葡萄糖酸銅和雙硫侖對(duì)SARS-CoV-2 PLpro的抑制作用

王 娟，柳曉春，辛全娟，趙廣健，袁文敏，王一帆，章思語(yǔ)，徐錫明

(1.中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，山東 青島 266003；2.青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東 青島 266100；3.日照市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，山東 日照 276800)

2019年底，新型冠狀病毒肺炎暴發(fā)，并以迅猛的速度在世界范圍內(nèi)傳播，對(duì)全球公民的健康造成很大影響[1]。新型冠狀病毒通過(guò)人與人之間的飛沫或直接接觸而傳播，病毒感染后常見(jiàn)的癥狀是發(fā)熱，并伴有咳嗽，呼吸困難，肌痛和疲勞[2]。SARS-CoV-2是單股正鏈RNA病毒，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白(刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣殼蛋白)以及兩種多聚蛋白(polyprotein 1a and polyprotein 1ab，pp1a和pp1ab)，pp1a和pp1ab被兩種蛋白酶：木瓜樣蛋白酶(papain-like protein，PLpro)和3C樣蛋白酶(3C-like protein，3CLpro)切割成16種非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structure protein，NSPs)，這16種非結(jié)構(gòu)蛋白是新型冠狀病毒基因表達(dá)的關(guān)鍵功能性蛋白[3]。因此，PLpro和3CLpro是抗新型冠狀病毒藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。PLpro是NSP3自裂解產(chǎn)生的一種非結(jié)構(gòu)蛋白，可以水解病毒蛋白多聚體成為功能性的NSPs，在病毒復(fù)制過(guò)程中起關(guān)鍵作用?？剐滦凸跔畈《舅幬锇邢騊Lpro不僅可以在病毒的復(fù)制中起作用，還可以抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，從而抑制非特異性免疫反應(yīng)[4]。另外，泛素(ubiquitin，Ub)和類(lèi)泛素蛋白干擾素刺激基因(interferon-stimulated gene 15，ISG15)都在其C末端帶有LXGG序列，PLpro能夠識(shí)別和水解LXGG序列，將Ub和ISG15從宿主細(xì)胞蛋白中切除，幫助冠狀病毒逃避宿主天然免疫反應(yīng)[5]。

半胱氨酸蛋白酶是一類(lèi)重要的蛋白酶家族，廣泛參與人和動(dòng)物的多種生理過(guò)程。半胱氨酸蛋白酶家族在結(jié)構(gòu)上有著很高的同源性，其催化核心是一個(gè)三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，影響半胱氨酸蛋白酶的蛋白水解活性，在決定酶的特異性方面起著重要作用[6]。PLpro是半胱氨酸蛋白酶家族的一類(lèi)，具有半胱氨酸(Cys)、組氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)催化三聯(lián)體，其中半胱氨酸的巰基是酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)，化合物和巰基反應(yīng)可抑制酶活性[7]。另外，新冠狀病毒與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)基因組有很高的同源性，尤其表達(dá)幾種關(guān)鍵酶的基因非常相似，這為針對(duì)SARS-CoV和MERS-CoV的藥物研究成果直接應(yīng)用到針對(duì)新型冠狀病毒的治療中提供了理論依據(jù)。已有文獻(xiàn)證明，金屬離子和雙硫侖可以抑制SARS-CoV和MERS-CoV的活性[8]。

