口服中藥miRNA的跨界調控作用機制的思考與探討

牛 捷，楊 婧,趙耀偉，王 銳

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

microRNA(miRNA)是一類在轉錄后具有活性的小RNA(19～25個核苷酸)。它們是由發(fā)夾狀的內源性miRNA前體產生，這些miRNA前體是從非蛋白質編碼基因轉錄而來的?，F有研究表明，動、植物來源的miRNA可在一定程度上被人體吸收并發(fā)揮其相應的作用。

miRNA與靶基因的互補關系，在很大程度上決定了miRNA的廣泛功能。一般來說，與miRNA完全互補的靶基因將通過RNA干擾機制被降解；而部分互補的靶基因會受到翻譯抑制[1]。在植物中，miRNA和蛋白質編碼基因之間的互補形式以完全互補為主，而在哺乳動物中，部分互補更為常見。miRNA參與多種功能基因的調控，涉及植物細胞和哺乳動物細胞的增殖、分化和凋亡。miRNA通過促進或抑制靶mRNA的切割或翻譯來介導轉錄后的基因調控，其在幾乎所有的生物學過程中都發(fā)揮著關鍵作用，包括新陳代謝和免疫功能。自miRNA在秀麗隱桿線蟲中首次被發(fā)現以來,在所有的植物、動物和其他真核生物中都接連發(fā)現了數以千計的miRNA。

一直以來，對miRNA的研究都局限在植物和動物各自的物種內，且miRNA具有不穩(wěn)定、易降解的特征，因此miRNA的跨界調控被認為十分困難。且也僅存在于植物與昆蟲、動物與寄生蟲之間。但近年來這些觀點被打破，發(fā)現植物miRNA和動物miRNA可以進入人體內并發(fā)揮調控作用，這提示miRNA可能是藥用動、植物發(fā)揮療效的物質基礎，可能是藥用動、植物中隱藏的生物活性成分之一。但因其實驗重復性差，所以目前仍存在爭議。

植物miRNA在生物學功能上往往比動物miRNA更有效。因為植物缺乏有效的免疫系統(tǒng)，因而需要對環(huán)境壓力和外部攻擊做出更快、更有效的反應，所以植物發(fā)展出了比動物更有效的生長和防御機制。本文就植物miRNA特別是藥用植物miRNA經口服吸收，并參與人體基因表達調控的關鍵環(huán)節(jié)予以分析討論。

1 植物miRNA的結構穩(wěn)定性

隨著對miRNA的不斷研究，植物藥miRNA的治療潛力引起了極大的關注。但中藥的制備多以煎煮成的湯藥為主，miRNA在制備過程中結構能否保持穩(wěn)定十分關鍵。

Xie等[2]對槲寄生miRNA在藥材制備過程中的穩(wěn)定性進行了研究。一些槲寄生miRNA經研磨、干燥、儲存和浸泡后仍存在，并且能在浸泡液中被檢測到。他們發(fā)現，暴露于核糖核酸酶、超聲波處理和熱處理可能是miRNA降解的主要原因。機械處理會增加miRNA的分解，而可能不會促進miRNA向溶劑中的釋放。植物miRNA的甲基化可能會增強它們的抗降解能力，而與蛋白質和納米顆粒等植物來源的大分子結合可能在草藥制備過程中能更有效的保護植物miRNA。

