溫嶺市宮頸炎患者HPV E6/E7 DNA基因分型檢測及分子流行病學調(diào)查

張婷 李蒙佳 陳瑛 郭潔潔

人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）是一類球形雙鏈DNA 病毒，感染后能引起人體皮膚黏膜的鱗狀上皮增殖，主要通過性傳播和密切接觸的方式感染人類。目前已經(jīng)報道的HPV 型別有200余種，根據(jù)侵犯的組織部位和臨床表現(xiàn)分為低危型和高危型兩大類[1，2]。HPV E6/E7 基因是主要的致癌基因，檢測這兩個基因具有靈敏、高效、實用、不易漏檢等特點。流行病學調(diào)查顯示，HPV 感染具有地域性、種族性和多樣性的特點，此外，性生活、免疫功能缺陷或遺傳變異等都會影響HPV 的流行[3，4]。由于不同地區(qū)HPV 感染的基因不盡相同，掌握本地區(qū)HPV 型別的感染情況和流行規(guī)律有利于女性宮頸癌預防和早期篩查。本次研究對就診本院的2 293 例宮頸炎患者HPV E6/E7 進行檢測，分析探討本地區(qū)HPV 感染的分子流行病學特點，為臨床診治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020 年1 月至2021 年8 月于溫嶺市第一人民醫(yī)院門診就診的宮頸炎患者2 293 例，收集其宮頸脫落細胞，年齡15～71 歲，中位年齡41.77 歲?；颊呒{入標準為：①符合宮頸炎診斷標準；②宮頸細胞學檢查無癌前病變。排除標準為：①患有心、肝、腎或血液系統(tǒng)疾??；②精神疾病、結(jié)核病等；③妊娠期、哺乳期婦女。

1.2 方法 將宮頸炎患者宮頸脫落細胞保存液樣本于渦旋混合儀上充分渦旋10 s，取1 ml 保存液樣本于1.5 ml 離心管中，12 000 g 離心5 min，去掉上清液，吸取200 μl 核酸提取試劑加入到樣品管中，然后將樣品管放入100 ℃恒溫金屬浴中保溫15 min，小心取出，以12 000 g 離心10 min，吸取9 μl 上清液進行聚合酶鏈反應擴增。擴增條件為：42 ℃5 min、94 ℃8 min；94 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃1 min，共35 個循環(huán)；最后72 ℃1 min。

采用GenomeLab GeXP 遺傳分析系統(tǒng)分析PCR擴增產(chǎn)物，包括18 種高危型別HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82 和7 種低危型別HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44、HPV81、HPV83。每個樣本孔加入28.7 μl SLS 上樣緩沖液、0.3 μl DNA Size Standard-400、1 μl PCR 產(chǎn)物和1 滴礦物油，將220 μl 分離緩沖液加入到96 孔分離液板的孔中，選擇PCR 毛細管電泳法分離樣本，使用“Default GeXP Analysis Parameters”方法分析樣本。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料采用例（%）形式表示，組間比較采用χ2檢驗。設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV 檢測結(jié)果 2 293 份宮頸炎患者宮頸脫落細胞中共檢出HPV 感染793份，總感染率為34.58%。年齡＜20 歲組HPV 感染率最高，為82.76%；年齡 在21～30歲 組HPV感染率為34.27%；年齡在31～40 歲 組HPV感染率為30.21%；年齡在41～50歲組HPV感染率為35.19%；年齡在51～60歲 組HPV感染率為35.97%；年齡＞60歲組HPV 感染率為58.33%。其中年齡＜20歲組HPV 感染率明顯高于其他年齡組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=51.55，P＜0.05）。

2.2 HPV基因分型檢測結(jié)果見表1

表1 793 例宮頸炎患者HPV基因分型檢出率

由表1 可見，793 例HPV 感染的患者中，高危型占總基因型的81.77%，檢出率前五位的是HPV52、HPV58、HPV16、HPV53 和HPV51。低危型HPV 感染占18.23%，以HPV81 檢出率最高，其次是HPV42。

2.3 HPV感染類型分布和感染率見表2

表2 HPV感染類型分布和感染率

由表2 可見，793 例HPV 感染患者中，單一型別感 染527 例，占66.46%；多重感染266 例，占33.54%，其中以二重感染為主，二重感染又以HPV52+HPV58和HPV52+HPV16較為多見。

3 討論

世界衛(wèi)生組織和國際癌癥研究學會根據(jù)HPV致癌危險性的高低將其分為低危型和高危型兩大類，低危型HPV 主要引起低度宮頸上皮內(nèi)瘤變和皮膚及外生殖道的外生性疣類病變；高危型HPV 除可引起生殖器疣外，更重要的是可引起宮頸癌、高度宮頸上皮內(nèi)瘤變及外生殖器癌[5]。人類是HPV 的唯一宿主，可通過直接或間接接觸污染品或性傳播方式感染，大量的流行病學調(diào)查和實驗室數(shù)據(jù)都表明，持續(xù)的高危型HPV 感染是誘發(fā)宮頸癌和癌前病變的最主要因素[6,7]。