銅元素是人體內(nèi)必需的微量元素之一，各種組織的代謝都需要銅元素，缺銅易引起貧血、白細(xì)胞減少、生長(zhǎng)緩慢等癥狀，目前臨床上大都使用硫酸銅治療缺銅癥。半胱氨酸蛋白酶的巰基可以與金屬銅離子形成配位鍵，金屬銅已經(jīng)被證明對(duì)半胱氨酸蛋白酶家族的木瓜蛋白酶有很好的抑制效果[9]。雙硫侖(disulfiram，DSF)是一種常見(jiàn)的戒酒藥，是已知的很好的硫醇反應(yīng)化合物，可以共價(jià)修飾甲基轉(zhuǎn)移酶，脲酶的半胱氨酸殘基。雙硫侖對(duì)MERS-CoV和SARS-CoV的PLpro蛋白分別表現(xiàn)出一定的抑制作用[8]。在體內(nèi)，雙硫侖在酸性條件下或其二硫鍵被還原時(shí)分解，生成兩個(gè)二乙基二硫代氨，在甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，生成二硫代氨基甲酸甲酯，也可通過(guò)細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的亞砜作用最終形成S-甲基-N-二乙基硫代氨基甲酸酯砜[10]。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)，雙硫侖是一種有效的抗癌藥，雙硫侖聯(lián)合銅可以增強(qiáng)抗腫瘤效果，且雙硫侖的體內(nèi)代謝產(chǎn)物如二硫代氨基甲酸甲酯等聯(lián)合金屬銅離子在臨床前模型中顯示出抗癌活性，能夠殺傷包括黑色素瘤、直腸癌、肺癌、腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌等多種腫瘤[11]。本研究針對(duì)葡萄糖酸銅和雙硫侖對(duì)SARS-CoV-2的PLpro蛋白的抑制作用展開(kāi)實(shí)驗(yàn)，且對(duì)二者聯(lián)合使用及其代謝物對(duì)PLpro蛋白的影響做了進(jìn)一步探索。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑96孔板(Costar Corning Incoporated)、默克millipore 10 K 15 mL超濾離心管(上海未熹生物科技有限公司)、TB培養(yǎng)基(金克隆生物技術(shù)有限公司)、Ni Smart Beads 6FF(常州天地人和生物科技有限公司)、E.coli BL21(DE3)菌株(上海昂羽生物技術(shù)有限公司)、質(zhì)粒小提中量試劑盒(天根生化科技有限公司)、考馬斯亮藍(lán)染液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)、底物Ub-AMC和Cbz-RLRGG-AMC(合肥科生景肽生物科技有限公司)。

1.2 儀器多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax I3，Molecular Devices，LLC)，震蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器有限公司)，冷凍式離心機(jī)(SIGMA 3-30K，創(chuàng)合盛科教儀器有限公司)，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，NanoDrop微型分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientifics，Gene Company Limited基因有限公司)。

1.3 方法

1.3.1新型冠狀病毒PLpro蛋白的表達(dá)純化 新型冠狀病毒PLpro蛋白的基因根據(jù)其原始編碼序列中G/C含量和適用于大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)密碼子的應(yīng)用進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的編碼核苷酸序列如下所示：3′-GAAGTGCGTACCATTAAGGTGTTTACCACCGTTGATAATATTAATCTGCATACCCAGGTTGTTGAT ATGAGCATGACCTATGGTCAGCAGTTTGGCCCGACC TATCTGGATGGTGCAGATGTGACCAAAATTAAGCCG CATAATAGCCATGAAGGTAAAACCTTTTATGTTCTGC CGAATGATGATACCCTGCGTGTTGAAGCATTTGAATA TTATCATACCACCGATCCGAGTTTTCTGGGCCGTTAT ATGAGTGCACTGAATCATACCAAAAAATGGAAATAT CCGCAGGTTAATGGCCTGACCAGTATTAAGTGGGCA GATAATAATTGTTACCTGGCAACCGCCCTGCTGACC CTGCAACAGATTGAACTGAAATTCAATCCGCCGGCA CTGCAAGATGCCTATTATCGTGCACGCGCAGGTGA AGCCGCCAATTTTTGTGCACTGATTCTGGCCTATTG CAATAAGACCGTTGGCGAACTGGGCGATGTGCGTG AAACCATGAGTTATCTGTTTCAGCACGCTAATCTGG ATAGTTGCAAACGTGTTCTGAATGTTGTGTGCAAAA CCTGTGGTCAGCAGCAGACCACCCTGAAAGGCGTG GAAGCCGTGATGTATATGGGCACCCTGAGTTATGAA CAGTTTAAAAAAGGTGTGCAGATTCCGTGCACCTGC GGTAAACAGGCAACCAAATATCTGGTTCAGCAGGA AAGCCCGTTTGTTATGATGAGCGCCCCGCCGGCCC AGTATGAACTGAAACATGGTACATTCACTTGTGCAA GCGAATATACCGGCAATTATCAGTGCGGTCATTATA AACATATCACCAGTAAAGAAACCCTGTATTGCATTG ATGGTGCCCTGCTGACAAAAAGTAGTGAATATAAAG GCCCGATTACCGATGTGTTTTATAAAGAAAATAGCT ACACCACCACCATTTAA-5′。