Wang等[3]利用Illumina高通量測序和實時定量PCR(qRT-PCR)驗證了高溫煮沸的新鮮人參煎液中miRNA的存在，證實經高溫煮沸后的人參miRNA可以保持穩(wěn)定。Zhou等[4]通過Illumina測序發(fā)現在金銀花湯劑中MIR2911占miRNA讀數的70%以上。與其他植物miRNA或小RNA片段相比，MIR2911在金銀花湯劑制備過程中可能具有更強的抗高溫能力。經RNase處理后發(fā)現MIR2911基本完好無損，驗證了MIR2911的高度穩(wěn)定性。為進一步檢驗MIR2911的穩(wěn)定性是否依賴于其唯一序列5’-GGCCGGGGACGGACGACUGGGA-3′，將5′-GG突變?yōu)?′-AA或將3′-GGA突變?yōu)?′-AAA，結果兩個突變體對RNase沒有抗性，表明MIR2911的穩(wěn)定性是基于其特定的序列和較高的GC含量。邵紅偉等[5]從甘草飲片的水煎劑中提取到了甘草miRNA,在制備水煎劑的過程中，炮制過的干燥甘草飲片經過了高溫處理和冷凍干燥，從中仍然能夠有效地提取到miRNA，表明甘草 miRNA 具有非常強的穩(wěn)定性，這也為中藥源性miRNA經消化道不易被破壞提供了佐證。

植物miRNA在均質、哺乳動物循環(huán)甚至煮沸過程中都完整存在，有以下幾個原因：(1)一些植物miRNA的3′端存在2′-O-甲基化，這種修飾能保護miRNA的穩(wěn)定性；(2)miRNA的一級序列(如高G，C含量)、miRNA的結構和缺乏RNases酶切基序也增強了miRNA的穩(wěn)定性；(3)miRNA蛋白輔酶因子，如高密度脂蛋白和AGO蛋白質可防止其分解；(4)植物代謝物中的草藥成分不僅為miRNA創(chuàng)造了良好的環(huán)境，而且還具有RNases抑制作用；(5)在運輸過程中，植物miRNA被包裝成微囊泡或外切體，以保護它們不被降解。

2 植物miRNA的口服可吸收性

植物miRNA口服經胃腸道吸收主要存在兩方面爭議，一方面是胃液的胃酸、胰腺和腸道菌群分泌的核酸酶和膽鹽，這些因素都可能將miRNA降解而轉化為單個核苷酸，另一方面是植物miRNA能否被胃腸道吸收及其可能的機制。

最近研究發(fā)現，模擬胃液的強酸環(huán)境沒有顯著影響植物和哺乳動物miRNA的穩(wěn)定性。Zhang等[6]從小鼠肝臟中提取總RNA，pH 2.0環(huán)境下保存數小時，研究證實酸化對miRNA的產量和質量沒有顯著影響。大多數植物和哺乳動物miRNA在酸性條件下都能存活至少6 h，且甲基化對植物miRNA的穩(wěn)定性有保護作用。首次驗證了具有完整結構的核苷酸在胃腸道中對消化有抵抗力。王文娟[7]用人參湯給大鼠灌胃，經qRT-PCR檢測驗證大鼠血液中含有人參miRNA，并通過靶基因預測軟件分析，發(fā)現人參中的部分miRNA與大鼠部分基因高度匹配。Wang等[8]發(fā)現，人類血漿中含有許多來自外源物種的RNA，包括細菌、真菌以及玉米、大米、大豆、番茄和葡萄等。因此，植物 miRNA能在胃腸道不被分解并吸收運送到血液和組織中是完全有可能的。Wang等[9]研究了6種典型植物miRNA在模擬胃腸環(huán)境中的穩(wěn)定性，以及Caco-2細胞對miRNA的吸收機制。研究結果表明，植物miRNA在模擬胃腸環(huán)境中可以保持穩(wěn)定性，而日常飲食中食物成分的混合提高了它們對極端胃腸條件的耐受性。植物miRNA在腸道中被核酸酶降解到一定程度，但其最終濃度高于發(fā)揮生物學功能所需的濃度。2′-O-甲基化有效地保護了在腸液中的植物miRNA，并顯著提高了它們的最終濃度。不同miRNA在胃腸環(huán)境中的穩(wěn)定性差異很大，并與其二級結構有關。一些miRNA的分子內自折疊可以增強其在胃環(huán)境中的穩(wěn)定性，3′末端的莖環(huán)結構是抵抗RNase消化的主要因素。穩(wěn)定的植物miRNA可以通過網織蛋白和小窩蛋白介導的內吞作用被Caco-2細胞吸收。細胞對miRNA的攝取是順序依賴的，受細胞膜上兩種典型的受體NACh和TLR9的促進。這些結果表明，一些植物miRNA在模擬的胃腸環(huán)境中是穩(wěn)定的，并可以被Caco-2細胞吸收，這是它們潛在的跨界調節(jié)作用的基礎。

