1，6-二磷酸果糖口服液對急性心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡、氧化應(yīng)激和能量代謝的影響及可能機制研究

王青偉，李悅，劉強，3，劉業(yè)發(fā)，夏昆，4，丁榮晶

流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，近年來我國急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患病率呈上升趨勢［1］，隨著急診再灌注治療技術(shù)的推廣，AMI急性期患者死亡率降低，但5年后心力衰竭發(fā)生風(fēng)險仍高達15%～30%［2］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，心肌梗死后心肌缺血缺氧導(dǎo)致心肌細胞代謝異常，發(fā)生細胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥，引起心肌細胞壞死和纖維化，進而導(dǎo)致左心室重構(gòu)，而左心室重構(gòu)是心肌梗死后心力衰竭的主要原因［3-4］。目前，控制左心室重構(gòu)的藥物主要針對心肌纖維化，包括β-受體阻滯劑和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)抑制劑。但也有研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)心肌能量代謝類藥物可減輕心肌缺血缺氧［5-6］。1，6-二磷酸果糖（fructose-1，6-diphosphate，F(xiàn)DP）注射液在臨床應(yīng)用多年，大量研究證實其可以減輕缺血缺氧導(dǎo)致的心肌損傷［7-8］，但FDP口服液是否具有上述作用尚未知。本研究旨在探究FDP口服液對AMI大鼠心肌細胞凋亡、氧化應(yīng)激和能量代謝的影響及可能機制，以期為FDP口服液用于AMI后心肌保護提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗時間為2020年12月—2021年6月。選取SPF級雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量200～220 g，20日齡，購于北京維通利華公司實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（京）2019-0010。

1.2 主要實驗儀器與試劑

1.2.1 主要實驗儀器 BL-420S型小動物生物功能實驗系統(tǒng)、HX-100E型小動物呼吸機購自成都泰盟科技有限公司，石蠟切片機購自德國Leica，鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9055A）、電熱恒溫水浴槽購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，光學(xué)顯微鏡（Olympus，BX53）購自北京普瑞賽司儀器有限公司，超凈工作臺購自北京昌平長城空氣凈化設(shè)備工程公司，熒光酶標儀購自美國Thermo Scientific，微量加樣器購自法國Gilson，脫色搖床購自海門市其林貝爾儀器制造公司，電泳儀購自北京百晶生物技術(shù)有限公司，低溫離心機購自德國Sigma，SDSPAGE電泳系統(tǒng)、ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Bio-rad，凝膠成像系統(tǒng)購自美國UVP。

1.2.2 主要實驗試劑 FDP口服液購自北京華靳制藥有限公司，HE染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒、TUNEL凋亡檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，蛋白提取液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE預(yù)制膠套裝試劑盒及二抗購自北京MDL，中等蛋白分子量marker購自北京Thermo，磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-AKT）、β-actin抗體購自北京Bioss，聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（0.22 μm）購自美國Millipore，3MM 濾紙購自美國Whatman，ATP、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）含量試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 模型制備及分組 將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)CURAJ等［9］方法構(gòu)建AMI模型：腹腔注射2%戊巴比妥鈉（3 ml/kg）麻醉大鼠，經(jīng)口氣管插管并連接動物呼吸機輔助呼吸，在大鼠左側(cè)胸壁第3～4肋間處備皮、開胸，暴露心臟，于左心耳根部下方2～3 mm處用6-0縫合線結(jié)扎左前降支。結(jié)扎后左心室前壁及心尖部變白，心電圖提示ST段抬高，即AMI造模成功。術(shù)畢，形成胸腔負壓，逐層關(guān)閉胸腔后肌肉注射2.5×104U青霉素以預(yù)防感染。將建模成功后存活24 h的12只大鼠隨機分成模型組、FDP組，每組6只，術(shù)后第3天開始給藥，其中FDP組予以FDP口服液1 ml灌胃，模型組予以等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，連續(xù)給藥21 d。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 HE染色檢測心肌組織形態(tài)學(xué)特征 連續(xù)給藥21 d后處死大鼠，在心臟梗死區(qū)的相同截面處切取心肌組織，并置于4%多聚甲醛中固定，PBS沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成5 μm大小的石蠟切片。烘烤、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，按常規(guī)方法進行HE染色，光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)特征。

1.4.2 Masson染色檢測心肌組織纖維化程度及心肌膠原面積 取石蠟切片，烘烤、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，按照Masson染色試劑盒操作說明書進行處理，光鏡下心肌纖維呈紅色、膠原纖維呈藍色，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析。計算心肌膠原面積，心肌膠原面積（%）=膠原纖維面積/（膠原纖維面積+心肌纖維面積）×100%。