選擇pET-28a(+)質(zhì)粒作為表達(dá)載體，酶切位點(diǎn)為NdeⅠ-XhoⅠ，N端帶6× His-tag，將測(cè)序正確的pET-28a(+)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，挑單克隆菌落至10 mL的LB培養(yǎng)基中37 ℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，再轉(zhuǎn)移至1 L的體系中37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0，加入異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)至終濃度為0.2 mmol·L-1，16 ℃誘導(dǎo)過(guò)夜表達(dá)；菌液4 500×g4 ℃離心30 min，棄上清用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)重懸菌體，再次4 500×g4 ℃離心30 min，棄上清收集菌體。用裂解液(20 mmol·L-1HEPES，0.5 mmol·L-1NaCl，pH 7.4，200 mg·L-1溶菌酶和0.05% Triton X-100)[12]重懸菌體至50 mL離心管，置于搖床上4 ℃孵育30 min后冰上超聲破碎，1 0000×g，4 ℃離心取上清備用。用5倍柱體積的雙蒸水清洗鎳柱，10倍柱體積平衡液(20 mmol·L-1HEPES，0.5 mmol·L-1NaCl，10 mmol·L-1imidazole，pH 7.4)平衡，隨后加入菌體上清，4 ℃孵育1 h，棄流出液，加入洗雜液(20 mmol·L-1HEPES，0.5 mmol·L-1NaCl，20 mmol·L-1imidazole，pH 7.4)洗雜蛋白，加入洗脫液(20 mmol·L-1HEPES，0.5 mmol·L-1NaCl，250 mmol·L-1imidazole，pH 7.4)洗脫并收集目的蛋白。通過(guò)SDS-PAGE、考馬斯亮藍(lán)染色方法分析各組分的純度，收集純度較高的蛋白至Millipore Amicon Ultra-15超濾管中離心濃縮除鹽，即得純化好的重組PLpro蛋白。

1.3.2PLpro米氏常數(shù)的測(cè)定 Ub-AMC和Cbz-RLRGG-AMC是去泛素化酶的一種熒光底物，AMC是一類(lèi)穩(wěn)定性好、位移性好的香豆素類(lèi)熒光染料，底物與去泛素化酶孵育釋放AMC，使得熒光值增加來(lái)檢測(cè)酶的活性(Ex./Em.=360/460 nm)，用這種方法能夠評(píng)價(jià)去泛素化酶的活性或篩選去泛素化酶的抑制劑[13-14]。PLpro是一類(lèi)去泛素化酶，在PLpro的作用下，Ub-AMC和Cbz-RLRGG-AMC水解產(chǎn)生去淬滅AMC，通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度的變化來(lái)評(píng)價(jià)PLpro的活性。在酶總濃度為100 nmol·L-1、熒光底物濃度為0.125～40 μmol·L-1的條件下，測(cè)定新型冠狀病毒PLpro的酶活。新型冠狀病毒PLpro活性測(cè)定的緩沖體系為：20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)。在25 ℃的孵育溫度下，加入100 nmol·L-1的PLpro，迅速加入熒光底物Cbz-RLRGG-AMC或Ub-AMC，每隔1.5 min時(shí)間記錄一次熒光讀數(shù)，共測(cè)定30 min。根據(jù)實(shí)驗(yàn)得到不同底物濃度下的反應(yīng)速率值，運(yùn)用GraphPad Prism 8中的Michaelis-Menten模型非線性擬合出Michaelis-Menten方程曲線，并得到擬合值Vmax和Km值，Michaelis-Menten方程式如下：