Yang等[10-11]利用數字液滴聚合酶鏈反應(PCR)證實了MIR2911在小鼠體液中的存在，并闡明其生物發(fā)生與植物26S rRNA的完整性有關。Yang等[12]對MIR2911的研究表明，如果將miRNA包裹在微囊泡、外切體或脂質體等其他載體中，某些膳食microRNA的消化穩(wěn)定性可能會更高。

Zhang等[6]介紹了一種循環(huán)miRNA的可能載體——微囊泡(MVS)。外源miRNA可以通過胃腸道吸收運送到血管和其他組織。MVS是幾乎所有類型的細胞在正常和病理條件下都會脫落形成的小泡。它們攜帶原始細胞的膜表面受體或配體，選擇性地與特定的靶細胞作用，并能夠轉運介導細胞間通訊的生物活性脂質、mRNA或蛋白質。人血漿中的MVS是由微粒、外切體和其他泡狀結構組成的混合物，人血漿中的許多類型的MVS都含有miRNA。進一步研究表明，miRNA可以選擇性地包裝到MVS中，并主動運送到受體細胞中。在受體細胞中，外源miRNA可以調節(jié)靶基因的表達和受體細胞的功能[13]。例如，來自4種可食用植物(葡萄、葡萄柚、生姜和胡蘿卜)的納米顆粒已被證明具有抗炎特性。植物來源的外切體樣顆粒會被小鼠的腸道微生物區(qū)系吸收，保護它們免受結腸炎癥狀的影響[14]。由此可見，循環(huán)中的miRNA是穩(wěn)定和活躍的信號分子，可由細胞分泌的MVS遞送，這為細胞間和細胞器間信號轉導開辟了一個新的研究領域。

例6：在一次后期剪輯過程中，發(fā)現臨近傍晚補拍的鏡頭光線不足、色彩暗淡，造成相鄰兩個鏡頭之間的光線、色彩反差較大，視覺效果不連貫。剪輯時可以在時間軸上選擇需要調整的片段，打開“選項”窗口中的“色彩校正”，調整色調、飽和度、亮度、對比度、Gamma等各參數的值，還可以根據需要調整白平衡，邊調整邊觀察畫面的變化情況，直到相鄰鏡頭的色調、光線協(xié)調統(tǒng)一，完美流暢的展現作品。

外切體也是運輸miRNA的一種可能載體。外切體是大小為30～100 nm的微泡，它含有不同生物分子的包括核酸，如miRNA和其他ncRNA，由不同類型的細胞分泌到細胞外液中。外切體參與多種RNA的降解和加工，參與各種RNA的代謝。外切體在多細胞生物體的細胞運輸和細胞間通訊中起著重要作用，這些生理穩(wěn)定的外切體可以通過運送各種類型的RNA來發(fā)揮跨物種調節(jié)的作用。外切體作為載體的優(yōu)點之一是它們不受免疫反應的影響，并且它們能夠穿越生物屏障，包括血腦屏障。由此可見，外切體是理想的治療載體，它們在物理和病理條件下是穩(wěn)定的，并且經預先設計的外切體可以充當載體。其藥代動力學取決于外切體的來源(不同的成分可能影響生物分布)、生物效應和給藥途徑等因素。例如，從HEK293培養(yǎng)上清中分離出的外切體，先轉染腫瘤抑制因子miR-let-7a后注射入組織，能夠到達乳腺癌組織異種移植，并以EGF受體EGFR為靶點，產生治療效果[15]。在來自人骨髓間充質干細胞外切體的miR-143也觀察到了類似的結果[16]。MiR-143在外切體中過表達，通過下調其靶標TFF3在小鼠中對前列腺癌產生抑制作用。這可以延伸到其他miRNA，如miR-134，它被發(fā)現通過富含miR-134的外切體傳遞時可以減少乳腺癌細胞的遷移和侵襲[17]。

