基于“異病同治”理論桂枝加龍骨牡蠣湯治療老年人不寐的作用機制

趙忠偉 李妍 王紀偉 李冬梅

(長春大學特殊教育學院，吉林 長春 130022)

桂枝加龍骨牡蠣湯出自張仲景《金匱要略》，該書記載“夫失精家，少腹弦急，陰頭寒……男子遺精，女子夢交，桂枝加龍骨牡蠣湯主之”原文中，因陰陽兩虛導致的陰陽不交的男子遺精、女子夢交，是該方的主治之證。在老年人群中，不寐的病因病機主要是老年人的臟腑陰陽兩虛導致的陽不入陰、心腎難以相交而致其不寐?！爱惒⊥巍崩碚撌侵嗅t(yī)學治療疾病的常用方法之一，即不同疾病的相同證型可用同一種治療方法。基于上述，在“異病同治”理論的指導下，基于網絡藥理學的桂枝加龍骨牡蠣湯治療老年人不寐作用機制展開新的研究。

1 資料與方法

1.1構建復方中藥、成分、靶點基因網絡圖 將桂枝加龍骨牡蠣湯復方中的桂枝、白芍、生姜、甘草、大棗輸入到TCMSP數據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)收集上述中藥活性化學成分，以藥代動力學原理為依據〔2〕，藥物口服利用率(OB)≥30%，類藥性指數(DL)≥0.18為標準篩選符合條件的化合物〔3〕。在BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb,org/batman-tcm/)數據庫獲取礦物類藥物龍骨、牡蠣可信度高的蛋白作為候選靶點。同時在PubMed搜索相關文獻對成分及靶點等進行有效補充，利用Uniprot(http://www.Uniprot.org/)數據庫對上述預測靶點進行標準化處理。制作復方中藥、活性化學成分、預測靶點基因數據，并將數據導入Cytoscape(V3.7.2)軟件，應用軟件的Network插件，對導入數據進行Degree(度值)分析后，構建中藥、活性化學成分及預測靶點的可視化網絡圖。

1.2獲取老年人不寐靶標基因 基于DisGeNET(人類疾病基因數據庫)網站(https://www.disgenet.org/)與GenesCards(人類基因數據庫)網站(http://www.genecards.org/)，以不寐的英文疾病名稱“insomnia”為關鍵詞，選擇屬性為“Homo sapiens”(智人)篩選疾病靶標。

1.3獲取復方靶點——疾病靶標基因的交集 借助VENNY2.1在線數據分析作圖網站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/)工具，將上述1.1、1.2中的藥物靶點基因與疾病靶標基因進行交集，構建復方靶點基因與疾病靶標基因交集圖。

1.4構建蛋白互作(PPI)分析網絡圖 將1.3中獲得的中藥靶點基因與疾病靶標基因的交集基因導入STRINGV11.5(https://string-db.org/)數據平臺，利用Multiple Proteins by Names做PPI分析，Score值設置為最高0.9，其他均為系統(tǒng)默認值，再將該平臺分析結果導入Cytoscape(V3.7.2)軟件，經過Degree分析后，在Network插件做PPI可視化網絡圖。

1.5GO功能與KEGG富集分析 基于DAVIDV6.8生物信息學資源網站(https://david.ncifcrf.gov/)對篩選的核心靶點進行GO功能與KEGG富集分析〔4〕。在DAVIDV6.8網站中提交71個核心靶點基因，選擇物種為“Homo sapiens”(智人)，選擇P<0.05的分析結果，根據DAVIDV6.8數據庫分析得到的GO功能與KEGG富集結果，在微生信線上服務平臺網站(http://www.bioinformatics.com.cn/)導入DAVIDV6.8分析數據做可視化處理〔5〕。

