2-羥基-3-甲基蒽醌誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡

李玉花 林金蕊 丘金浪 何則沂

(福州市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 福州 350001)

大腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，具有發(fā)病率和死亡率高、5年生存率低等特點(diǎn)〔1，2〕。大腸癌常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)有便血、便秘、腹脹、腹痛、食欲減退等。中醫(yī)藥采用整體觀念、辨證論治等診療思維，在大腸癌的治療中取得了良好的效果。中醫(yī)學(xué)將大腸癌歸為“腸癰”“癥瘕”等范疇，中醫(yī)認(rèn)為大腸癌以脾腎虧虛為本虛，以熱毒、瘀血、濕熱為標(biāo)實(shí)〔3，4〕。臨床上常以清熱解毒、活血化瘀、消腫散結(jié)等中藥用于治療大腸癌〔5〕。研究證實(shí)白花蛇舌草、半枝蓮等清熱解毒類中藥可抑制大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔6～8〕，但對(duì)白花蛇舌草的內(nèi)在成分分析和作用機(jī)理研究較少。2-羥基-3-甲基蒽醌(HMA)是白花蛇舌草中提取出的一種蒽醌類化合物，研究表明HMA明顯抑制白血病、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖〔9～13〕。本研究旨在探討HMA對(duì)大腸癌細(xì)胞株增殖和凋亡的影響并分析其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人大腸癌細(xì)胞株HCT116和HT-29(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))，分別培養(yǎng)在含10%胎牛血清(FBS)的McCoy 5A 培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至融合80%～90%時(shí)，胰酶消化傳代。選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 HMA(相對(duì)分子質(zhì)量：238.24，純度>98%，貨號(hào)：B50996，用DMSO釋稀配制成200 mmol/L母液，-20℃保存?zhèn)溆?，上海源葉生物科技有限公司)；FBS(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；McCoy′s 5A培養(yǎng)基(江蘇凱基生物有限公司)；青鏈霉素混合液和磷酸鹽緩沖液(美國(guó)Hyclone公司)；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-9、caspase-3、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)一抗和羊抗兔二抗(美國(guó)CST 公司)；CCK-8試劑盒和凋亡試劑盒(武漢Abbkine公司)；放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、封閉液、電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影劑(北京索萊寶有限公司)。

1.1.3主要儀器 CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；Countstar全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó)Countstar公司)；流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)BD公司)；離心機(jī)(美國(guó)Eppendorf公司)；電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 人大腸癌細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以3×104個(gè)/ml接種于96孔板，過(guò)夜培養(yǎng)后，加入不同濃度(0、25、50、100 μmol/L)HMA，干預(yù)48 h后每孔10 μl CCK-8溶液混勻，培養(yǎng)箱避光孵育2 h，于450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值。計(jì)算HMA對(duì)大腸癌細(xì)胞的活力，細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組吸光度均值/對(duì)照組吸光度均值)×100%。

1.2.2臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105/ml細(xì)胞接種于12孔板，過(guò)夜培養(yǎng)后分別加入不同濃度(0、25、50、100 μmol/L)的HMA藥物干預(yù)，培養(yǎng)48 h后消化收集細(xì)胞，重懸混勻細(xì)胞后與0.2%臺(tái)盼藍(lán)等體積混合，加入計(jì)數(shù)板中，Countstar全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析細(xì)胞總數(shù)。

1.2.3集落形成檢測(cè)細(xì)胞存活能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2×105/ml細(xì)胞接種于6孔板，過(guò)夜培養(yǎng)后分別加入不同濃度(0、25、50、100 μmol/L)HMA藥物干預(yù)，培養(yǎng)48 h后消化細(xì)胞，以500個(gè)/孔接種于12孔板中，連續(xù)培養(yǎng)8～12 d，每隔3天換1次液，待肉眼看到集落時(shí)終止實(shí)驗(yàn)。棄去12孔板中培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，棄去PBS，加入4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS清洗3遍，棄去PBS，加入0.1%結(jié)晶紫染液避光室溫染色20 min，PBS清洗3遍，干燥后相機(jī)拍照，計(jì)算各組集落數(shù)。結(jié)晶紫染色觀察細(xì)胞集落形成情況，集落形成率(%)=(實(shí)驗(yàn)組集落數(shù)均值/對(duì)照組集落數(shù)吸光度均值)×100%。