3 植物miRNA的體內分布特異性

同種植物miRNA經胃腸道吸收進入血液和器官后，其分布濃度有差別，且不同種類植物miRNA在血液和器官中的含量也不同。

Zhang等[6]發(fā)現MIR168a和MIR156a可以在小鼠血漿MVS、肝臟、小腸和肺中被檢測到；而MIR166a只能在血清中檢測到，組織中幾乎檢測不到。Zhou等[4]用金銀花湯給小鼠灌胃，檢測小鼠血漿及各臟器中MIR2911含量變化。連續(xù)灌胃3 d后，小鼠血漿中MIR2911濃度增加了3倍，肺中MIR2911濃度增加了8倍以上，肝臟中MIR2911濃度可增加到10倍，而在小鼠腸和腎臟中MIR2911濃度保持不變。MiR159是一種古老的基因，存在于大多數陸地植物中。Yu 等[18]發(fā)現miR159a主要分布在小鼠肝組織中。在小鼠的熒光圖像中，經腹腔注射miR159a的小鼠的胸部顯示出強烈的熒光信號，而在其他組中沒有觀察到熒光信號，表明miR159a主要分布在小鼠的肝組織中。繼續(xù)用熒光原位雜交技術分析顯示，用FAM標記的miR159a在小鼠肝組織中有表達，主要定位于細胞間質和胞漿。提示miR159a可被小鼠肝細胞攝取，進而下調小鼠肝組織中GSK-3、β介導的NF-κB和β-1關鍵蛋白的表達水平。

因此，在檢測人和動物的血漿或血清中的外源miRNA時，miRNA的選擇十分重要。植物miRNA的選擇要考慮的因素主要有，植物中miRNA的濃度，以及人和動物胃腸道對植物miRNA的選擇性吸收程度。因為胃腸道吸收植物miRNA可能是有選擇性的，在植物中含量高的miRNA不一定在血漿中處于高水平。所以在人類或動物中檢測高豐度的植物miRNA很容易失敗。

4 植物藥miRNA的跨界調控機制

4.1 金銀花MIR2911miRNA2911(MIR2911)[4]是金銀花(HS)的非典型miRNA，從HS水煎劑中提取的MIR2911可通過靶向IE62基因直接抑制水痘-帶狀皰疹病毒的復制，具有潛在的治療流感和EV71病毒感染的作用。HS水煎劑、HS水煎劑提取RNA和人工合成MIR2911均能顯著抑制H1N1病毒復制，但對Pb2和NS1 MIR2911結合核苷酸序列發(fā)生改變的突變病毒株感染無明顯影響。重要的是，HS水煎劑對病毒復制的抑制作用可被抗MIR2911反義寡核苷酸所消除。MIR2911在體內外對H5N1和H7N9病毒復制也有抑制作用，給予MIR2911或HS水煎劑顯著降低了由H5N1感染引起的小鼠死亡率。

4.2 人參miRNA王文娟等[7]通過實驗驗證，人參miRNA能夠影響INF-8、IL-10、MMP9、IL4R、MARK14、TNF-α、BCL2L1mRNA的表達，其可能影響多條免疫應答信號轉導通路，進而調節(jié)多種細胞因子的表達。

4.3 甘草miRNA邵紅偉等[5]證明甘草miRNA不僅能夠增強外周血單個核細胞的增殖能力，還能夠增強免疫細胞的抗原遞呈能力，這為解釋甘草具有調節(jié)機體免疫功能的作用奠定了基礎。在課題組后續(xù)實驗中，何免等[19]發(fā)現甘草miRNA提高免疫細胞活性或刺激增殖方面的作用不大，對機體通過直接提高免疫系統(tǒng)作用也不明顯。但甘草miRNA對與癌癥發(fā)生、發(fā)展相關的基因，如原癌基因c-JUN/c-FOS、抑癌基因p53、調控凋亡的Bax/Bcl-2、Fas/FasL信號轉導系統(tǒng)和轉錄激活因子STAT1作用效果非常明顯。因此，甘草miRNA對多種細胞因子影響不大，僅有可能影響到其中某些基因的表達。