1.6藥物-代謝產物-疾病靶點-KEGG通路-疾病的可視化網絡構建 為更進一步說明桂枝加龍骨牡蠣湯“異病同治”治療老年人不寐的作用機制，運用Cytoscape(V3.7.2)軟件，將中藥及其有效活性成分對應PPI網絡篩選得到核心靶點及基因通路富集分析所得有效通路及疾病做可視化網絡處理。

2 結 果

2.1復方中藥的有效成分及預測靶點 本文共收集桂枝加龍骨牡蠣湯復方藥物有效活性化學成分151種，其中桂枝7種、白芍13種、生姜5種、甘草92種、大棗29種、龍骨2種、牡蠣3種，合并去重后119種，預測目標靶點276種，桂枝加龍骨牡蠣湯復方各中藥部分有效活性化學成分見表1。

桂枝加龍骨牡蠣湯成分與預測靶點之間作用關系見圖1，圖中綠色圓圈代表復方中藥，不同顏色正六邊形代表中藥的有效成分，其中以A、B、C與數字組合的表示為多種中藥共有的活性化學成分，藍色菱形表示預測靶基因。

2.2疾病相關靶點收集 在DisGeNET和GenesCards數據庫中以“insomnia”為關鍵詞，在DisGeNE選取P值<0.05與老年人不寐相關的靶基因，在GenesCards數據庫中以“Score”的中位數為界值，選取“Score”≥其中位數的基因作為老年人不寐相關的靶基因，兩個數據庫合并去重，共獲得與老年人不寐疾病相關聯靶標基因1 599個。

表1 桂枝加龍骨牡蠣湯藥物部分有效活性化學成分

圖1 復方各中藥成分-預測靶點網絡

2.3繪制復方預測靶點與疾病相關靶標韋恩圖 將桂枝加龍骨牡蠣湯各中藥成分的276個預測靶點與老年人不寐疾病1 599個相關靶標基因數據導入VENNY2.1線上服務平臺，得到桂枝加龍骨牡蠣湯預測靶點與老年人不寐疾病相關靶標交集，共得到交集靶點71個。

2.4PPI分析與網絡構建 將桂枝加龍骨牡蠣湯中中藥活性化學成分預測靶點與老年人不寐疾病靶基因的71個交集靶點導入STRING蛋白互作分析平臺，得到PPI關系圖，見圖2，圖中共有71個節(jié)點，每一個節(jié)點代表一個靶點蛋白，蛋白與蛋白之間的作用關系以直線連接的方式表示〔6〕，網絡連接密度越高說明蛋白與蛋白之間的關系越密切，為進一步篩選核心蛋白提供了理論依據。在STRING數據庫下載可在Cytoscape(V3.7.2)打開的并能作圖分析的數據〔7〕，運用Cytoscape(V3.7.2)插件進行度值(Degree)分析，Degree越高說明該蛋白的關鍵性越強，其中蛋白激酶(AKT1)、白細胞介素(IL)-6、腫瘤細胞壞死因子(TNF)、IL-10、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK3)、 低聚果糖(FOS)、雌激素(ESR1)、TP53、IL-1α、電壓依賴性鈣通道L型(CAV1)、缺氧誘導因子(HIF)1α的Degree≥7，故上述11個基因可能作為桂枝加龍骨牡蠣湯的核心靶點，見圖3，圖中按照Degree的分析結果，圓圈越大、顏色越深，越靠近中間代表其關鍵性越強。

圖2 STRING數據庫PPI網絡圖

圖3 Cytoscape PPI可視化網絡

2.5GO功能與KEGG富集分析 運用DAVIDV6.8數據庫網站，選擇物種為“Homo sapiens”，對11個核心靶標基因進行GO功能和KEGG富集分析，富集條件為P<0.05，其他項目默認原始設置，GO功能富集分析核心基因主要參與蛋白質結合、酶結合、以RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控、DNA模板轉錄正調控、基因表達正調控及炎性反應等。KEGG富集分析得出桂枝加龍骨牡蠣湯異病同治干預老年人不寐主要憑借癌癥通路、乙型肝炎、TNF腫瘤壞死因子通路及MAPK轉運通路等通路完成。把上述數據結果導入微生信線上服務平臺制作GO功能富集分析氣泡圖、KEGG富集分析柱狀圖，見圖4、圖5。圖4橫坐標代表基因數、縱坐標分別BP、CC、MF功能結果，圓圈越大則表示關聯靶點基因數越多，隨著P值由大到小，顏色由綠色向紅色過度，圖5橫坐標代表通路中的基因數，縱坐標表示KEGG通路，顏色隨P值的減小由藍色向紅色過度。

