杉木細(xì)根AMF侵染特征和錳、鎘含量對短期氮添加的響應(yīng)

陳良華，劉選茹，李西悅，柳 奇，楊林凱，舒 錕，林恬恬

（長江上游林業(yè)生態(tài)工程四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/長江上游森林資源保育與生態(tài)安全國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華西雨屏區(qū)人工林生態(tài)系統(tǒng)研究長期科研基地/四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)林業(yè)研究所，成都 611130）

中國是全球三大氮沉降區(qū)之一，中國2011—2015的年均氮沉降量約為1.96×107t，遠(yuǎn)高于世界氮沉降量的平均水平[1]。伴隨我國的工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，全國的年均氮沉降量仍將持續(xù)增加。從已報(bào)道的文獻(xiàn)來看，我國學(xué)者對溫帶森林生態(tài)系統(tǒng)、草地生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中過量氮素引發(fā)的生態(tài)效應(yīng)研究較多。與溫帶生態(tài)系統(tǒng)不同，熱帶和亞熱帶森林土壤通常被認(rèn)為不缺氮，高度酸化，陽離子交換量低，酸緩沖能力差[2]，但對于該區(qū)域氮素臨界負(fù)荷的界定和相關(guān)研究顯得不足。

杉木（Cunninghamia lanceolata）是我國亞熱帶地區(qū)最重要的速生用材林之一，栽培面積廣，在木材供給和生態(tài)環(huán)境建設(shè)方面發(fā)揮著重要作用。杉木人工林表層土壤（0～10 cm）對重金屬鉛、鎘和銅等具有很強(qiáng)的蓄積作用[3]，林冠層對雨水中的重金屬過濾作用較強(qiáng)[4]，表現(xiàn)出較強(qiáng)的環(huán)境污染物過濾作用。氮沉降、酸雨和杉木連栽通常會引起土壤酸化[2,5]，加速土壤中錳、鋁和鎘等金屬向游離態(tài)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)林木對重金屬元素的吸收進(jìn)而發(fā)生毒害作用[6]，對森林健康產(chǎn)生負(fù)面影響。

菌根是叢枝菌根真菌侵染植物根部形成的菌-根共生體，容易受到土壤養(yǎng)分（尤其是氮、磷）水平的影響[7]。因林木養(yǎng)分需求的差異和立地條件的變化，不同年齡樹木根際通常具有不同的AMF多樣性和群落結(jié)構(gòu)[8]。崔莉娜等[9]發(fā)現(xiàn)，AMF侵染率與孢子密度均伴隨杉木林齡的增大而增大，杉木與AMF共生關(guān)系的加強(qiáng)能減緩?fù)寥浪峄斐傻酿B(yǎng)分流失。此外，一些研究發(fā)現(xiàn)杉木林內(nèi)的AMF多樣性和群落結(jié)構(gòu)對氮沉降非常敏感。例如，王婷等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，氮添加可以提高杉木根際AMF的侵染率和多樣性，促進(jìn)杉木根系與AMF的共生。然而，AMF作為介導(dǎo)植物重金屬吸收和抗逆的關(guān)鍵微生物類群[10]，氮沉降對杉木AMF侵染特征的影響是否會顯著影響林木對重金屬的富集，相關(guān)研究非常缺乏。因此，本研究以華西雨屏區(qū)11 a和18 a的杉木細(xì)根為研究對象，研究模擬氮沉降對杉木細(xì)根AMF侵染特征、錳和鎘吸收與富集的影響，以期為深入理解氮沉降對人工林生態(tài)系統(tǒng)的共生微生物特征和重金屬元素富集的影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為華西雨屏區(qū)杉木人工林的氮素管理提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地位于四川省洪雅縣國有林場的八面山工區(qū)管護(hù)區(qū)域（102°49'～103°32'E，29°24'～30°0'N），屬于華西雨屏區(qū)。該地海拔1 100～1 300 m，中亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候，氣候溫和，年均溫16.6℃，常年多云霧，少日照，年日照1 006.1 h，雨水豐富，濕度較大，年降水量1 435.5 mm，主要集中在6—8月，無霜期較長，達(dá)307 d，土壤類型為山地黃壤，呈強(qiáng)酸性，基本理化性質(zhì)見表1。林下灌木層的優(yōu)勢種有寒莓（Rubus buergeri）、江南越桔（Vaccinium mandarino?rum）、水竹（Phyllostachys heteroclada），草本植物主要有黑足鱗毛蕨（Dryopteris fuscipes）、樓梯草（Elat?ostema involucratum）、赤車（Pellionia radicans）、三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum）。