4.4 丹參miRNAYang等[20]發(fā)現，丹參中的Sal-miR-1和Sal-miR-3可調節(jié)OTUD7B/KLF4/NMHC IIA軸從而抑制血管重構。丹參提取物Sal-miR-1和Sal-miR-3經灌胃給藥后可進入小鼠體內，并能顯著抑制頸動脈結扎所致的內膜增生，還可抑制凝血酶誘導的血管平滑肌細胞(VSMCs)遷移和單核細胞與VSMCs的黏附。SAL-miR-1和Sal-miR-3通過與OTUD7B 3′UTR的不同位點結合，阻斷凝血酶對OTUD7B的上調作用。Sal-miR-1和Sal-miR-3下調OTUD7B可以降低KLF4蛋白的去泛素化水平，而KLF4的降低則緩解了其對NMHC IIA基因轉錄的抑制，從而提高了NMHC IIA的表達水平。此外，NMHC IIA的增加通過維持VSMC的收縮表型來抑制VSMC的遷移和單核細胞與VSMC的黏附。

4.5 辣木籽miRNAMinutolo等[21]研究了辣木籽(MO)植物精制提取物miRNAs對機體免疫應答和抗HIV感染的作用。分析了MO p-miRs轉染HIV+PBMCs的效果，發(fā)現隨著細胞凋亡率的增加，細胞存活率下降，表達Fas的輔助性T細胞增多，細胞內Bcl-2蛋白表達降低。MO p-miRs具有誘導細胞凋亡(Fas和BcI2介導的凋亡)、降低淋巴細胞活性和病毒復制的能力。同時，沒有檢測到對健康志愿者的外周血單個核細胞產生任何影響。CD4+T細胞被MO p-miRs轉染后，細胞活性顯著降低，T細胞分化改變，從而使中央和效應器記憶細胞減少，的同時增加了終末效應器記憶細胞。并且p-miRs轉染減少了細胞內的HIV p24蛋白和病毒DNA整合。經證實，p-miR858b的序列存在于MO p-miR池中，并預測其靶點為與HIV-Nef結合有關的VAV1蛋白。VAV1蛋白在T細胞抗原受體信號轉導中起關鍵作用，可觸發(fā)多種途徑的激活。合成的p-miR858b轉染HIV+PBMC后，VAV1和HIV p24蛋白的表達降低。

4.6 生姜miRNAKalarikkal等[22]證實在生姜中類外切體囊泡的納米顆粒中存在靶向SARS-CoV-2的 miRNA，并且它們在細胞內環(huán)境中以SARS-CoV-2基因組/轉錄組為靶點的可能性更高。將納米顆粒形式的miRNA靶向 SARS-CoV-2，發(fā)現這些miRNA可以選擇性地在SARS-CoV-2的主要靶組織中傳遞。由于這些納米顆?？稍隗w內蓄積到肺組織中，靶向SARS-CoV-2基因組的納米顆粒形式的miRNA有望作為一種新冠肺炎替代治療手段。生姜衍生的類外切體納米顆粒還可以預防肝臟相關疾病的發(fā)展，如酒精誘導的損傷[23]，并通過減弱細胞因子和促進腸道細胞增殖來預防炎癥性腸病[24]。

4.7 黃芪miRNAShen等[25]通過實驗證實，通過鼻腔給藥，黃芪來源的miR-396在哮喘小鼠的脾臟、外周血和肺組織中的表達水平是內參基因的10倍左右。經20 μg miR-396模擬物連續(xù)7次治療后小鼠IL-5、IL-13細胞因子水平顯著降低，且miR-396下調了Th2細胞主要轉錄因子GATA-3的表達。