其中，Vmax表示酶被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速率，Km值表示米氏常數(shù)，是酶促反應(yīng)速率V為最大反應(yīng)速率一半時(shí)的底物濃度。

1.3.3抑制劑葡萄糖酸銅和雙硫侖IC50值和Ki值的測(cè)定 測(cè)定葡萄糖酸銅和雙硫侖IC50值的實(shí)驗(yàn)在黑孔96孔板中進(jìn)行，總體系為100 μL，50 μL的PLpro的濃度為40 nmol·L-1，在25 ℃的孵育溫度下，加入20 μL濃度為1～200 nmol·L-1的葡萄糖酸銅或0.02～10 μmol·L-1的雙硫侖，室溫震蕩孵育15 min，迅速加入30 μL熒光底物Ub-AMC(2.4 μmol·L-1)，進(jìn)行化合物的IC50檢測(cè)。每隔1.5 min記錄一次熒光讀數(shù)，共測(cè)定30 min。以葡萄糖酸銅濃度和雙硫侖濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的抑制率的值為縱坐標(biāo)，用GraphPad Prism 8中的非線性回歸(曲線擬合)模塊中的四參數(shù)法制作曲線，并分析計(jì)算出葡萄糖酸銅和雙硫侖的IC50值。用Dixon作圖法求葡萄糖酸銅和雙硫侖的Ki值。實(shí)驗(yàn)在黑色96孔板中進(jìn)行，總體系為100 μL，50 μL的PLpro的濃度為40 nmol·L-1，在25 ℃的孵育溫度下，分別加入20 μL濃度為0、25、50、100 nmol·L-1的葡萄糖酸銅或0、1.25、2.5、5 μmol·L-1的雙硫侖，室溫震蕩孵育15 min，迅速加入30 μL熒光底物Ub-AMC(2.5 μmol·L-1或者10 μmol·L-1)，每隔1.5 min記錄一次熒光讀數(shù)，共測(cè)定30 min。以不同的抑制劑濃度為橫坐標(biāo)，酶活反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，兩種不同底物濃度的曲線交點(diǎn)的橫坐標(biāo)即為該抑制劑的Ki值。

1.3.4抑制劑葡萄糖酸銅和雙硫侖的酶動(dòng)力學(xué)研究 用Lineweaver-Burk作圖法判斷葡萄糖酸銅和雙硫侖對(duì)PLpro的抑制作用類(lèi)型[15]。實(shí)驗(yàn)在黑孔96孔板中進(jìn)行，總體系為100 μL，PLpro總濃度為40 nmol·L-1，葡萄糖酸銅用去離子水分別配制成濃度為0、25、50、100 nmol·L-1的濃度梯度，雙硫侖用去離子水分別配制成濃度為0、1.25、2.5、5 μmol·L-1的濃度梯度，在25 ℃的孵育溫度下，分別加入不同濃度(5～80 μmol·L-1)的熒光底物Ub-AMC，對(duì)新型冠狀病毒PLpro酶活進(jìn)行測(cè)定。每隔1.5 min記錄一次熒光讀數(shù)，共測(cè)定30 min。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，由此判定抑制劑的抑制類(lèi)型。若曲線相交于Y軸，抑制劑的抑制類(lèi)型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，若曲線相交于X軸，則抑制劑的抑制類(lèi)型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，若曲線相互平行不相交，則為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑[8]。

