脂肪細(xì)胞外泌體調(diào)節(jié)NOX4/TGF-β1/Smad信號(hào)通路促進(jìn)老年自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化

孔巴提·沙提別克 孟巖 王紅

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院綜合內(nèi)二科，新疆 烏魯木齊 830054)

心肌纖維化是高血壓、心力衰竭、心肌炎等多種心血管疾病發(fā)展到一定階段后常見的病理特征〔1〕，其主要表現(xiàn)為心肌成纖維細(xì)胞異常增殖，細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積，心肌組織中膠原比例增加，導(dǎo)致心肌收縮和舒張障礙〔2〕。高血壓可導(dǎo)致心臟負(fù)擔(dān)加重，引起膠原在細(xì)胞間質(zhì)和血管周圍沉積而加重心肌纖維化〔3〕。已有研究表明，肥胖與心血管疾病密切相關(guān)，且常見于老年高血壓患者，可導(dǎo)致高血壓患者左心室肥大〔4〕，但肥胖對(duì)老年高血壓患者心肌纖維化的影響尚不明確。外泌體是一類由活細(xì)胞分泌的粒徑在50～150 nm的胞外囊泡，可攜帶母細(xì)胞的信息經(jīng)體液運(yùn)輸作用于近端和遠(yuǎn)端組織而影響病理生理進(jìn)程，并且已有研究表明脂肪細(xì)胞外泌體與心力衰竭等心血管疾病密切相關(guān)〔5〕，而其對(duì)老年高血壓患者心肌纖維化的影響尚未有明確報(bào)道，本研究旨在探討脂肪細(xì)胞外泌體對(duì)老年自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1材料 鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；12月齡SHR大鼠10只和12月齡WKY大鼠5只均購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福麥斯生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；cDNA合成試劑盒、qPCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自ABM公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;p-細(xì)胞質(zhì)果蠅蛋白質(zhì)(Smad)、Smad、尼克酰胺腺嘌呤氧化酶(NOX)4、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、山羊抗兔二抗均購(gòu)自CST公司。

1.2脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)與誘導(dǎo) 取液氮保存的3T3-L1前脂肪細(xì)胞于37℃水浴鍋中快速解凍，加入等體積的DMEM培養(yǎng)基稀釋后，1 000 r/min離心5 min，細(xì)胞重懸后于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)80%時(shí)進(jìn)行傳代。將前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞，具體步驟為：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3T3-L1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103個(gè)/ml，接種于12孔板，首先加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基A(每100 ml DMEM培養(yǎng)基加入10 μl 10 mmol/L地塞米松溶液、100 μl 0.5 IBMX溶液、100 μl 10 mg/ml胰島素溶液)誘導(dǎo)4 d，然后換成誘導(dǎo)培養(yǎng)基B(每100 ml DMEM培養(yǎng)基加入100 μl 10 mg/ml胰島素溶液)誘導(dǎo)4 d，然后換成DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3脂肪細(xì)胞外泌體的提取與鑒定 誘導(dǎo)成熟的3T3-L1細(xì)胞使用含10%的無(wú)外泌體胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用差速離心法提取外泌體，具體步驟為：將所收集的細(xì)胞上清分裝到10 ml的離心管中，首先3 000 r/min，4℃離心15 min，去除死細(xì)胞；然后6 000 r/min離心40 min，去除細(xì)胞碎片；10 000 r/min離心1 h，取上清；100 000 r/min離心1 h，收集沉淀即為外泌體，用400 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸外泌體，并放在-80℃保存。

采用透射電鏡觀察外泌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，具體步驟為：稀釋外泌體至蛋白濃度為0.5 mg/ml。將透射電鏡所用的銅網(wǎng)平放到稱量紙上，滴加20 μl上述外泌體溶液，于紅外燈下烘烤10 min；烘干后再滴加2滴磷鎢酸，繼續(xù)烘烤10 min，吸棄多余液體，于投射電鏡下觀察外泌體結(jié)構(gòu)。

Western印跡檢測(cè)外泌體表面生物標(biāo)志物CD9、CD63、腫瘤易感基因(TSG)101，具體步驟為：取100 μl外泌體加入50 μl的放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液，于冰上裂解30 min，12 000 r/min，離心15 min后，取上清，即為外泌體總蛋白。采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取外泌體蛋白裂解液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，經(jīng)轉(zhuǎn)膜，封閉后CD9、CD63、TSG101一抗孵育過(guò)夜，然后二抗孵育，洗膜后，曝光成像。

