細胞焦亡在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的腹主動脈瘤形成中的作用研究

姚弈偉，劉亞峰，陳淦一，王曉棣，陳鑫

近年來，腹主動脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）已成為嚴(yán)重威脅公眾健康的疾病。吸煙、男性、年齡（＞60歲）、家族史、其他心血管疾病均可能是其發(fā)生的危險因素［1-3］。既往研究表明，AAA是一種慢性血管并發(fā)癥，其病理特征為血管平滑肌細胞耗損［4］，細胞外基質(zhì)降解加速［5］，腎素-血管緊張素系統(tǒng)活化［6-8］，活性氧積累［9］，炎性細胞浸潤［10］，從而導(dǎo)致主動脈壁弱化。然而，雖然炎癥和細胞死亡是該病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素，但其具體調(diào)控機制尚不完全清楚。目前，除了有風(fēng)險的開放手術(shù)或血管內(nèi)介入治療，尚無有效的藥物來阻止AAA的進展。

動脈粥樣硬化一直被認為是AAA發(fā)展的主要因素，越來越多的證據(jù)表明，細胞死亡和無菌性炎癥在很多方面促進了AAA的進展［11-12］。細胞死亡基本上可分為程序性細胞死亡和非程序性細胞死亡，其中細胞焦亡作為一種促炎性的程序性細胞死亡已被證明在多種心血管疾病發(fā)展中具有特異性作用。既往研究表明，細胞焦亡通過促進血管壁彈性層的破壞，在AAA的進展中發(fā)揮重要作用［13］。研究發(fā)現(xiàn)，與非AAA患者相比，AAA患者血液循環(huán)中白細胞的NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達水平升高，而NLRP3蛋白表達水平則降低［14］。另有研究也發(fā)現(xiàn)，AAA患者腹主動脈中Caspase-1蛋白和NLRP3 mRNA表達水平升高［15-16］。本研究旨在分析細胞焦亡在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的AAA形成中的作用，以期為AAA的藥物治療提供新的靶點和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞 本實驗時間為2019年9月至2021年9月。動物實驗均按照南京醫(yī)科大學(xué)機構(gòu)動物護理與使用委員會批準(zhǔn)的指導(dǎo)方針進行。50只野生型小鼠購自南京大學(xué)模式動物研究所，均為8～12周齡C57BL/6小鼠，雄性，體質(zhì)量20～25 g，飼養(yǎng)并繁殖于南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院動物實驗中心，實驗期間小鼠可自由飲水、進食，照明采用自然晝夜光照，室溫控制在21～23 ℃，空氣相對濕度控制在45%～55%。小鼠主動脈血管平滑肌細胞（MOVAS）購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 動物實驗

1.2.1 小鼠AAA模型建立及腹主動脈超聲檢查 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后稱重并用耳標(biāo)標(biāo)記，按照抽簽法隨機分為對照組（n=24）和血管緊張素Ⅱ組（n=26）。所有小鼠吸入異氟烷麻醉，在肩胛骨中部皮下植入滲透微型泵（ALZET，模型2004，ALZA Corp，USA），注入0.9%氯化鈉溶液（對照組）或血管緊張素Ⅱ（Sigma，A9525）（血管緊張素Ⅱ組），以1 mg·kg-1·min-1的劑量持續(xù)灌注28 d。28 d后采用超高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)（visual-sonic，Canada，型號：Vevo 2100型，配備30 MHz換能器）進行腹主動脈超聲檢查，取腹主動脈縱切面進行測量。