4.8 天麻miRNA天麻(GE)是一種珍貴的中草藥，具有抗驚厥、神經保護、抗炎和免疫調節(jié)作用。Xia等[26]通過Illumina高通量測序，在GE中發(fā)現了5 718個miRNA，其中52個是新發(fā)現的GE miRNA。功能預測表明，Gas-mi R01和Gas-mi R02可能干擾3個關鍵基因：A20、TNF-α和IκBα。將Gas-mi R01和Gas-mi R02模擬物轉染293T細胞，可顯著抑制NF-κB-driven基因的重要反饋調節(jié)因子A20的表達。此外，給小鼠用天麻煎煮液灌胃后，可以在小鼠的血清、肝、腦、腎、脾中檢測到高水平的Gas-mi R01和Gas-mi R02，而A20的表達降低[27-28]。這些結果提示GE miRNA是GE中的一組活性成分，可能與天麻的抗炎和免疫調節(jié)作用有關。

4.9 顛茄miRNAABA miRNA 9497是從顛茄中分離得到的，與智人miRNA-378有很高的同源性。Avsar等[28]首次證明ABA miRNA 9497和miRNA-378都可以通過與人中樞神經系統(tǒng)富含ZNF-691基因的3′-UTR結合而下調該基因的mRNA表達。他們推測顛茄的神經毒性作用可能部分源于aba-miRNA-9497對ZNF-691的調節(jié)作用。由于ZNF-691參與了炎癥等多種神經病理過程，因此利用aba miRNA 9497靶向ZNF-691作為炎癥在多種疾病中的重要作用將引起人們的極大興趣。

5 問題與不足

植物miRNA能否口服進入體內并發(fā)揮作用仍存在分歧：支持者認為在動物體內檢測到的植物miRNA是真實存在于動物體內的植物miRNA；而否認者認為這些檢測到的植物miRNA是由樣本污染或者儀器誤差造成的假陽性結果。此類實驗的一般思路為，為了驗證外源miRNA能否進入體內并發(fā)揮作用，設計動物喂養(yǎng)實驗并設置對照組(通常是給某種動物喂食包含不同含量植物miRNA的食物)。然后測量動物體液或組織中的植物miRNA含量，再根據實驗組和對照組在植物miRNA種類和含量上的差別，最后得出支持或否認的結論。這就顯露了不同研究團隊實驗結果之間矛盾的原因：其一，不同動物物種、不同植物性食物以及不同組織器官、體液的特異性；其二，樣本種類單一、數量有限。從而難以在統(tǒng)計層面將其與污染物及儀器誤差區(qū)分開。

盡管有大量研究證明外源miRNA可作用于人體，但這些miRNA的生物利用度仍然存在爭議。原因包括實驗數據可重復性低，序列分析中存在技術錯誤，或是研究設計本身不合理。Dickinson等[29]首先駁斥了植物miRNA攝取和跨物種調節(jié)的概念。他們給小鼠喂食對照食物、添加41%大米的食物、添加75%大米的食物。然而，用血漿和肝組織的總RNA進行miRNA測序時，水稻來源的miR-168a在1 000多萬個讀數中顯示不到10個讀數。同樣，健康運動員食用了含有高水平miR-156a、miR-159a和miR169a的水果后，血清中也沒檢測出這些miRNA。在另一項研究中，Huang等[30]用從玉米粉RNA中分離出的miRNA喂養(yǎng)小鼠，兩周后沒有在小鼠體內檢測到玉米miRNA，他們推測大多數miRNA在消化過程中被廣泛降解。Witwer等[31]給豬尾獼猴喂食了以植物為基礎富含miRNA的物質，后用qRT-PCR檢測其血漿，沒有檢測到miR160、miR156、miR166、miR167、miR168和miR172。Snow等[32]讓健康受試者攝入含有miRNA的水果后，沒有在血漿中檢測到miR156a，miR159a和miR169a。這些不一致可能源于細胞外miRNA研究領域中常見的技術問題，包括miRNA濃度低，缺乏標準的RNA提取方法，以及缺乏適當的內部控制。分析和引物設計錯誤也影響了幾個已發(fā)表的關于外源miRNA在人體循環(huán)中的生物利用度的文章。在Pastrello等[33]發(fā)表的文章中，作者最初在大量食用西蘭花的健康人血清樣本中檢測到了植物miRNA，但后來以引物設計策略錯誤而導致虛假擴增為由撤回了這篇文章。