1.4動(dòng)物分組及給藥 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組(WKY大鼠)、SHR組(SHR大鼠)、exosome組(SHR大鼠)，每組5只。exosome組大鼠尾靜脈注射0.5 μg/μl的成熟脂肪細(xì)胞外泌體溶液100 μl，每周注射1次，對(duì)照組和SHR組注射等體積的生理鹽水，實(shí)驗(yàn)共4 w。

1.5各組收縮壓(SBP)及左心室重量指數(shù)(LVI)測(cè)定 給藥治療前及給藥后分別采用大鼠RBP-1型大鼠尾動(dòng)脈血壓心率測(cè)定儀測(cè)量各組SBP。治療結(jié)束后頸椎脫臼處死，解剖取心肌組織，取左心室稱重，并計(jì)算LVI。

1.6心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)和血管周圍膠原面積(PVCA)檢測(cè) 取左心室中段橫截面心肌組織于組織固定液中固定24 h，取固定后的組織用清水清洗，依次經(jīng)過(guò)70%、80%、90%、95%及無(wú)水乙醇梯度水化后，將組織分2次浸入二甲苯中，每次10 min，然后依次將組織浸入軟石蠟和硬石蠟中各2次，每次30 min，然后將組織浸入石蠟液中，冷卻至凝固，并于切片機(jī)上制備組織切片，制備的切片分別進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色和Masson染色，HE染色用于觀察心肌組織病理變化；Masson染色觀察心肌組織膠原；采用 CISA-1000計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，CVF=膠原面積/總面積；PVCA=壁內(nèi)小動(dòng)脈管腔周圍膠原面積/動(dòng)脈管腔面積。

1.7ELISA檢測(cè)血清炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α 治療結(jié)束后，各組大鼠眼眶取血，室溫靜置1 h后，3 500 r/min，4℃離心15 min，取上層血清，按照ELISA試劑盒方法檢測(cè)血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，主要步驟為：鋪好一抗的96孔板內(nèi)加入40 μl待測(cè)樣品和10 μl生物素標(biāo)記抗體后，在加入100 μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體，37℃孵育75 min，清洗96孔板后加入顯色劑顯色，終止后于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清TNF-α、IL-10、IL-6含量。

1.8心肌組織SOD、ROS、羥脯氨酸檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取各組大鼠心肌組織100 mg，于冰上勻漿均勻后，3 000 r/min離心10 min，取上清液，根據(jù)SOD和ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)各組心肌組織SOD、ROS、羥脯氨酸水平。

1.9qPCR檢測(cè)心肌組織過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ表達(dá) 取液氮保存的心肌組織加入Trizol研磨至組織完全裂解，取研磨液加入200 μl氯仿，靜置5 min后，于12 000 r/min，4℃離心15 min，轉(zhuǎn)移上層水相，加入500 μl異丙醇，12 000 r/min，4℃離心10 min，去上清，1 ml 75%乙醇清洗RNA沉淀后，20 μl RNA-free水重懸RNA沉淀，55℃水浴10 min，即為總RNA。使用primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)PPARγ引物，按照cDNA合成試劑盒和RT-qPCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR，采用ΔΔCT法計(jì)算PPARγ的表達(dá)量。β-actin 上游引物：5′-TATGACTTAGTTGCGTTACACC-3′，下游引物：5′-CCTTCACCGTTCCAGTTT-3′；PPARγ上游引物：5′-TCCGTGATGGAAGACCACTC-3′，下游引物：5′-CCCTTGCATCCT TCACAAGC-3′。

1.10Western印跡檢測(cè)各組心肌組織p-Smad、Smad、NOX4、TGF-β1表達(dá)水平 取各組心肌組織50 mg加入250 μl RIPA裂解液和2.5 μl的苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑，勻漿器在冰上勻漿后12 000 r/min，4℃離心10 min，取上清，即為心肌組織總蛋白。采用BCA蛋白定量，然后蛋白沸水浴加熱變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶對(duì)聚偏氟乙烯(PVDF)膜封閉2 h，然后以1∶1 000比例稀釋后的p-Smad、Smad、NOX4、TGF-β1一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒說(shuō)明書配制發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)30 s，曝光并拍照。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1外泌體鑒定結(jié)果 采用差速離心法提取的外泌體粒徑在50～100 nm，具有“杯托”樣結(jié)構(gòu)，符合外泌體的結(jié)構(gòu)特征；Western印跡檢測(cè)顯示，提取到的外泌體表達(dá)Alix、Tsg101、CD9 3種外泌體標(biāo)志蛋白，見圖1、圖2。