1.2.2 腹主動脈組織切片的制備 灌注28 d后，記錄小鼠體質(zhì)量，過量注射苯巴比妥鈉處死小鼠，仰臥位固定于小鼠解剖臺。打開小鼠胸腔和腹腔，從心臟左心室灌注0.9%氯化鈉溶液，持續(xù)至肝臟變白，徹底清洗殘存血液，分離主動脈，在體式顯微鏡下分離動脈周圍脂肪組織，盡可能去除干凈而不損傷動脈，拍照留存。修剪并固定好檢測所需的腹主動脈組織，放入包埋框中，流水低流量沖洗60 min以上，梯度乙醇脫水后再用二甲苯及石蠟浸潤。固定完成后，將腹主動脈組織放入專用石蠟包埋模具內(nèi)進行包埋，注意盡量避免產(chǎn)生氣泡。預(yù)冷石蠟切片機后將石蠟塊固定于夾座內(nèi)，根據(jù)不同實驗要求選擇不同厚度（一般為5～10 μm）進行標(biāo)本切片。將切片以45°傾斜角度放入45 ℃左右的恒溫水箱表面，等到切片完全展平在恒溫水中后（10～15 s）用鑷子將切片一邊撥到載玻片上，將載玻片垂直提起，并使用鉛筆在載玻片末端的磨砂玻璃上寫上樣品的編號，放入55～60 ℃的烤箱內(nèi)烘烤30～60 min或37 ℃晾干過夜，切片放入切片盒中保存在4 ℃冰箱中備用。

1.2.3 腹主動脈組織HE染色、馬松三色染色及VVG染色 將石蠟切片放入烤箱內(nèi)以55 ℃烘烤30 min，二甲苯浸潤脫蠟后用梯度乙醇復(fù)水，甩干切片上的水分后浸泡在蘇木素染液中10 min，用蒸餾水輕輕沖洗以清除切片上的浮色。后將切片浸入1%稀鹽酸中，見組織由紫色變?yōu)榉奂t色即可，蒸餾水清洗，再浸泡于伊紅染液中1 min，蒸餾水沖洗，梯度乙醇脫水后二甲苯浸泡，最后用中性樹脂封固，封好的切片置于通風(fēng)櫥內(nèi)吹干即可長期保存使用，切片在奧林巴斯SZ61顯微鏡下放大100倍觀察腹主動脈組織管腔及動脈壁情況。

馬松三色染色烤片及脫蠟水合過程同HE染色。將載玻片上的水分盡量甩干并用濾紙擦拭，用免疫組化筆在待測標(biāo)本周圍畫圈，滴加1滴馬松復(fù)合染色液染色5 min，蒸餾水沖洗后再滴加1滴磷鉬酸染色5 min，甩干并擦干切片表面水分，直接滴加1滴苯胺藍染色5 min，蒸餾水稍沖洗，滴加1滴分化液分化30～60 s，用蒸餾水稍沖洗后再滴加1滴分化液分化30～60 s。脫水及封固步驟同HE染色，切片在奧林巴斯SZ61顯微鏡下放大100倍觀察腹主動脈組織彈力纖維破壞情況。

VVG染色烤片及脫蠟水合過程同HE染色。將載玻片上的水分盡量甩干并用濾紙擦拭，用免疫組化筆在待測標(biāo)本周圍畫圈，滴加1滴Lugol碘液孵育5～10 min，流水沖洗5 min，再滴加1滴硫代硫酸鈉處理3～5 min，流水沖洗5 min后用70%乙醇脫色1～3 min，滴加1滴醛品紅染液染色5～10 min，70%乙醇浸洗2次，流水沖洗5 min，滴加1滴橙黃G染液染色1 s，流水沖洗5 min。脫水及封固步驟同HE染色，切片在奧林巴斯SZ61顯微鏡下放大200、400倍觀察腹主動脈組織膠原纖維沉積情況。