表1 土壤初始理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical traits of the soils in the plots

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

我們以中齡林階段（11 a和18 a）的杉木純林為研究對象，11 a杉木林于2008年?duì)I造，造林密度為2 500株/hm2；18 a杉木林于2001年?duì)I造，造林密度為3 000株/hm2。在造林初期（前3年），經(jīng)營單位進(jìn)行每年2次的窩撫和每年1次的施肥，之后未施肥。18 a杉木林經(jīng)歷過1次生長伐和1次透光伐。11 a杉木林林下灌木蓋度3%，草本植物蓋度10%；18 a杉木林林下灌木蓋度15%，草本植物蓋度82%。每個林齡隨機(jī)布設(shè)9塊樣地，樣地大小為20 m×20 m(樣地概況見表2)。參照洪雅縣的年均氮沉降量[11]，即8.24～14.75g N/(m2·a)，設(shè)置3個氮添加水平：對照（CK），0 g N/(m2·a)；低 N（LN），5 g N/(m2·a)；高 N（HN），10 g N/(m2·a)。使用 NH4NO3作為氮源，將年氮添加量均分成12份，從2019年4月起，每月中旬對各樣地進(jìn)行氮添加處理。施氮時，將各樣地所需的NH4NO3溶解于10 L水中，用背式噴霧器中在樣方中反復(fù)噴灑氮肥直至均勻，CK樣地噴灑等量清水。

表2 樣地概況Table 2 Basic information of sample plots

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集與處理

分別在2019年8月下旬（生長季）和11月下旬（非生長季），采用完整土塊法獲取杉木根系，每個樣地內(nèi)選取3株平均木，在每株樹基部選取2個不同方向的距樹干1/2冠幅的地方挖取土塊，規(guī)格為20 cm×20 cm×20 cm，輕輕抖落根表面的土壤，收集完整的根系，用刷子刷下并收集黏附在根上的土壤（根圍2 mm內(nèi)的土壤），合并同一株樹2個方向上獲得的根際土和根系，最終獲得27份杉木根系樣品和根際土。所有樣品均放在保溫箱的冰上帶回實(shí)驗(yàn)室，根系樣品用自來水清洗干凈，濾紙沾去多余水分后分成兩份，一份浸泡于FAA固定液后存放于4℃冰箱，用于觀察根系A(chǔ)MF侵染情況；一份暫時保存于-20℃冰箱，參照Xu Z.F.等的根系分級法[12]，1級根為整個根系最先端的根，2級根系為1級根系母根，3級根系為2級根系母根，4級根系為3級根系母根。本研究中，因1級根生物量過小，故與2級根合并測定，將各級根系烘干，研磨，過100目篩，用于錳和鎘含量的測定。

1.3.2 測定方法

根系錳和鎘含量測定：采用硝酸-氫氟酸-鹽酸（5∶1∶1）微波消解制備待測液，用火焰原子分光光度法測定[13]。

1～2級根AMF的侵染率經(jīng)臺盼藍(lán)染色后采用放大交叉法進(jìn)行測定[13]，分別統(tǒng)計(jì)叢枝、泡囊和菌絲數(shù)量占觀察交叉點(diǎn)的比例，每個處理觀察不少于50個根段，總的侵染率為叢枝、泡囊和菌絲侵染率的總和。