1.4.3 TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡率 取石蠟切片，烘烤、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，按照TUNEL染色試劑盒操作說明書進行處理，其中綠色熒光細胞核為凋亡的心肌細胞，由4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染的藍色細胞核為總細胞，計算心肌細胞凋亡率，心肌細胞凋亡率=凋亡的心肌細胞數(shù)量/總心肌細胞數(shù)量×100%。

1.4.4 比色法檢測心肌組織中ATP、SOD、MDA含量取左心室心肌組織并稱重，按比例加入0.9%氯化鈉溶液制成10%勻漿液，3 000 r/min離心10 min（離心半徑16 cm），取上清液，按照試劑盒說明書，采用磷鉬酸比色法檢測ATP含量，采用黃嘌呤氧化酶比色法檢測SOD含量，采用硫代巴比妥酸比色法檢測MDA含量。

1.4.5 Western blotting法檢測心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達水平 提取心肌組織蛋白，采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，蛋白定量為5 mg/ml，加蛋白上樣Buffer，進行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)移至PVDF膜。隨后將轉(zhuǎn)移好的膜（參考目的條帶分子量大小）對照marker進行裁剪，封閉后在4 ℃環(huán)境下孵育相應(yīng)的一抗（PI3K 1∶1 000；p-AKT 1∶2 000；β-actin 1∶1 000）過夜，隨后在室溫下孵育兔二抗2 h，最后進行顯色和成像。以β-actin作為內(nèi)參，采用Image J軟件分析條帶灰度值，即目標蛋白表達水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料以（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布或方差不齊的計量資料以M（QR）表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織形態(tài)學(xué)特征 HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，體積增大，間隙變寬；FDP組大鼠大部分心肌纖維排列較為整齊，間隙較為清晰，保持了心肌組織相對正常的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，見圖1。

圖1 HE染色檢測模型組和FDP組心肌組織形態(tài)學(xué)特征（×100）Figure 1 Morphological characteristics of myocardium detected by HE staining in model group and FDP group

2.2 心肌組織纖維化程度、心肌膠原面積 光鏡下，模型組大鼠心肌組織纖維化明顯，可見島狀存活的心肌細胞；FDP組大鼠心肌梗死程度明顯減輕，存活的心肌細胞增多，且與模型組大鼠相比，其心肌組織纖維化面積明顯縮小，見圖2。FDP組大鼠心肌膠原面積為（8.35±3.11）%，低于模型組的（24.97±11.30）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.473，P＜0.01）。

圖2 Masson染色檢測模型組和FDP組心肌組織纖維化程度（×100）Figure 2 Degree of myocardial fibrosis detected by Masson staining in model group and FDP group

2.3 心肌細胞凋亡率 FDP組心肌細胞凋亡率為（16.39±5.31）%，低于模型組的（35.68±8.34）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.778，P＜0.01），見圖3。

圖3 TUNEL染色檢測模型組和FDP組心肌細胞凋亡率（×100）Figure 3 Apoptosis rate of cardiomyocyte detected by TUNEL staining in model group and FDP group

2.4 心肌組織中ATP、SOD、MDA含量 FDP組大鼠心肌組織中ATP、SOD含量高于模型組，心肌組織中MDA含量低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 模型組和FDP組心肌組織中ATP、SOD、MDA含量比較（n=6）Table 1 Comparison of ATP，SOD and MDA contents in myocardial tissue between model group and FDP group

2.5 心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達水平 FDP組大鼠心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖4、表2。

表2 模型組和FDP組心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparison of expression levels of PI3K and p-AKT protein in myocardial tissue between model group and FDP group

表2 模型組和FDP組心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparison of expression levels of PI3K and p-AKT protein in myocardial tissue between model group and FDP group

注：PI3K=磷脂酰肌醇-3-激酶，p-AKT=磷酸化蛋白激酶B

組別 PI3K p-AKT模型組 0.26±0.03 0.26±0.03 FDP組 0.51±0.03 0.45±0.02 t值 13.305 11.545 P值 ＜0.001 ＜0.001

圖4 Western blotting法檢測模型組和FDP組心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達水平Figure 4 Expression levels of PI3K and p-AKT protein in myocardial tissue detected by Western blotting method in model group and FDP group