1.2.4 免疫熒光染色觀察腹主動脈組織細胞焦亡相關(guān)蛋白（NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18）表達情況 取材后的小鼠腹主動脈組織置入塑料小盒內(nèi)，將OCT包埋劑適量浸沒腹主動脈組織，放入液氮中，OCT包埋劑完全凝固后放入-80 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩Ｔ诒鶅銮衅瑱C內(nèi)將腹主動脈組織切片，切片完成后，室溫放置20～30 min，4 ℃多聚甲醛固定15～25 min，PBS洗滌5～10 min，共洗滌3次。在37 ℃下用3% H2O2孵育5～10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，再用山羊工作血清室溫封閉腹主動脈組織切片60 min，滴加一抗NLRP3（1∶100，AG-20B-0014-C100，Adipogen）、GSDMD（1∶100，ab219800，Abcam）、Caspase-1（1∶100，22915-1-AP，Proteintech）、IL-18（1∶100，ab71495，Abcam），將切片放在加入PBS的免疫組化濕盒，4 ℃孵育過夜。第2天先將免疫組化濕盒室溫復(fù)溫30 min，PBS洗滌5～10 min，共洗滌3次。在腹主動脈組織切片上滴加適宜濃度的免疫熒光二抗〔Alexa Fluor 488 chicken anti-rabbit IgG （H+L）（A21441，Invitrogen）、Alexa Fluor 488 chicken antimouse IgG（H+L）（A21220，Invitrogen）、Alexa Fluor 594 chicken anti-rabbit IgG （H+L）（A21442，Invitrogen）、Alexa Fluor 546F （ab'） goat anti-mouse IgG （H+L）（11018，Invitrogen）〕，并置于專用暗盒中于37 ℃孵育30～60 min。二抗孵育結(jié)束后，PBS洗滌5～10 min，共洗滌3次。用Hoechst工作液（10 μg/ml）染核，避光室溫靜置3～5 min，PBS洗滌5～10 min，共洗滌3次，用甘油溶液封固，在奧林巴斯SZ61顯微鏡下放大100倍觀察NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18蛋白表達情況。

1.3 細胞實驗

1.3.1 DMEM及血管緊張素Ⅱ處理MOVAS及細胞總蛋白提取 將MOVAS接種于6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞密度增殖達到70%時，更換不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基饑餓處理細胞24 h后分別加入DMEM（對照組）或血管緊張素Ⅱ（1 μmol/L）（血管緊張素Ⅱ組），培養(yǎng)24 h后收集細胞。棄去PBS上清液，提前將蛋白酶抑制劑（包括：磷酸化和非磷酸化）和RIPA裂解液按1∶100比例配置成混合液，然后向培養(yǎng)板中添加適量混合液，用掛子將培養(yǎng)板底部的MOVAS團吹打混勻呈懸液后將其轉(zhuǎn)移至EP管中，于冰上放置30～60 min后裂解細胞結(jié)束，裂解期間每隔5 min需充分混勻EP管中的細胞懸液，時間20～40 s。細胞冰浴裂解結(jié)束后，12 000×g離心20 min（4 ℃）。離心結(jié)束后，用移液器將EP管中的上清液吸至新的EP管中，采用BCA法提取細胞總蛋白，實驗獨立重復(fù)10次。

1.3.2 Western blotting法檢測MOVAS中NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18蛋白表達水平 蛋白裂解液經(jīng)十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）處理，然后印跡到PVDF膜上，用5%的BSA封閉2 h。加入一抗〔NLRP3（1∶1 000，AG-20B-0014-C100，Adipogen）、GSDMD（1∶1 000，ab219800，Abcam）、Caspase-1（p20）（1∶1 000，22915-1-AP，Proteintech）、IL-18（1∶1 000，ab71495，Abcam）、GAPDH（1∶5 000，HRP-60004，Proteintech）〕，并在4 ℃孵育過夜。次日，加入抗兔IgG（1∶500，7074P2，cell signaling technology）或抗小鼠IgG（1∶500，bs-0296G-HRP，biss）并在室溫下孵育2 h。洗滌后使用化學(xué)發(fā)光檢測試劑（WBKLS0500，Millipore）顯影，計算目標(biāo)蛋白表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 14.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腹主動脈超聲檢查及腹主動脈組織HE染色、馬松三色染色、VVG染色結(jié)果 灌注28 d后，對照組小鼠均無動脈瘤形成，血管緊張素Ⅱ組小鼠發(fā)生動脈瘤，主要發(fā)生于腹主動脈的腎上區(qū)，以膨出和透壁血栓為特征，見圖1。腹主動脈超聲檢查顯示，血管緊張素Ⅱ組小鼠腹主動脈較對照組明顯擴張，見圖2。HE染色顯示，血管緊張素Ⅱ組小鼠的腹主動脈管腔較對照組擴大，動脈壁變薄，見圖3。馬松三色染色和VVG染色顯示，血管緊張素Ⅱ組小鼠彈力纖維降解，與AAA形成相關(guān)的膠原沉積明顯增多，見圖4～5。