圖4 GO功能富集分析結果

圖5 KEGG富集分析結果

2.6中藥-活性成分-靶點-KEGG通路-疾病的可視化網絡構建 把KEGG通路分析篩選的核心通路、核心靶點基因、有效活性成分及其對應的中藥，整理并構建中藥、成分、靶點基因、通路與疾病關系數據，導入Cytoscape(V3.7.2)軟件中，構建復方中藥-活性成分-靶點基因-通路-疾病可視化網絡圖，見圖6，圖6中綠色圓形代表復方的中藥，不同顏色的正六邊形代表活性成分、藍色菱形代表核心靶點，綠色三角形代表KEGG核心通路的部分通路，凹三焦形則表示疾病，復方中藥、活性成分、靶點基因、通路、疾病之間的關系以直線連接。

圖6 復方中藥-成分-靶點-通路

3 討 論

基于“異病同治”理論與網絡藥理學對桂枝加龍骨牡蠣湯治療老年人不寐的機制分析，發(fā)現桂枝加龍骨牡蠣湯治療老年人不寐的主要化學成分可能是槲皮苷、山奈酚、(+)-兒茶酸等 。槲皮苷其主要成分為槲皮素化學式為C15H10O7，是一種廣泛存在自然界的植物次生代謝物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、抗菌及具有保護心血管作用。有研究〔8〕表明炎癥因子IL-1、IL-6、IL-10在槲皮素的作用下，其表達量可被降低，進而可說明槲皮素具有抗炎的作用，同樣有研究〔9〕表明，在急性痛風性關節(jié)炎大鼠模型中，槲皮素可降低炎癥因子IL-6及TNF的表達而改善大鼠關節(jié)的腫脹程度。山奈酚又稱山奈素或山奈黃酮醇，其分子式為C15H10O6，在可食用的植物中黃酮類化合物其位列第三，山奈酚的藥理作用主要有抗抑郁、抗炎、抗氧化應激、抗腦缺血損傷、抗驚厥、抗癡呆等作用。近年有一項研究〔10〕表明山奈酚及衍生物具有抗炎作用，以脂多糖及大腸桿菌提取物干預BV-2小膠質細胞，使其產生促炎物質TNF-α、IL-6，前列腺素及亞硝酸鹽，山奈酚及衍生物則可顯著的降低炎癥相關蛋白的表達。另一項對四葉草提取物的抗炎作用的研究中，通過高效液相色譜和飛行的時間色譜發(fā)現，四葉草的提取物中的山奈酚衍生物紫云英苷具有明顯的抗炎作用〔11〕。(+)-兒茶酸又名(+)-兒茶素是茶葉的主要活性成分，可有效改善認知功能，調節(jié)細胞通路及細胞凋亡因子的表達，調節(jié)神經遞質水平和炎癥的發(fā)生等。