3 討論

AMI是急性心肌缺血缺氧導(dǎo)致的心肌壞死，具有高致死率、高致殘率和醫(yī)療花費昂貴的特點［10］。自1990年以來，我國居民心肌梗死發(fā)病率逐年上升，并呈現(xiàn)年輕化趨勢，已成為公共衛(wèi)生問題和突出的社會問題［1］。雖然目前臨床上有規(guī)范的藥物治療、急診再灌注治療方法，但心肌梗死后心力衰竭仍較常見，且與急性心肌缺血壞死的范圍和缺血缺氧時間密切相關(guān)。因此，臨床上迫切需要尋找新的方法來改善急性心肌缺血缺氧導(dǎo)致的心肌損傷，從而預(yù)防AMI后心力衰竭的發(fā)生。

FDP是醣酵解的中間產(chǎn)物，缺氧情況下其可提供外源性醣酵解的反應(yīng)底物，可在一定程度上增加ATP產(chǎn)量［11-12］。有動物實驗表明，心肌缺血時輸入外源性FDP可避開兩步耗能的磷酸化過程，即己糖激酶和磷酸果糖激酶催化反應(yīng)直接刺激丙酮酸激酶，恢復(fù)被阻斷的旁路代謝，產(chǎn)生比葡萄糖酵解多一倍的ATP，進而改善心肌缺氧狀態(tài)下的能量代謝［13-14］。心肌組織中ATP含量的提高可以逆轉(zhuǎn)缺血心肌細胞的異常代謝，降低心肌氧耗［15］。采用FDP注射液治療缺血性心臟病已有20余年，研究表明，F(xiàn)DP注射液可防止AMI范圍擴大，減輕缺血性心肌損傷及缺血再灌注引起的心肌損傷［7］。

由于FDP注射液需要靜脈輸注，使用不方便，故FDP口服液應(yīng)運而生。FDP注射液和FDP口服液雖然是同一種藥物，但受生物利用度影響，口服液的臨床效果是否和注射液相同有待進一步研究。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，體積增大，間隙變寬；FDP組大鼠大部分心肌纖維排列較為整齊，間隙較為清晰，保持了心肌組織相對正常的結(jié)構(gòu)和形態(tài)。光鏡下，模型組大鼠心肌組織纖維化明顯，可見島狀存活的心肌細胞；FDP組大鼠心肌梗死程度明顯減輕，存活的心肌細胞增多，且與模型組大鼠相比，其心肌纖維化面積明顯縮小。FDP組大鼠心肌膠原面積、心肌細胞凋亡率低于模型組，心肌組織中ATP含量高于模型組，表明FDP口服液可抑制AMI大鼠心肌纖維化及心肌細胞凋亡，改善心肌細胞能量代謝。

研究表明，心肌梗死時心肌缺血缺氧可產(chǎn)生過量的ROS，并使機體抗氧化能力降低［16］。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)DP組大鼠心肌組織中SOD含量高于模型組，心肌組織中MDA含量低于模型組，表明服用FDP口服液后AMI大鼠抗氧化能力增強、心肌氧化損傷減輕。而降低AMI期間心肌組織氧化應(yīng)激水平是延緩心肌細胞損傷、促進心肌細胞再生的關(guān)鍵。此外，ROS還可激活磷脂酶，降解膜磷脂，破壞線粒體結(jié)構(gòu)，降低線粒體膜電位，導(dǎo)致線粒體腫脹和破裂，并將凋亡物質(zhì)釋放到細胞質(zhì)中［16］。

研究表明，PI3K/AKT信號通路能通過抑制心肌細胞凋亡、促進心肌細胞生長、抑制炎癥反應(yīng)、促進血管新生、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子濃度、改善細胞能量代謝等抵抗心肌損傷，同時減緩心室重構(gòu)和心力衰竭的發(fā)生［17-21］；此外，PI3K/AKT/Nrf2信號通路的激活還可減輕腦缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥、凋亡和氧化應(yīng)激，而抑制此通路明顯減弱了其抗氧化、抗炎和抗凋亡活性［22］。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)DP組大鼠心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達水平高于模型組，提示FDP口服液對AMI大鼠心肌細胞的保護機制可能有PI3K/AKT信號通路的參與，但還有待進一步驗證。

綜上所述，F(xiàn)DP口服液可抑制AMI大鼠心肌纖維化、心肌細胞凋亡、氧化應(yīng)激，改善能量代謝，其機制可能與PI3K/AKT信號通路激活相關(guān)，這為減輕急性心肌缺血缺氧損傷和心肌保護提供了新的思路，但具體通路仍需要進一步實驗證實。

作者貢獻：丁榮晶進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責(zé)、監(jiān)督管理；王青偉、夏昆進行研究的實施與可行性分析；王青偉、李悅、劉強、劉業(yè)發(fā)進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析，結(jié)果分析與解釋；王青偉、李悅負責(zé)撰寫、修訂論文。

本文無利益沖突。