1.2.4Annexin V單色染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)后加入不同濃度(0、25、50、100 μmol/L)HMA藥物干預(yù)，48 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，離心后取1×106個(gè)/ml細(xì)胞數(shù)，加入100 μl 1×結(jié)合緩沖液混勻，分別加入5 μl Annexin V(647 nm波長(zhǎng))混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，待細(xì)胞充分結(jié)合Annexin V染液，于1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)樣本至少計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞。

1.2.5Western印跡 按照上述方式HMA干預(yù)后收集細(xì)胞，PBS洗滌后加入含PMSF裂解液，低溫高速離心后吸取上清液即為所需蛋白。二喹啉甲酸(BCA)測(cè)定蛋白濃度后加入50 μg蛋白量上樣電泳跑膠，將膠上蛋白轉(zhuǎn)入聚偏氟乙烯(PVDF)膜后室溫封閉1 h，加入不同抗體(1∶1 000)4℃過(guò)夜孵育。經(jīng)TBST清洗后加入對(duì)應(yīng)二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，經(jīng)TBST洗膜后化學(xué)發(fā)光顯影拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及方差分析。

2 結(jié) 果

2.1HMA對(duì)大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 與0 μmol/L HMA組相比，25、50、100 μmol/L HMA組細(xì)胞存活率及細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2HMA對(duì)大腸癌細(xì)胞存活能力的影響 與0 μmol/L HMA組相比，25、50、100 μmol/L HMA組集落形成率均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

2.3HMA對(duì)大腸癌細(xì)胞凋亡的影響 與0 μmol/L HMA組相比，25、50、100 μmol/L HMA組細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖2。

2.4HMA對(duì)大腸癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 與0 μmol/L HMA組相比，25 μmol/L HMA組HCT116 Bax水平顯著升高，Bcl-2水平顯著降低(P<0.05)；50、100 μmol/L HMA組HCT116和HT-29細(xì)胞酶切caspase-9、酶切caspase-3、Bax水平均顯著升高，Bcl-2水平均顯著降低(均P<0.05)。見(jiàn)圖3，表2。

表1 HMA對(duì)HCT116和HT-29細(xì)胞存活率及細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

圖1 HMA對(duì)HCT116和HT-29細(xì)胞集落形成的影響(結(jié)晶紫染色)

圖2 HMA對(duì)HCT116和HT-29細(xì)胞凋亡的影響

表2 HMA對(duì)HCT116和HT-29細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

3 討 論

大腸癌有惡性程度高、預(yù)后差、病死率高等特點(diǎn)〔1，2〕。盡管手術(shù)治療仍為大腸癌的首選方案，但大多數(shù)就診時(shí)已到中晚期，不能手術(shù)治療，常以放化療或臨床藥物控制，目前臨床常用藥物存在靶點(diǎn)單一、途徑單一且存在毒副作用，影響患者的生存質(zhì)量。而傳統(tǒng)中醫(yī)藥注重整體調(diào)節(jié)，在改善患者臨床癥狀、提高機(jī)體免疫力，預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用〔3〕。研究報(bào)道白花蛇舌草、半枝蓮等清熱解毒類中藥臨床常用于腫瘤、熱癥等疾病治療〔14〕，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)對(duì)大腸癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等具有明顯的抑制作用〔15，16〕。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體常見(jiàn)的正常生理過(guò)程，是生物體細(xì)胞在特定信號(hào)誘導(dǎo)下、凋亡相關(guān)基因調(diào)控下發(fā)生的一種程序性死亡，作用機(jī)制極復(fù)雜〔17，18〕。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是細(xì)胞增殖和凋亡的重要調(diào)控蛋白，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax可形成一個(gè)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，Bcl-2 通過(guò)與Bax 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合形成異源二聚體從而抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔19〕。caspase家族是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白酶系統(tǒng)，在細(xì)胞凋亡機(jī)制中起到重要調(diào)控作用〔20〕，其中caspase-3、caspase-9是caspase家族中參與細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子。一般認(rèn)為caspase-9是參與細(xì)胞凋亡的上游分子，而caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的下游終末剪切酶。當(dāng)caspase-9由于多種因素剪切小片段剪接體部分活化后，引起下游級(jí)聯(lián)酶活反應(yīng)，如caspase-3的激活。被激活的caspase-3裂解相應(yīng)胞質(zhì)胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔21〕。Bcl-2、Bax及caspase-9、caspase-3是與細(xì)胞凋亡進(jìn)程密切相關(guān)的基因，其中caspase-9、caspase-3和Bax激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2表現(xiàn)出抑制凋亡作用〔19〕。