圖1 外泌體投射電鏡拍攝結(jié)果(×100)

圖2 Western印跡檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白

2.2脂肪細(xì)胞外泌體影響老年自發(fā)性高血壓大鼠SBP和LVI 與對(duì)照組比較，SHR組SBP和LVI水平均顯著升高(P<0.05)；與SHR組比較，exosome組SBP和LVI水平均顯著升高(P<0.05)，見表1。提示脂肪細(xì)胞外泌體能夠促進(jìn)SBP和LVI，加重高血壓及心臟損傷。

表1 各組SBP和LVI水平比較

2.3脂肪細(xì)胞外泌體對(duì)各組心肌組織病理變化的影響 HE染色結(jié)果(圖3)顯示，對(duì)照組心肌結(jié)構(gòu)完整、心肌纖維排列整齊、沒(méi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化；SHR組心肌纖維排列不規(guī)則、出現(xiàn)心肌纖維斷裂、心肌細(xì)胞呈肥大狀態(tài)、有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、心肌組織病變明顯；exosome組心肌纖維排列紊亂且疏松，纖維斷裂現(xiàn)象嚴(yán)重，心肌細(xì)胞肥大嚴(yán)重、有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞核分布不規(guī)則，與SHR組相比，心肌組織損傷嚴(yán)重，提示脂肪細(xì)胞外泌體能夠加重老年高血壓大鼠心肌組織病變。

2.4脂肪細(xì)胞外泌體對(duì)各組心肌CVF和PVCA的影響 根據(jù)Masson染色結(jié)果(圖4)，心肌細(xì)胞呈紅色，膠原組織呈綠色，對(duì)照組大鼠心肌組織排列整齊，膠原組織分布稀疏，血管周圍膠原分布較少；SHR組心肌組織排列較整齊，膠原纖維及血管周圍膠原分布較多；exosome組心肌組織中膠原分布大量增加，膠原纖維網(wǎng)斷裂，血管周圍膠原大量增加，提示心肌纖維化嚴(yán)重。相比于對(duì)照組，SHR組CVF和PVCA顯著增加(P<0.05)，提示高血壓能夠誘發(fā)老年大鼠心肌纖維化；相比于SHR組，exosome組CVF和PVCA亦顯著增加(P<0.05)，提示脂肪細(xì)胞外泌體能夠促進(jìn)老年高血壓大鼠心肌纖維化。見表2。

圖3 各組心肌組織HE染色結(jié)果(×200)

圖4 各組大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果(×200)

表2 各組CVF和PVCA水平比較

2.5脂肪細(xì)胞外泌體對(duì)各組血清炎癥因子的影響 相比于對(duì)照組，SHR組IL-6、IL-10、TNF-α水平顯著上升(P<0.05)，相比于SHR組，exosome組血清IL-6、IL-10、TNF-α水平亦顯著上升，見表3，說(shuō)明脂肪細(xì)胞外泌體能夠顯著促進(jìn)老年高血壓大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)。

2.6脂肪細(xì)胞外泌體對(duì)各組心肌組織SOD、 ROS、羥脯氨酸的影響 SHR組心肌組織SOD、 ROS、羥脯氨酸顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明高血壓能夠引起老年高血壓大鼠心肌組織SOD、 ROS、羥脯氨酸含量增加；exosome組心肌組織SOD、 ROS、羥脯氨酸水平亦顯著高于SHR組(P<0.05)，見表4，提示脂肪細(xì)胞外泌體能夠上調(diào)大鼠心肌組織SOD、 ROS、羥脯氨酸水平。

表3 各組IL-6、IL-10、TNF-α水平比較

2.7脂肪細(xì)胞外泌體對(duì)各組心肌組織PPARγ表達(dá)的影響 SHR組心肌組織PPARγ表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，exosome組心肌組織PPARγ表達(dá)量顯著低于SHR組(P<0.05)，見表5，提示脂肪細(xì)胞外泌體能夠顯著抑制PPARγ表達(dá)。