用Yonetani-Theorell作圖法進(jìn)一步探究葡萄糖酸銅和雙硫侖對(duì)PLpro蛋白作用的相互影響。實(shí)驗(yàn)在黑孔96孔板中進(jìn)行，總體系為100 μL，PLpro總濃度為40 nmol·L-1，將不同濃度的葡萄糖酸銅(0～500 nmol·L-1)和300 nmol·L-1的雙硫侖聯(lián)合使用，在25 ℃的孵育溫度下，加入2.4 μmol·L-1熒光底物Ub-AMC，對(duì)新型冠狀病毒PLpro酶活進(jìn)行測(cè)定。每隔1.5 min記錄一次熒光讀數(shù)，共測(cè)定30 min。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以葡萄糖酸銅的濃度值為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)繪曲線，并通過(guò)兩條曲線的關(guān)系得到評(píng)價(jià)兩種抑制劑相互作用的常量α，其定義了一種抑制劑與蛋白的結(jié)合對(duì)另一種抑制劑對(duì)蛋白親和力的影響。若曲線形成一系列平行線，則α=∞，表示兩個(gè)抑制劑之間是互相排斥的，作用于同一結(jié)合位點(diǎn)；若曲線相交于原點(diǎn)，則α=1，表示兩個(gè)抑制劑之間完全獨(dú)立，互不影響；若曲線相交于X軸上方，則α<1，表示一個(gè)抑制劑和蛋白的結(jié)合增加了蛋白對(duì)另一個(gè)抑制劑的親和力，兩個(gè)抑制劑被認(rèn)為是協(xié)同的；若曲線相交于X軸下方，則α>1，表示一個(gè)抑制劑和蛋白的結(jié)合降低了蛋白對(duì)另一個(gè)抑制劑的親和力，兩個(gè)抑制劑則被認(rèn)為是拮抗的。

1.3.5雙硫侖代謝物對(duì)PLpro的作用 選用DSF的代謝物二硫代氨基甲酸甲酯和S-甲基-N-二乙基硫代氨基甲酸酯砜作為研究對(duì)象，將其配置為10～1 500 μmol·L-1的階梯濃度，測(cè)定新型冠狀病毒PLpro的酶促反應(yīng)的初速率，實(shí)驗(yàn)體系和條件與上述IC50值測(cè)定保持一致。

2 結(jié)果

2.1 PLpro蛋白純化重組的PLpro蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，經(jīng)鎳柱親和層析純化后，得到純度較高的PLpro重組蛋白，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純度，結(jié)果如Fig 1所示，PLpro蛋白的純度高，且得到的SARS-CoV-2 PLpro重組蛋白的分子量在35～40 ku之間，符合PLpro蛋白38.5 ku的理論分子量[16]，純化的蛋白儲(chǔ)存在在50 mmol·L-1的Tris-HCl中，將其分裝并于-80 ℃保存。

Fig 1 SDS-PAGE analysis of SARS-CoV-2 PLpro

2.2 PLpro米氏常數(shù)測(cè)定根據(jù)實(shí)驗(yàn)的得到不同的底物濃度下的反應(yīng)速率值，運(yùn)用GraphPad Prism 8中的Michaelis-Menten模型非線性擬合出Michaelis-Menten方程曲線并得到擬合值Vmax和Km值，如Fig 2所示，對(duì)于熒光底物Cbz-RLRGG-AMC，PLpro的米氏常數(shù)Km值為32.39 μmol·L-1，最大反應(yīng)速率Vmax為1.26 nmol·L-1·s；對(duì)于熒光底物Ub-AMC，PLpro的米氏常數(shù)Km值為7.322 μmol·L-1，最大反應(yīng)速率Vmax為0.519 nmol·L-1·s。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)于兩種不同的熒光底物，Ub-AMC與PLpro蛋白計(jì)算得到的Km值較小，因此，相比較Cbz-RLRGG-AMC，Ub-AMC有更好的親和力，靈敏度更好，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇Ub-AMC作為PLpro蛋白的底物進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)研究。