此外，幾個公開可用的NGS數據集通常被植物來源的miRNA污染。通過分析來自人類組織和血清的824個測序數據集，發(fā)現其中存在非人類的miRNA序列，包括植物來源的miRNA，盡管豐度較低。此外，Kang等[34]發(fā)現外源miRNA的存在和豐度，與miRNA直接攝入的器官(如肝臟)和非直接攝入的器官(如腦脊液)之間沒有明顯的相關性。他們分析了800多個體液和組織樣本，得出結論，在人體內檢測到植物miRNA是由于交叉污染，甚至是人工制品。Heintz-Buschart等[35]驗證，這些miRNA污染的來源，其中之一可能是因為使用了商業(yè)miRNA純化試劑盒，從而在萃取柱中引入了外源miRNA。用不含核酸酶的水作為輸入樣本，通過這些柱子進行RNA分離，可得到幾個小RNA。在公共數據集中可以查找到這些受污染的小RNA序列，雖然這些小RNA的含量較低。為避免這種污染，在分離RNA之前，用次氯酸鈉處理柱子，然后用無核酸酶的水清洗，可以顯著減少這些小RNA種群的污染。

以前的研究已經解釋了植物miRNA的穩(wěn)定性。但Xie等[2]在研究中發(fā)現，甲基化的hsa-let-7a不能在酶環(huán)境中存活(例如，RNase處理和各種槲寄生提取物)，這表明植物miRNA的甲基化可能不是在草藥制備過程中保持它們穩(wěn)定的關鍵因素。此外，合成的miRNA在與槲寄生制劑一起加工時迅速降解，表明提取物中的次生代謝物不能有效地保護miRNA不被降解。除此之外，Denzler等[36]和Howard等[37]獨立發(fā)表的研究論文指出，缺乏證據表明植物miRNA可以進入哺乳動物循環(huán)系統(tǒng)，認為沒有闡明miRNA調節(jié)動物體內營養(yǎng)代謝過程的途徑。

對于miRNA的矛盾實驗結果，需要仔細考慮實驗設計及操作過程中各個環(huán)節(jié)的關鍵問題，如選擇合適的miRNA、正確的miRNA提取方法、合理的實驗設計、最小化測序偏差、準確的歸一化等。miRNA豐度并不是植物中miRNA攝取的唯一決定因素，某些富含在植物中的miRNA可能仍然在體內無法檢測到。由于植物miRNA可能存在選擇性吸收，隨機選擇一種或兩種植物miRNA來測量攝取量具有很高的風險。究竟什么樣的序列排列或核苷酸組成是可獲得的？哪種類型的miRNA修飾可以產生高攝取效率？miRNA在體內的代謝機制是怎樣的？這些問題在今后仍有待解決。常見的核酸定量技術，如實時PCR、微陣列和深度測序，還不足以識別miRNA的轉移。檢測特定miRNA的新工具正在被探索。Croci等[38]首次證明了放射性標記的anti-miR PNA探針可以用于細胞中的分子成像，從而為miRNA表達的體內成像提供了數據和提示。

6 展望

植物藥miRNA可以經口服吸收并發(fā)揮跨界調控作用，讓植物藥miRNA作為活性成分發(fā)揮作用成為可能，拓寬了中藥作用機制在分子層面的研究，并為臨床藥物治療提供了理論依據和實驗基礎。但現有相關研究中仍存在一些不足，應針對這些不足進行完善，改善實驗設計和糾正技術錯誤，以解決中藥miRNA口服吸收并發(fā)揮跨界調控作用研究中的問題與不足。