根際土壤總球囊霉素（total glomalin，TG）和易提取球囊霉素（easily extractable glomalin，EEG）經(jīng)浸提后用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法進(jìn)行測定[14]。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，分別對生長季和非生長季內(nèi)各指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差(one-way ANOVA)，并用Tukey法檢驗(yàn)處理間差異顯著性（P<0.05）；用重復(fù)測量方差分析(ANOVA of repeated measurement data)檢驗(yàn)氮添加、林齡、生長季及其交互作用對各參數(shù)影響的顯著性；用配對t檢驗(yàn)（paired-samplest-test ANOVA）比較同一處理某一參數(shù)在生長季和非生長季之間的差異顯著性。利用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)法檢驗(yàn)參數(shù)間兩兩的相關(guān)性（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮添加對不同年齡杉木細(xì)根AMF侵染率的影響

從圖1可以看出，在生長季，11 a林中，與CK相比，LN和HN處理增加了杉木根系的泡囊（圖1b）、菌絲（圖1c）和總AMF（圖1d）侵染率，且增量在LN處理下達(dá)顯著水平（P<0.05）；18 a林中，LN處理顯著增加杉木根系的泡囊和總AMF侵染率（P<0.05）。在生長季，CK條件下，18 a杉木細(xì)根的菌絲侵染率顯著高于11 a（P<0.05）；LN條件下，11 a杉木細(xì)根的菌絲侵染率顯著高于18 a（P<0.05）；HN條件下，11 a杉木細(xì)根的泡囊侵染率顯著高于18 a（P<0.05）。在非生長季，11 a林中，與CK相比，LN處理下杉木根系的泡囊侵染率顯著增加（P<0.05）。18 a林中，LN處理未顯著影響各菌根真菌侵染指標(biāo)（P>0.05）；HN處理?xiàng)l件下，杉木細(xì)根叢枝侵染率顯著降低（P<0.05）。在非生長季，兩林齡間對應(yīng)處理?xiàng)l件下的侵染指標(biāo)無顯著差異（P>0.05）。

圖1 氮添加對杉木根系A(chǔ)MF侵染率的影響Figure 1 Effects of N addition on the colonization of AMF

重復(fù)測量方差分析結(jié)果表明（表3），年齡作為獨(dú)立因子并沒有顯著影響杉木細(xì)根AMF侵染特征的各項(xiàng)參數(shù)（P>0.05）。AMF泡囊、菌絲和總侵染率受到氮添加的顯著影響（P<0.05），泡囊和菌絲侵染率受到生長季的顯著影響（P<0.05），叢枝侵染率受到氮添加×生長季、年齡×氮添加×生長季交互作用的顯著影響（P<0.05），菌絲和總侵染率還受到氮添加×生長季交互作用的顯著影響（P<0.05）。

表3 重復(fù)測量方差分析檢驗(yàn)林齡、氮添加、生長季及其交互作用對各參數(shù)影響的顯著性Table 3 Results of repeated measures ANOVA for the effects of stand age,N addition and season on parameters

2.2 氮添加對不同年齡杉木細(xì)根根際土球囊霉素含量的影響

從圖2a可以看出，在生長季，11 a林內(nèi)，與CK相比，土壤易提取球囊霉素含量在LN和HN處理下均有所增加，其中LN水平下達(dá)到顯著水平（P<0.05）；18 a林內(nèi)，土壤易提取球囊霉素僅在LN處理下有所增加，但未達(dá)顯著水平（P>0.05）。在非生長季，11 a和18 a林中，與CK相比，土壤易提取球囊霉素含量均無顯著變化（P>0.05）。從圖2b可以看出，在生長季，與CK相比，各氮添加處理均未顯著改變11 a和18 a林根際土總提取球囊霉素的含量（P>0.05）。在非生長季，與CK相比，各氮添加處理對11 a林土壤總提取球囊霉素含量無顯著影響（P>0.05）；但HN顯著提高了18 a林杉木細(xì)根根際土的總提取球囊霉素含量（P<0.05）。不管是生長季還是非生長季，對應(yīng)處理?xiàng)l件下，兩林齡間杉木細(xì)根根際土的易提取球囊霉素和總球囊霉素含量無顯著差異（P>0.05）。

圖2 氮添加對杉木根際土壤易提取球囊霉素和總提取球囊霉素的影響Figure 2 Effects of N addition on content of easily extractable glomalinthe and total glomalin in rhizosphere soils