本次研究中，溫嶺地區(qū)2 293 例門診宮頸炎患者篩查出HPV感染率為34.58%，與湖州市女性宮頸炎患者HPV 感染率（33.91%）和哈爾濱市HPV 感染率（36.45%）相近[8,9]，但高于隨機抽取的女性人群HPV 感染率（深圳為21.15%[5]、鄭州為25.9%[10]、山西為14.8%[11]、襄陽為28.8%[12]、臺灣南部為19.3%[13]）及受教育程度較高的女性醫(yī)務工作者HPV 感染率（8.95%）[14]，明顯低于北京地區(qū)女性宮頸組織學異?；颊逪PV 感染率（72.51%）[15]。由此可以看出選擇不同人群調(diào)查研究其HPV 感染率波動較大，而且不同地區(qū)、文化程度、年齡和性伴侶的數(shù)量等都是影響HPV 感染率的潛在因素[16]，所以明確一個地區(qū)HPV 流行的感染率，對本地區(qū)女性生殖道疾病和宮頸癌的預防具有重要意義。HPV 感染會呈現(xiàn)兩個高峰期，第一個高峰期出現(xiàn)在年齡＜20 歲或＜25 歲，隨年齡的增長呈下降趨勢，這可能與性生活活躍有關(guān)，第二個高峰期出現(xiàn)在年齡＞60 歲，這可能與HPV 持續(xù)感染有關(guān)[17,18]。本次研究中觀察到兩個高峰年齡段，感染率較高，同文獻報道一致，但未發(fā)現(xiàn)感染率下降的趨勢，可能與研究對象的篩選有關(guān)，本次研究對象主要來自門診宮頸炎患者，其HPV感染率可能高于隨機抽取女性人群。

流行病學調(diào)查顯示，HPV 感染具有地域性特征，不同地區(qū)所流行的主要型別不盡相同，其中HPV16 是世界范圍內(nèi)最為常見的型別，其他優(yōu)勢型別歐洲為HPV31 和HPV52、南美洲為HPV58、亞洲地區(qū)為HPV58 和HPV52[19]。何健方等[8]研究發(fā)現(xiàn)湖州地區(qū)位于前4 位的HPV 亞型依次為HPV16、HPV58、HPV18、HPV56；義烏地區(qū)主要為HPV16、HPV58、HPV18、HPV33[20]。一項來自廣西的研究顯示其地區(qū)的主要型別為HPV52、HPV16、HPV58、HPV51、HPV53[19]。值得注意的是，雖然本次研究所在地區(qū)與湖州、義烏屬同一個省份，但HPV 感染的型別卻不盡相同，尤其是本市的優(yōu)勢型別中沒有HPV18，說明HPV18 并不是引起本市宮頸癌的主要原因，考慮可能與本地區(qū)流動人口較多、性生活頻繁、初次性生活年齡較小或樣本量有關(guān)，雖然國內(nèi)九價疫苗已上市，但未覆蓋HPV53 和HPV51，今后的疫苗研發(fā)需重視這兩種型別的覆蓋，保護更多的人群。

由于HPV 的不同亞型其編碼的外殼蛋白的基因變異很大，不同的亞型之間基本無交叉免疫保護作用，很容易造成HPV 的多重感染和多次感染。本次研究中HPV 單一感染率較高，為66.46%，多重感染率占33.54%，多重感染以二重感染和三重感染為主，最低為七重感染，且僅檢出2 例。近年來我國HPV 多重感染率在逐年增加[12]，因為HPV 多重型別感染病毒載量高于單一型別感染，其致病風險相當于單一感染風險的1.6 倍。病毒載量越高，則需要自身清除的時間越長，HPV 持續(xù)感染的概率增加，致病能力顯著提高，宮頸病變的風險也會隨之提高。本研究中二重感染以HPV52+HPV58 和HPV52+HPV16 較為多見，明確本地區(qū)多重感染基因型對早期篩查和診治有重要作用，為后續(xù)跟蹤隨訪提供理論依據(jù)。

HPV 是目前人類所有癌癥病變中較為明確的致病因子，宮頸癌也是少有的已經(jīng)明確病因的腫瘤之一[21]。如果患者檢測出HPV 高危型持續(xù)感染，尤其伴有HPV16或HPV18亞型，需要定期對患者進行陰道鏡檢查和宮頸活檢。由于育齡婦女是HPV 感染的易感人群，HPV 感染非常常見，故應對育齡期婦女進行常規(guī)的HPV DNA 檢測，并通過細胞學檢查、陰道鏡檢查和宮頸活檢等技術(shù)盡早阻止癌前病變的發(fā)生，提高廣大婦女的生活質(zhì)量。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個從量變到質(zhì)變的過程，早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療可降低發(fā)病率和死亡率，HPV 基因分型檢測是預防宮頸癌的有效途徑，將在宮頸疾病的篩查和防治中發(fā)揮重要的作用。一個地區(qū)HPV 基因流行譜的建立，可為疫苗的選擇提供理論依據(jù)。本次研究還未涉及男性的HPV 感染的流行病學調(diào)查，將是未來研究的方向。