2.8脂肪細(xì)胞外泌體對(duì)心肌組織NOX4、TGF-β1表達(dá)及Smad磷酸化的影響 相比于對(duì)照組，SHR組心肌組織NOX4、TGF-β1表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，Smad磷酸化水平顯著增加(P<0.05)；相比于SHR組，exosome組心肌組織中NOX4、TGF-β1表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，Smad磷酸化水平顯著增加(P<0.05)，見表5，圖5，提示脂肪細(xì)胞外泌體能夠通過(guò)促進(jìn)NOX4/ TGF-β1/Smad而促進(jìn)老年高血壓大鼠心肌纖維化的發(fā)展。

表4 各組SOD、 ROS、羥脯氨酸水平比較

表5 各組PPARγ、NOX4、TGF-β1、p-Smad/Smad水平比較

圖5 各組心肌組織NOX4、TGF-β1表達(dá)及Smad磷酸化檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

心肌纖維化是高血壓等心血管疾病共同的病理變化，心肌纖維化可導(dǎo)致心臟收縮和舒張功能障礙、心力衰竭、心律失常、心室重構(gòu)等〔6〕，因而緩解心肌纖維化是治療心力衰竭和心律失常等心血管疾病的重要措施。已有研究表明，肥胖與冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化的心血管疾病密切相關(guān)，肥胖是高血壓的重要誘因之一，且多發(fā)于老年高血壓患者，控制肥胖能夠有效緩解高血壓〔7〕。外泌體是一類由多種活細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，已有研究表明脂肪細(xì)胞外泌體可影響體內(nèi)代謝〔8〕。本研究結(jié)果說(shuō)明脂肪細(xì)胞可能通過(guò)外泌體而加重心肌纖維化。肥胖是高血壓的危險(xiǎn)因素之一，且肥胖可加重高血壓患者體內(nèi)的炎癥，研究表明，體內(nèi)脂肪代謝異?？蓪?dǎo)致炎癥，進(jìn)而引起血管內(nèi)皮的收縮，并且激活交感神經(jīng)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，進(jìn)而促進(jìn)高血壓的發(fā)展〔9〕，本研究發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞外泌體能夠加重老年高血壓大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)。氧化應(yīng)激與高血壓的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔10〕。氧化應(yīng)激既引起血管壁增厚和血管腔狹窄，又損傷內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，血管舒張性降低，增加血管收縮，引起外周血管阻力增加和血壓升高〔11,12〕，進(jìn)而加重心肌纖維化，本研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞外泌體能夠增加老年高血壓大鼠心肌組織SOD、ROS水平，即加重心肌組織的氧化應(yīng)激。PPARγ 是核受體 PPARs 的一個(gè)亞家族，主要表達(dá)于心肌組織中，可調(diào)控脂類代謝相關(guān)基因的表達(dá)，PPARγ被激活后能夠增強(qiáng)促進(jìn)脂肪酸儲(chǔ)存基因的表達(dá)，例如脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、脂肪酸結(jié)合蛋白等，降低血脂水平及增強(qiáng)脂類代謝，臨床上高血壓與高脂血癥常同時(shí)發(fā)生，相互影響〔13,14〕，本研究結(jié)果提示脂肪細(xì)胞外泌體可能通過(guò)抑制PPARγ的表達(dá)而影響血脂代謝及高血壓的發(fā)生發(fā)展。

NOX4可促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)心臟的纖維化，并且NOX4表達(dá)上調(diào)會(huì)引起TGF-β1表達(dá)上調(diào)，Smad家族蛋白中，Smad2和Smad3是TGF-β1介導(dǎo)纖維化發(fā)生的下游分子，可促進(jìn)心肌組織膠原蛋白的合成〔15～17〕，本研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞外泌體能夠上調(diào)NOX4、TGF-β1及Smad的表達(dá)，即激活NOX4/TGF-β1/Smad信號(hào)通路。

綜上，脂肪細(xì)胞外泌體可治療老年高血壓大鼠體內(nèi)炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)及心肌纖維化，其影響心肌纖維化的機(jī)制為激活NOX4/TGF-β1/Smad信號(hào)通路。