圖1 對照組和血管緊張素Ⅱ組小鼠灌注28 d后腹主動脈大體形態(tài)Figure 1 General morphology of abdominal aorta of mice in control group and angiotensin Ⅱ group at 28 days after perfusion

圖2 對照組和血管緊張素Ⅱ組小鼠灌注28 d后腹主動脈超聲檢查結(jié)果Figure 2 Doppler ultrasound results of abdominal aorta of mice in control group and angiotensin Ⅱ group at 28 days after perfusionn

圖3 對照組和血管緊張素Ⅱ組小鼠灌注28 d后腹主動脈組織HE染色結(jié)果（×100）Figure 3 Results of HE staining of the abdominal aorta of mice in control group and angiotensin Ⅱ group at 28 days after perfusion

圖4 對照組和血管緊張素Ⅱ組小鼠灌注28 d后腹主動脈組織馬松三色染色結(jié)果（×100）Figure 4 Results of Masson staining of the abdominal aorta in control group and angiotensin Ⅱ group at 28 days after perfusion

圖5 對照組和血管緊張素Ⅱ組小鼠灌注28 d后腹主動脈組織VVG染色結(jié)果（×200、×400）Figure 5 Results of VVG staining of the abdominal aorta in control group and angiotensin Ⅱ group at 28 days after perfusion

2.2 免疫熒光染色觀察腹主動脈組織NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18蛋白表達情況 免疫熒光染色顯示，血管緊張素Ⅱ組小鼠腹主動脈組織NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18蛋白表達增加，見圖6。

圖6 對照組和血管緊張素Ⅱ組小鼠灌注28 d后腹主動脈組織NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18蛋白的表達情況（免疫熒光染色，×400）Figure 6 The expression of NLRP3，GSDMD，Caspase-1 and IL-18 proteins in the abdominal aorta of mice in control group and angiotensin Ⅱgroup at 28 days after perfusion

2.3 Western blotting法檢測MOVAS中NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18蛋白表達水平 對照組和血管緊張素Ⅱ組MOVAS中IL-18蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；血管緊張素Ⅱ組MOVAS中NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖7。

圖7 Western blotting法檢測對照組和血管緊張素Ⅱ組MOVAS中NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18蛋白表達水平Figure 7 Expression level of NLRP3，GSDMD，Caspase-1 and IL-18 proteins of MOVAS detected by Western blotting in control group and angiotensin Ⅱ group

表1 對照組和血管緊張素Ⅱ組MOVAS中NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18蛋白表達水平比較（±s，n=10）Table 1 Comparison of NLRP3，GSDMD，Caspase-1 and IL-18 protein expression levels in MOVAS between control group and angiotensin Ⅱgroup

表1 對照組和血管緊張素Ⅱ組MOVAS中NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18蛋白表達水平比較（±s，n=10）Table 1 Comparison of NLRP3，GSDMD，Caspase-1 and IL-18 protein expression levels in MOVAS between control group and angiotensin Ⅱgroup

組別 NLRP3 GSDMD Caspase-1 IL-18對照組 0.144±0.075 0.469±0.118 0.486±0.118 0.848±0.110血管緊張素Ⅱ組 0.450±0.069 0.631±0.079 0.835±0.152 0.985±0.122 t值 -3.803 -2.543 -3.442 -1.634 P值 0.005 0.039 0.011 0.141

3 討論

主動脈瘤表現(xiàn)為主動脈的永久性瘤樣擴張，如果表現(xiàn)出破裂通常導(dǎo)致死亡。由于對分子機制和病理生理過程的不完全理解，經(jīng)證實沒有藥物治療可以預(yù)防任一類型主動脈瘤的擴張或破裂。既往研究強調(diào)慢性血管炎癥過程與平滑肌細胞死亡之間有關(guān)，認為這是AAA的重要組織病理學(xué)特征［17-18］。這種慢性炎癥被認為是由組織損傷和危險信號觸發(fā)的無菌性炎癥，而不伴有微生物感染。研究表明，動脈瘤直徑與炎癥浸潤程度之間存在時間相關(guān)性，提示炎性細胞可能參與了動脈瘤壁的破壞，從而促進了AAA的擴張［19］。在侵入血管壁后，炎性細胞被認為能夠合成多種蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），這些蛋白酶能夠降解結(jié)締組織成分，并且使巨噬細胞向主動脈壁的浸潤增加，從而使血管彈力纖維斷裂，動脈壁變薄，管腔逐漸擴大［20］，本研究觀察到小鼠在血管緊張素Ⅱ刺激下動脈壁的變化與其一致。

