甲狀腺癌組織miR-93-5p、BRMS1L表達(dá)水平及臨床意義研究

熊燕 周穎 蔣桂珍 陳金麗

甲狀腺癌是指甲狀腺上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是世界上生長(zhǎng)最快的癌癥之一。據(jù)報(bào)道，甲狀腺癌的發(fā)病率為3.1%，在所有惡性腫瘤中排名第11 位，死亡率為0.4%。其中，分化型甲狀腺癌的惡性程度、預(yù)后優(yōu)于未分化型，早期治療后生存率一般較高[1]。微小RNA（microRNA，miRNA）是最近新發(fā)現(xiàn)的一類短序列非編碼RNA[2]，成熟的miRNA 可靶向結(jié)合mRNA 3’-UTR 區(qū)，從而對(duì)基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控[3]。其中miR-93-5p 可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖，抑制自然殺傷細(xì)胞的殺傷能力，且在骨髓瘤、多發(fā)性癌和肝細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)增高，對(duì)癌細(xì)胞增殖、凋亡發(fā)揮重要生物學(xué)功能[4]。而乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因1（breast cancer metastasis suppressor 1，BRMS1）是最近研究人員新發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，即隨著腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的增加，其BRMS1 mRNA 的表達(dá)逐漸下降[5～7]。但是，關(guān)于miR-93-5p、BRMS1 相似基因（BRMS1 like，BRMS1L）在甲狀腺癌組織的表達(dá)尚未見到相關(guān)報(bào)道。因此，本研究旨在探討miR-93-5p、BRMS1L 在甲狀腺癌組織的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016 年3 月到2019 年3 月在麗水市人民醫(yī)院和麗水市第二人民醫(yī)院行手術(shù)治療的甲狀腺癌患者150 例，其中男性76 例、女性74 例；年齡18～86 歲；根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)確定臨床分期：Ⅰ期62 例、Ⅱ期50 例、Ⅲ期20 例、Ⅳ期18 例；分化程度：低分化65 例、中分化50 例、高分化35 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移90 例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移60 例。納入標(biāo)準(zhǔn)為：①所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療等其他抗癌治療；②所有取得的組織標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)為：①合并有其他腫瘤或惡性疾病的患者；②存在心、肝、腎等重要臟器功能障礙。本次研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析 利用癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR-93-5p、BRMS1L 基因在甲狀腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)。

1.2.2 免疫組化分析 術(shù)中取患者甲狀腺癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織，迅速置于液氮中保存。將甲狀腺癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織用石蠟包埋，制成4 μm連續(xù)切片，充分烘烤后置于枸櫞酸緩沖液10 min；一抗BRMS1L 單克隆抗體（由北京博奧派克生物科技有限公司生產(chǎn)）4 ℃過夜孵育24 h 后，添加二抗室溫下孵育1 h；二氨基聯(lián)苯胺染色，蘇木精復(fù)染，在顯微鏡下觀察染色情況。觀察BRMSIL的表達(dá)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）檢 測(cè)miR-93-5p 使用PureLink? RNA 微量提取試劑盒（由廣州吉賽生物科技股份有限公司生產(chǎn)）提取甲狀腺癌組織中總RNA 并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。根據(jù)RevertAid RT 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（由廣州吉賽生物科技股份有限公司生產(chǎn)）說明書將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成擴(kuò)增所需模板cDNA。采用Gentier 96E/96R 全自動(dòng)醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)（由西安天隆科技有限公司生產(chǎn)），根據(jù)qRT-PCR 試劑盒說明書進(jìn)行操作，總反應(yīng)體系為10 μ l。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)熱15 min；然后94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。miR-93-5p以U6作為內(nèi)參，用2-△△ct來(lái)計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 染色結(jié)果及判定 顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野，對(duì)細(xì)胞著色部分進(jìn)行記分：細(xì)胞基本未著色為0 分；細(xì)胞著淺黃色為1 分；細(xì)胞著深黃色為2 分；細(xì)胞著棕褐色為3 分。根據(jù)評(píng)分結(jié)果分為兩組：分?jǐn)?shù)＜2 為陰性，即為低表達(dá)水平；分?jǐn)?shù)≥2 為陽(yáng)性，即為高表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入與分析。計(jì)數(shù)資料以例或%表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；使用Log-Rank 檢驗(yàn)miR-93-5p、BRMS1L表達(dá)與患者3 年累計(jì)生存率的關(guān)系。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-93-5p、BRMS1L 基因在甲狀腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平見圖1

圖1 miR-93-5p、BRMS1L基因在甲狀腺癌中的表達(dá)水平

由圖1 可見，TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，甲狀腺癌組織中miR-93-5p 基因表達(dá)水平與癌旁組織比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.73，P＞0.05）；甲狀腺癌組織中BRMS1L 基因表達(dá)水平低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.98，P＜0.05）。

2.2 免疫組化染色見圖2

由圖2 可見，免疫組化染色結(jié)果顯示BRMS1L主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。

圖2 BRMS1L在甲狀腺癌和癌旁組織中的免疫組化染色結(jié)果

2.3 BRMS1L 蛋白表達(dá)水平 BRMS1L 蛋白在甲狀腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為24.00%，明顯低于癌旁組織的63.33%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=47.17，P＜0.05）。

