

表1 酶的競爭性抑制作用

各管開始褪色，時間見表2，37℃水浴后開始計時。褪色時間依次延長，反應(yīng)最快的第一支試管在水浴20 min 后開始褪色。

表2 各試管開始褪色時間

1.5 實驗分析

隨著抑制劑濃度的增大，酶的活性逐步降低，5支試管褪色時間依次延長，與理論分析相一致。

1.6 實驗缺陷

在傳統(tǒng)實驗過程中，由于未將琥珀酸和丙二酸溶液的pH 調(diào)至7.4，因此在各試管中加入了pH=7.4的磷酸緩沖液來調(diào)節(jié)溶液的pH 及整個反應(yīng)體系的體積。但是加入磷酸緩沖液后，各個試管的pH 不盡相同且偏低。經(jīng)測定，5 支試管的pH 分別為6.3、6.1、6.6、6.4、和6.9。pH 不同，導(dǎo)致酶的催化活性不同；pH 偏低，導(dǎo)致酶的活性下降。而且由于磷酸緩沖液加入體積較大，導(dǎo)致肝糜液中酶的濃度降低，所以催化速度較慢，各試管褪色時間較長。盡管試管1 中未加抑制劑，但退色完全時仍長達(dá)20 min。長時間觀察，容易產(chǎn)生視覺疲勞，且更易產(chǎn)生煩躁情緒，不利于實驗的開出。

2 競爭性抑制實驗的改進(jìn)

2.1 實驗器材

實驗器材同1.1。

2.2 實驗試劑

1/15 mol/L（pH=7.4）磷酸緩沖液；0.2 mol/L 琥珀酸溶液（pH=7.4）：稱取琥珀酸23.62 g 加蒸餾水600 mL，用5 mol/L NaOH 調(diào)pH 至7.4，再加蒸餾水至1000 mL；0.02 mol/L 琥珀酸溶液（pH=7.4）：0.2 mol/L琥珀酸溶液（pH=7.4）稀釋10 倍；0.2 mol/L 丙二酸溶液（pH=7.4）：稱取丙二酸22.92 g，加蒸餾水600 mL；用5mol/LNaOH 調(diào)pH 至7.4，再加蒸餾水至1000mL；0.02 mol/L 丙二酸溶液（pH=7.4）：0.2 mol/L 丙二酸溶液（pH=7.4）稀釋10 倍；0.01%甲烯藍(lán)溶液；液體石蠟。

所用磷酸鹽、琥珀酸、丙二酸、甲烯藍(lán)等試劑，均為市售化學(xué)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

2.3 改進(jìn)的競爭性抑制實驗的過程

肝糜液的制備同1.3。取試管5 支，按表3 操作。

表3 改進(jìn)的酶的競爭性抑制作用

將各管搖勻，加石蠟封住液面（圖3），放入37℃水浴保溫，記錄時間。

圖3 反應(yīng)前各管顏色

2.4 實驗結(jié)果

按表3 操作，重復(fù)3 次，實驗結(jié)果見第9 頁圖4（第一支試管完全褪色時拍攝）。從圖4 中可以看到，5 支試管依次褪色，梯度明顯。1 號試管藍(lán)色完全褪去；2 號試管還有少許藍(lán)色；3、4、5 褪色逐漸減少，顏色越來越深。

圖4 各管顏色變化

各管開始褪色時間見第9 頁表4（37℃水浴后開始計時）。褪色時間依次延長，反應(yīng)最慢的第5 支試管在水浴后15 min 開始褪色。

表4 各試管開始褪色時間

2.5 實驗分析

隨著抑制劑濃度的增大，酶的活性逐步降低，5支試管褪色時間依次延長，與理論分析一致。與改進(jìn)前相比較，時間縮短了近20 min。改進(jìn)前及改進(jìn)后統(tǒng)計學(xué)分析如第9 頁圖5，可以看出改進(jìn)前后時間變化具有明顯的差異性。

圖5 改進(jìn)前、后各管褪色時間

3 討論

在改進(jìn)的實驗過程中，第一個改進(jìn)是將琥珀酸和丙二酸溶液的pH 調(diào)至7.4，這樣就使整個反應(yīng)體系的酸堿度維持在pH=7.4，使酶在最適pH 下進(jìn)行催化，保證了酶的最高活性，因此各管反應(yīng)速度明顯增快，褪色時間變短，每支試管開始褪色時間都比原來提前了將近20 min。此項改進(jìn)將實驗時間縮短，學(xué)生不易產(chǎn)生視覺疲勞和煩躁情緒，有利于實驗的開出。

本項實驗的第二個改進(jìn)是將肝糜液的加入量減少，由原來的1.0 mL減至0.5 mL。經(jīng)筆者反復(fù)實驗，發(fā)現(xiàn)用0.5 mL的肝糜液就可將甲烯藍(lán)完全還原，溶液由藍(lán)色變成肉紅色。在傳統(tǒng)實驗中，一只小鼠只能供一組實驗使用，經(jīng)過改進(jìn)，一只小鼠可以供兩組實驗使用。此項改進(jìn)既節(jié)省了原材料和試劑的用量，又減少了經(jīng)費的支出，同時培養(yǎng)了學(xué)生節(jié)約的意識。

本項實驗的第三個改進(jìn)是加大了底物與抑制劑的濃度比。丙二酸對琥珀酸脫氫酶的親和力較大，當(dāng)丙二酸濃度僅為琥珀酸濃度的1/50 時，酶的活性便被抑制50%。在傳統(tǒng)的實驗中，第2、3、4 試管中琥珀酸與丙二酸的濃度比分別為20∶1、10∶1 和5∶1，在改進(jìn)的實驗中，濃度比分別為10∶1、1∶1 和1∶10。二者的濃度比達(dá)到1∶10 時，也能觀察到抑制作用，更好地體現(xiàn)了丙二酸對琥珀酸脫氫酶的抑制作用。

本項實驗的第四個改進(jìn)是將甲烯藍(lán)定量，由4滴改為0.2 mL。由于滴管口徑大小不同，每一滴的量也不同。加入不同量的甲烯藍(lán)，可能會導(dǎo)致各試管褪色時間產(chǎn)生較大誤差。經(jīng)筆者反復(fù)實驗，發(fā)現(xiàn)0.2 mL比較合適，不僅可以完全接受琥珀酸脫下的氫，而且也不存在過量問題，經(jīng)過一段時間之后，各試管均能褪色。

另外，第5 支試管沒有底物，理論上不褪色，為何經(jīng)過一段時間后也開始褪色（如圖6）。筆者認(rèn)為是由于肝臟里面存在一定量的琥珀酸和其他的脫氫反應(yīng)。由于肝臟是從活體組織取出，且所處體系pH=7.4，跟體內(nèi)環(huán)境相差不大，所以細(xì)胞內(nèi)的一些代謝活動仍在進(jìn)行。因此第5 支試管即使不加底物，最終也會褪色。至于要加多少丙二酸才能完全抑制酶的活性，溶液不會褪色，筆者同樣進(jìn)行了多次實驗，發(fā)現(xiàn)當(dāng)0.2 mol/L 丙二酸加至1 mL，即丙二酸濃度達(dá)到0.1 mol/L 時，溶液便不再褪色。

圖6 反應(yīng)完畢各試管褪色情況

4 結(jié)語

經(jīng)過上述優(yōu)化，丙二酸對琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制作用的實驗教學(xué)取得了良好的效果。實驗設(shè)計更加科學(xué)化、合理化，實驗成本減小，實驗成功率也得以提高。