細胞焦亡是一種伴有炎性反應(yīng)的程序性細胞死亡，是導(dǎo)致血管平滑肌細胞缺失的主要原因之一。細胞焦亡由NLRP3、Caspases家族和GSDMD等蛋白質(zhì)復(fù)合體相互作用完成［21］。細胞焦亡的形態(tài)表現(xiàn)為細胞膜孔的形成、細胞腫脹、破裂及炎性物質(zhì)的釋放［22］。這種損傷可以通過激活鄰近細胞的模式識別受體而被放大和加重，導(dǎo)致促炎遞質(zhì)釋放到細胞外［23］。平滑肌細胞的焦亡參與了AAA的形成，血管平滑肌細胞可遷移到血管內(nèi)皮，在不同刺激下由收縮型向增殖型、合成型轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生膠原和細胞外基質(zhì)［24］。NLRP3炎性小體由三部分組成：NLRP3、pro-Caspase-1和凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）［25］。在病原體相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式的觸發(fā)下，NLRP3的pyrin結(jié)構(gòu)域與ASC的pyrin結(jié)構(gòu)域結(jié)合，進而通過卡片-卡片相互作用與前體Caspase-1結(jié)合，導(dǎo)致NLRP3炎性小體的組裝［26］。Caspase-1被激活后，產(chǎn)生無生物活性的前體蛋白IL-1β和IL-18，并被裂解為具有生物活性的細胞因子，然后被分泌出細胞［27］。IL-1β和IL-18的分泌和成熟是GSDMD裂解所必需的，而GSDMD是細胞焦亡的執(zhí)行者，可以導(dǎo)致細胞膜孔的形成，從而分泌炎性遞質(zhì)，進而觸發(fā)細胞焦亡［22，28］。本研究分別通過動物實驗及細胞實驗檢測了血管緊張素Ⅱ刺激下細胞焦亡相關(guān)蛋白的表達變化。在動物實驗中，通過皮下植入滲透型微泵并注入血管緊張素Ⅱ以構(gòu)建AAA模型，通過免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ灌注的野生型小鼠其細胞焦亡相關(guān)蛋白表達較對照組明顯增加。在細胞實驗中，在MOVAS中加入血管緊張素Ⅱ刺激24 h后檢測其細胞焦亡相關(guān)蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)除了IL-18外其余蛋白表達水平較對照組均明顯增加。上述結(jié)果表明，血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的AAA模型小鼠中細胞焦亡的發(fā)生加劇，從而導(dǎo)致細胞膜孔的形成，引起細胞腫脹、破裂，炎性物質(zhì)被釋放到細胞外，加劇主動脈壁的無菌性炎性反應(yīng)，進而導(dǎo)致主動脈發(fā)生瘤樣擴張。

然而，本研究也存在一定的局限性。首先，血管緊張素Ⅱ輸注建模是目前應(yīng)用最廣泛的誘導(dǎo)AAA模型的方法之一，但其不能模擬AAA的確切病理，還需使用其他廣泛應(yīng)用的誘導(dǎo)模型，如氯化鈣。其次，本實驗只檢測了血管緊張素Ⅱ刺激后細胞焦亡相關(guān)蛋白表達變化，并未研究敲除或抑制這幾種細胞焦亡相關(guān)蛋白后對AAA發(fā)生發(fā)展的影響，這也是今后進一步研究的方向。

綜上所述，血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的AAA形成與細胞焦亡密切相關(guān)，細胞焦亡可通過促進炎性細胞浸潤導(dǎo)致血管壁彈性層被破壞，這在AAA的進展中發(fā)揮重要作用。

作者貢獻：姚弈偉進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，研究的實施與可行性分析，撰寫論文，統(tǒng)計學(xué)處理；姚弈偉、劉亞峰進行資料收集；姚弈偉、陳淦一進行資料整理；王曉棣進行論文的修訂；陳鑫負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。