2.4 miR-93-5p 表達(dá)水平 miR-93-5p 在甲狀腺癌組織中的表達(dá)水平為（1.83±0.38），明顯高于癌旁組織（1.00±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=26.31，P＜0.05）。

2.5 miR-93-5p、BRMS1L 表達(dá)情況與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 以甲狀腺癌組織miR-93-5p中位值（1.83）為界，將甲狀腺癌患者分為miR-93-5p高表達(dá)組（111 例）和miR-93-5p 低表達(dá)組（39 例）。miR-93-5p、BRMS1L 表達(dá)情況與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系見表2。

表2 miR-93-5p、BRMS1L與甲狀腺癌臨床病理特征的關(guān)系/例（%）

由表2 可見，miR-93-5p、BRMS1L 表達(dá)情況與甲狀腺癌患者年齡、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度相關(guān)（χ2分 別=9.98、5.18；9.29、3.90；72.44、11.96；24.22、47.55，P均＜0.05），與性別無(wú)關(guān)（χ2分別=0.01、0.00，P均＞0.05）。

2.6 甲狀腺癌組織中miR-93-5p、BRMS1L 表達(dá)水平與患者3 年累計(jì)生存率的關(guān)系 采用電話隨訪或門診隨訪的方式，隨訪時(shí)間從出院日開始，隨訪期限為3 年。甲狀腺癌組織中不同表達(dá)水平的miR-93-5p、BRMS1L 患者的3年累計(jì)生存率見圖2。

圖2 不同表達(dá)水平的miR-93-5p、BRMS1L患者的3年累計(jì)生存率

由圖2 可見，甲狀腺癌組織中miR-93-5p 高表達(dá)組和低表達(dá)組患者3 年累計(jì)生存率分別為65.70%、27.00%，經(jīng)Log-Rank 檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.95，P＜0.05）；甲狀腺癌組織中BRMS1L高表達(dá)組和低表達(dá)組患者3 年累計(jì)生存率分別為31.80%、52.00%，經(jīng)Log-Rank 檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.98，P＜0.05）。

3 討論

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，占每年診斷出的所有癌癥的3.4%。不同人群的發(fā)病率不同[8]。根據(jù)組織學(xué)特征將甲狀腺腫瘤細(xì)分為幾種不同的亞型，最常見的是乳頭狀癌（70%～80%），其次是濾泡癌（10%～20%）、髓樣癌（5%～10%）和間變性癌（2%～10%）。基因突變、拷貝數(shù)變異和DNA甲基化等均與甲狀腺癌發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)[9]。腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的機(jī)制除細(xì)胞復(fù)制增殖信息傳導(dǎo)通路異?；钴S外，還依賴于新生血管形成來(lái)提供營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)生長(zhǎng)。而靶向化療主要通過阻斷腫瘤細(xì)胞增殖信息傳導(dǎo)通路及新生血管生成而發(fā)揮作用。miR-93-5p、BRMS1L主要是通過干擾絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B等信號(hào)通路途徑，并控制腫瘤的增殖活動(dòng)。

miR-93-5p 是與骨髓瘤、肝細(xì)胞癌等惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因[10]，主要參與DNA 損傷反應(yīng)[11，12]。本研究使用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌組織中miR-93-5p 基因表達(dá)水平高于正常組織，qRTPCR 結(jié)果顯示，miR-93-5p 在甲狀腺癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織。本次研究還發(fā)現(xiàn)，miR-93-5p 表達(dá)情況與甲狀腺癌患者年齡、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度相關(guān)；并且甲狀腺癌組織中miR-93-5p高表達(dá)組患者3年累計(jì)生存率65.70%高于低表達(dá)組患者27.00%，提示miR-93-5p 表達(dá)水平與患者部分臨床病理參數(shù)和3年累計(jì)生存率有關(guān)。

BRMS1L 被證明與轉(zhuǎn)移抑制惡性腫瘤密切相關(guān)，轉(zhuǎn)移抑制是BRMS1L 復(fù)合物的核心組成部分。越來(lái)越多的證據(jù)表明BRMS1L 在甲狀腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中起到了重要作用。除此之外，BRMS1L能夠參與調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移的許多過程，包括遷移、侵襲以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究表明，甲狀腺癌組織中BRMS1L陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織，王繼紅等[13]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鼻咽癌組織中BRMS1L 陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁組織，與本研究結(jié)果一致，初步說明，BRMS1L蛋白表達(dá)與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程可能有一定關(guān)聯(lián)。除此之外，BRMS1L 表達(dá)水平與乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，BRMS1L蛋白表達(dá)情況與甲狀腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、年齡、TNM 分期相關(guān)；BRMS1L 高表達(dá)3 年累計(jì)生存率31.80%低于BRMS1L 低表達(dá)的患者52.00%，說明甲狀腺癌患者的BRMS1L表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)及患者3年累計(jì)生存率有密切關(guān)系。

綜上所述，miR-93-5p 在甲狀腺癌組織的水平高于癌旁組織，BRMS1L 在甲狀腺癌組織的水平低于癌旁組織，二者表達(dá)水平均與患者年齡、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)，對(duì)患者3 年累計(jì)生存率有一定的影響。但是本研究樣本量較少，可能存在一定的誤差，后續(xù)還需擴(kuò)大樣本量，繼續(xù)研究。