Fig 2 Michaelis constant curve of SARS-CoV-2 PLpro

2.3 葡萄糖酸銅和雙硫侖的IC50值以及Ki值測(cè)定以葡萄糖酸銅濃度和雙硫侖濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的抑制率的值為縱坐標(biāo)，用GraphPad Prism 8中的非線性回歸(曲線擬合)模塊中的四參數(shù)法制作曲線，并分析計(jì)算出葡萄糖酸銅和雙硫侖的IC50值。熒光底物Ub-AMC濃度為2.5 μmol·L-1時(shí)，葡萄糖酸銅的IC50為33.02 nmol·L-1(Fig 3A)，雙硫侖的IC50為480.4 nmol·L-1(Fig 3B)，且在相應(yīng)的濃度范圍以?xún)?nèi)顯示出劑量依賴(lài)性。已有文獻(xiàn)報(bào)道，雙硫侖對(duì)SARS-CoV的PLpro的IC50為6.5 nmol·L-1[8]，相比較可以看出，雙硫侖對(duì)SARS-CoV-2的PLpro蛋白抑制效果更好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，葡萄糖酸銅和雙硫侖都對(duì)PLpro蛋白表現(xiàn)出很好的抑制活性，其抑制常數(shù)Ki值通過(guò)Dixon作圖法求得，兩條曲線交點(diǎn)橫坐標(biāo)的負(fù)值即為Ki值。如Fig 4所示，葡萄糖酸銅的Ki值為55.3 nmol·L-1，雙硫侖的Ki值為821.6 nmol·L-1。Dixon作圖法得到的Ki值在一定程度可以反映抑制劑的抑制類(lèi)型，葡萄糖酸銅的兩條曲線相交于X軸上方，則為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，雙硫侖相交于X軸，則為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，為了進(jìn)一步驗(yàn)證其抑制類(lèi)型以及兩者相互作用的影響，設(shè)計(jì)了酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)做更深的探索。

Fig 3 IC50 curves of copper gluconate and disulfiramagainst SARS-CoV-2 PLpro

Fig 4 Dixon Plot for copper gluconate and disulfiram attwo different substrate concentrations

2.4 葡萄糖酸銅和雙硫侖的酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定葡萄糖酸銅和雙硫侖都對(duì)PLpro蛋白有很好的抑制作用，但是關(guān)于兩種抑制劑對(duì)于PLpro蛋白的抑制類(lèi)型需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)測(cè)定。將實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法判斷葡萄糖酸銅和雙硫侖的抑制類(lèi)型，如Fig 5所示，葡萄糖酸銅的4條不同濃度的曲線相交于y軸，具有固定的Vmax值，不同的Km值，表現(xiàn)出的抑制類(lèi)型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，而相反，雙硫侖的四條不同濃度的曲線相交于X軸，具有不同的Vmax值，相同的Km值，表現(xiàn)的抑制類(lèi)型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

