脂聯素對子宮內膜癌KLE細胞株增殖和凋亡的影響

春蓮 吳福林 吳偉樂斯 其勒木格 吳薩仁圖雅 昂和利瑪

(內蒙古民族大學附屬醫(yī)院 1婦科，內蒙 通遼 028000；2胸外科；3內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一臨床醫(yī)學院；4內蒙古民族大學臨床(蒙)醫(yī)學院)

子宮內膜癌是臨床上女性生殖道常見的三大惡性腫瘤之一，約占30%〔1,2〕。近年來由于子宮內膜癌發(fā)病逐漸年輕化且發(fā)病率和死亡率逐年升高，已成為嚴重威脅女性生命健康和生存質量的危險因素〔3,4〕。子宮內膜癌常見的臨床治療方法是手術和激素療法，但因子宮內膜癌細胞的浸潤和轉移能力較強致使患者的治療效果較差，因此尋找更佳治療方案勢在必行〔5,6〕。研究報道脂聯素(APN)對子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展有一定的抑制作用〔7〕，本實驗研究以子宮內膜癌KLE細胞株為研究對象，從細胞增殖、細胞凋亡及其調控通路方面，探究APN對子宮內膜癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑與儀器 子宮內膜癌KLE細胞株購于南京科佰生物技術有限公司；RPMI1640培養(yǎng)液、96孔培養(yǎng)板、6空培養(yǎng)板、25 ml培養(yǎng)瓶和胎牛血清購于Gibco公司；抗菌素、胰酶購于北京鼎國生物有限公司；APN購于美國Sigma公司；抗人的B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、生存素(survivin)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)及蛋白激酶B(Akt)酶聯免疫試劑盒購于南京建成生物有限公司；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購于北京百奧生物技術有限公司；Trizol和實時熒光定量試劑盒購于Thermo公司；引物由Invitrogen公司提供合成。酶標儀購于美國BIOTIC公司；實時熒光定量-聚合酶鏈反應(PCR)儀購于美國MJ Research公司。

1.2實驗分組與給藥 將購買的人子宮內膜癌KLE細胞株使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液置于25 ml培養(yǎng)瓶37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待傳至第三代時分組接種于96和6孔培養(yǎng)板(每組設5個復孔)，實驗分為4組：空白對照組、低劑量APN組(5 μg/ml)、中劑量APN組(10 μg/ml)、高劑量APN組(20 μg/ml)；2 h細胞貼壁后給藥APN 5、10、20 μg/ml。

1.3方法

1.3.1CCK-8試劑盒檢測細胞增殖 人子宮內膜癌KLE細胞株(96孔培養(yǎng)板)給藥APN 5、10、20 μg/ml 48 h后(每組設5個復孔)，采用CCK-8試劑盒，每孔加入CCK-8溶液10 μl，繼續(xù)37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標儀(450 nm)檢測。細胞增殖抑制率=(空白組OD值-實驗組OD值)/空白組OD值×100%。

1.3.2Annexin V-FITC試劑盒檢測細胞凋亡 參照1.3.1(6孔培養(yǎng)板)，消化收集每孔1×105細胞棄掉上清液，采用Annexin V-FITC試劑盒，每個收集管加入200 μl Annexin V-FITC重新混勻懸浮細胞，然后加入10 μl碘化丙啶(PI)液避光室溫染色20 min，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.3凋亡相關蛋白含量檢測 凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、survivin及相關調控通路PI3K、PTEN、Akt的蛋白含量均采用酶聯免疫吸附試驗檢測，設定空白、標準、待測孔，每個樣品設3個復孔，操作嚴格遵循試劑盒步驟。

1.3.4凋亡相關因子和調控通路相關因子mRNA水平的檢測 凋亡相關因子Bax、Bcl-2、Caspase-3、survivin及相關調控通路PI3K、PTEN、Akt的mRNA水平均采用實時熒光定量PCR檢測，經過Trizol提取總RNA、反轉錄合成cDNA、實時熒光定量擴增PCR，用2-ΔΔCt計算mRNA目的基因相對表達水平，取Ct均值。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行χ2檢驗和t檢驗。

2 結 果

2.1不同劑量APN對子宮內膜癌KLE細胞株細胞增殖影響的比較 與空白對照組比較，低、中、高劑量APN組的細胞增殖抑制率均顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

2.2不同劑量APN對子宮內膜癌KLE細胞株細胞凋亡影響的比較 與空白對照組比較，低、中、高劑量APN組細胞凋亡率均顯著升高且呈劑量依賴性(P<0.05)，見表1。

表1 不同劑量APN對KLE細胞株細胞增殖抑制率和細胞凋亡率影響的比較

2.3各組凋亡蛋白含量比較 與空白對照組比較，低、中、高劑量APN組Bcl-2、survivin、PI3K、Akt蛋白含量均顯著降低，Bax、Caspase-3、PTEN蛋白含量均顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見表2。

表2 各組凋亡蛋白水平比較

2.4不同劑量APN對子宮內膜癌KLE細胞株凋亡相關因子和調控相關通路因子的mRNA水平的影響 與空白對照組比較，低、中、高劑量APN組Bcl-2、survivin、PI3K、Akt mRNA水平均顯著降低，Bax、Caspase-3、PTEN mRNA水平均顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見表3。

表3 不同劑量APN對KLE細胞株細胞凋亡和調控相關通路因子mRNA水平的影響

3 討 論

子宮內膜癌患者發(fā)病多為早期發(fā)現，治療比較及時且有效，預后較好，但發(fā)展中國家因為生活水平和醫(yī)療水平的局限性，其患者常發(fā)現較晚，因此死亡率要高于發(fā)達國家，給患者本人及親屬帶來沉重的精神負擔和經濟負擔〔8～11〕。子宮內膜癌的發(fā)生較為多見的原因是環(huán)境和基因因素，其發(fā)展多與細胞過度增殖分化、細胞凋亡減少及信號傳導通路缺陷相關〔12,13〕。APN是脂肪細胞分泌的一種多肽型的激素蛋白，它與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關，特別是對子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展有抑制作用〔14,15〕；CCK-8實驗能檢測細胞增殖分化情況；Annexin V-FITC實驗能檢測細胞凋亡率情況；Bcl-2、survivin是抑制凋亡基因，Bax、Caspase-3是促凋亡基因；PI3K/Akt信號通路中PI3K是原癌基因、PTEN是抑癌基因，Akt是二者下游的靶向效應分子〔1,16～19〕。本研究結果說明APN能抑制子宮內膜癌KLE細胞株的細胞增殖并促進細胞凋亡；通過抑凋亡基因和促凋亡基因的檢測，明確APN能上調促凋亡基因的表達、下調抑凋亡基因的表達；通過刺激PTEN活化，能使PI3K去磷酸化抑制Akt活化，起到抑制腫瘤生長的作用。

綜上，APN抗腫瘤的治療效果，可能與抑制子宮內膜癌KLE細胞株的細胞增殖、促進細胞凋亡、上調促凋亡基因、下調抑凋亡基因及激活PI3K/Akt信號通路密切相關，且隨劑量增加效果更為明顯。