根據PPI分析蛋白激酶B(AKT)1、IL-6、TNF、MAPK3和ESR1等可能為關鍵靶點基因。AKT1，是AKT信號通路的核心調控因子之一，控制細胞的生長與存活，有研究〔12〕表明：圍絕經期非器質性失眠患者的肝郁分級與匹茲堡睡眠質量指數量表(PSQI)及AKT信號通路(PI3K)/AKT信號通路調節(jié)下的PI3K、AKT、磷酸化(P)AKT的蛋白表達量及其基因含量、IL-1β、TNF-α水平均為中度正相關性。IL-6是細胞炎性因子，在人類的神經遞質調節(jié)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)都有IL-6的參與，國外的一項研究〔13〕顯示，在對失眠患者的血液監(jiān)測時發(fā)現，隨著失眠程度的改變，失眠患者血液中的IL-6的含量也隨之發(fā)生改變，且與失眠的程度呈正相關。針刺聯合足少陽膽經推拿對氣郁質失眠患者，治療后觀察組患者血清IL-6、多巴胺(DA)水平低于對照組，而血清5-HT水平高于對照組，表明針刺聯合足少陽膽經推拿可改善患者睡眠結構，改善其睡眠質量〔14〕。TNF在睡眠-覺醒周期的作用中，在睡眠中樞與覺醒中樞協同作用下，由內分泌、神經及免疫系統(tǒng)的共同參與完成。有研究〔15〕表明TNF可直接作用于下丘腦的上核神經元，通過影響神經、內分泌激素調節(jié)失眠。同樣有實驗表明TNF參與睡眠的免疫調節(jié)中有代表性的細胞因子，內源性的TNF含量變化隨睡眠的變化而呈節(jié)律性的改變〔16〕。MAPK3是MAPK激酶的信號傳導通路的重要組成部分，在細胞外刺激引起的細胞反應級聯中起重要作用。有研究〔17〕指出阿爾茨海默病小鼠的血液中，常伴有MAPK表達的升高，當失眠及焦慮癥狀緩解后，MAPK的表達也隨之降低。Scharfman等〔18〕認為ESR1可以通過作用于表達ER的GABA能中間神經元，促進鄰近神經元腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)的表達，或者通過與位于BDNF基因上的ESR1反應元件相互作用．誘導BDNF的表達。同時，已有多項臨床研究表明BDNF的神經營養(yǎng)功能參與了睡眠的自我平衡調節(jié)過程。根據GO富集分析結果顯示，桂枝加龍骨牡蠣湯基于“異病同治”的理論基礎治療老年人不寐主要涉及與生物過程有關，主要涉及蛋白質結合、轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄調控、DNA模板轉錄正調控等的生物過程。

KEGG通路分析結果得知，桂枝加龍骨牡蠣湯治療老年人不寐可能與癌癥通路、TNF通路、MAPK信號通路等通路有關，上述通路為AKT1、IL-6、TNF、MAPK3和ESR1等核心靶點的主要通路。其中TNF信號轉導通路是由機體重要的細胞因子TNFR-1和TNFR-2誘發(fā)的通路，包括細胞凋亡、細胞存活、炎癥和免疫等作用〔19～21〕。目前越來越多研究推測免疫激活相關的細胞因子分泌與精神類疾病的密切相關，TNF、IL-1β等炎性細胞因子可通過激活下丘腦室旁核中含CRH神經元，促使腺垂體釋放皮質醇信號通路(ACTH)，從而活化下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)，進而導致抑郁癥。同時，HPA軸的失調也是失眠的機制之一。癌癥通路與MAPK信號通路同樣是TNF、AKT1及MAPK3等因子的主要通路，同樣通過細胞的存活、炎癥反應及免疫調節(jié)等生物過程，作用于神經調節(jié)系統(tǒng)，通過調節(jié)與失眠有關的神經遞質5-HT及DA等物質干預失眠。

綜上,本研究基于網絡藥理學技術，構建桂枝加龍骨牡蠣湯“異病同治”的理論治療老年人不寐的方劑-中藥-成分-靶點-通路-疾病的生物網絡，發(fā)現桂枝加龍骨牡蠣湯119種入血成分，71個靶點可能與老年人不寐具有相關性，主要涉及60條相關通路，并根據大量文獻分析，初步探討了桂枝加龍骨牡蠣湯治療老年人不寐的分子機制，體現了中醫(yī)藥組方多成分、多靶點、多途徑的作用特色，為進一步開展探究老年人不寐的分子機制奠定了基礎。