Fig 5 Lineweaver-Burk double reciprocal curveof copper gluconate and disulfiram

為了闡明葡萄糖酸銅和雙硫侖與PLpro之間相互作用的動(dòng)力學(xué)機(jī)制，采用Yonetani-Therell方法對(duì)兩種抑制劑相互作用對(duì)PLpro蛋白影響做了分析。在不同濃度的葡萄糖酸銅和一定濃度的雙硫侖存在下測(cè)量PLpro蛋白的水解活性，數(shù)據(jù)用Dixon圖展示。如Fig 6所示，我們發(fā)現(xiàn)葡萄糖酸銅和雙硫侖對(duì)PLpro蛋白表現(xiàn)出協(xié)同抑制作用。在葡萄糖酸銅存在和不存在的兩種情況下，Yonetani-Theorell圖中的兩條線在X軸上方相交，α值<1，這表明葡萄糖酸銅和雙硫侖對(duì)PLpro具有協(xié)同抑制效應(yīng)，一種抑制劑與PLpro蛋白的結(jié)合增加另一種抑制劑和PLpro蛋白的親和力。根據(jù)葡萄糖酸銅的抑制類(lèi)型的分析結(jié)果，以及已經(jīng)有文獻(xiàn)證明金屬離子可以與半胱氨酸蛋白酶的活性位點(diǎn)結(jié)合，葡萄糖酸銅可能與PLpro蛋白活性中心的催化三聯(lián)體相互作用，如Fig 7A所示，其中催化三聯(lián)體中的Cys的-SH部分被修飾，導(dǎo)致蛋白的性質(zhì)發(fā)生變化，最終PLpro活性被抑制。雙硫侖的抑制類(lèi)型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，且可以與葡萄糖酸銅協(xié)同抑制PLpro，雙硫侖或許可以與PLpro蛋白活性口袋以外的結(jié)合位點(diǎn)相互作用，比如鋅指結(jié)構(gòu)，如Fig 7B所示，鋅離子不穩(wěn)定，由4個(gè)保守的半胱氨酸殘基四面體配位，對(duì)PLpro蛋白結(jié)構(gòu)的正確折疊起著至關(guān)重要的作用。雙硫侖可能通過(guò)與半胱氨酸的巰基結(jié)合破壞了鋅指結(jié)構(gòu)域的四面體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致PLpro蛋白的活性發(fā)生變化。

Fig 6 Yonetani-Theorell Plot for copper gluconateand disulfiram(α<1)

Fig 7 Crystal structure of SARS-CoV-2 PLpro (PDB 7cmd) representing two domains

2.5 雙硫侖代謝物對(duì)PLpro蛋白影響分析雙硫侖的代謝物在低濃度的時(shí)候?qū)Lpro抑制效果不佳，濃度達(dá)到1 000 μmol·L-1時(shí)才能對(duì)PLpro蛋白表現(xiàn)出一定的抑制作用(Fig 8)。上述結(jié)果表明，與雙硫侖代謝產(chǎn)物在抗腫瘤的研究結(jié)果不同的是，在對(duì)新型冠狀病毒的研究中，雙硫侖代謝物對(duì)PLpro蛋白無(wú)明顯抑制活性。

Fig 8 The inhibitory rate of methyl dithiocarbamate andS-methyl-N-diethylthiocarbamate sulfone againstSARS-CoV-2 PLpro

3 討論

PLpro參與新型冠狀病毒的復(fù)制、翻譯和水解過(guò)程，在新型冠狀病毒生命周期至關(guān)重要，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖酸銅和雙硫侖對(duì)新型冠狀病毒PLpro具有較強(qiáng)的抑制活性，葡萄糖酸銅可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制PLpro的活性來(lái)阻斷新型冠狀病毒的生命周期，進(jìn)而成為一種預(yù)防或者治療新型冠狀病毒感染潛在藥物，葡萄糖酸銅還可以單獨(dú)作為一種原料藥，或與其他已知的藥物、化合物或載體相配合制成口服劑、注射劑、涂劑、洗劑、氣霧劑、油制劑或透皮貼劑等各種形式的藥劑用來(lái)預(yù)防或者治療新型冠狀病毒感染。雙硫侖非競(jìng)爭(zhēng)性抑制PLpro，是一種已知的戒酒藥，臨床使用多年，藥動(dòng)學(xué)和安全性有保障。葡萄糖酸銅和雙硫侖單獨(dú)使用對(duì)新型冠狀病毒的PLpro具有較好的抑制效果，聯(lián)合使用對(duì)PLpro的抑制活性增強(qiáng)，具有協(xié)同抑制效應(yīng)，綜上所述，葡萄糖酸銅和雙硫侖有望成為抗新型冠狀病毒的候選藥物。