重復(fù)測量方差分析結(jié)果表明（表3），易提取球囊霉素的含量主要受到年齡、氮添加兩因子的顯著影響（P<0.05），以及氮添加×生長季、年齡×氮添加×生長季交互作用的顯著影響（P<0.05）?？偳蚰颐顾氐暮恐饕艿侥挲g、生長季兩因子的顯著影響（P<0.05），以及年齡×氮添加交互作用的顯著影響（P<0.05）。

2.3 氮添加對不同年齡杉木各級根系錳含量的影響

從圖3可以看出，不管是在生長季還是在非生長季，11 a林內(nèi)，與CK相比，LN和HN處理均未顯著影響杉木各級根的錳含量（P>0.05）。18 a林內(nèi)，在生長季，與CK相比，僅HN顯著增加了杉木4級根中的錳含量（P<0.05），其余的氮添加處理均未顯著影響各級根中的錳含量（P>0.05）；在非生長季，18 a林內(nèi)，LN和HN處理均未顯著影響杉木各級根的錳含量（P>0.05）。在生長季，CK、LN及HN條件下，18 a杉木3級根和4級根的錳含量均顯著高于11 a杉木（P<0.05）；HN條件下，18 a杉木1～2級根的錳含量顯著高于11 a杉木（P<0.05）。在非生長季，CK、LN及HN條件下，18 a杉木所有根級的錳含量均顯著高于11 a杉木（P<0.05）。

圖3 氮添加對杉木各級根系錳含量的影響Figure 3 Effects of nitrogen addition on Mn content in different order roots

重復(fù)測量方差分析結(jié)果表明（表3），各級根中的錳含量均受到年齡和生長季的顯著影響（P<0.05），僅4級根的錳含量受到氮添加的顯著影響（P<0.05），1～2級根的錳含量受到年齡×生長季交互作用的顯著影響（P<0.05），4級根的錳含量受到年齡×氮添加交互作用的顯著影響（P<0.05）。

2.4 氮添加對不同年齡杉木各級根系鎘含量的影響

從圖4可以看出，在生長季和非生長季，11 a林內(nèi)，與CK相比，LN顯著增加了杉木1～2級根的鎘含量（P<0.05）（圖4 a），但未顯著影響其余根級的鎘含量（P>0.05）。在生長季，18 a林內(nèi)，與CK相比，LN和HN顯著增加了1～2級根的鎘含量（P<0.05），但未顯著影響其余根級中的鎘含量（P>0.05）；在非生長季，兩種氮添加處理均顯著降低了18 a林內(nèi)細(xì)根1～3級根的鎘含量（P<0.05），未顯著影響4級根的鎘含量（P>0.05）。在生長季，CK條件下，18 a杉木4級根的鎘含量顯著高于11 a（P<0.05）；HN條件下，18 a杉木1～2級根的鎘含量顯著高于11 a（P<0.05）。在非生長季，CK條件下，18 a杉木所有根級鎘含量均顯著高于11 a（P<0.05）；但LN和HN條件下，兩林齡間同一根級的鎘含量無顯著差異（P>0.05）。

圖4 氮添加對杉木各級根系鎘含量的影響Figure 4 Effects of nitrogen addition on Cd content in different order roots

重復(fù)測量方差分析結(jié)果表明（表3），各級根中的鎘含量均受到年齡和生長季的顯著影響（P<0.05），僅3級根的鎘含量受到氮添加的顯著影響（P<0.05），1～2級根的鎘含量受到年齡×氮添加、氮添加×生長季交互作用的顯著影響（P<0.05），3級根的鎘含量受到年齡×氮添加交互作用的顯著影響（P<0.05），4級根受到年齡×氮添加×生長季交互作用的顯著影響（P<0.05）。

如表4所示，各級根的錳含量與易提取球囊霉素呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.05），4級根的錳含量與總球囊霉素的含量呈正相關(guān)（P<0.05）。各級根的鎘含量均與叢枝的侵染率呈顯著的正相關(guān)關(guān)系（P<0.05），3、4級根的鎘含量還與菌絲、泡囊的侵染率呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。各級根的錳含量存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，各級根的鎘含量也存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。各級根系中，鎘與錳含量均呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。

表4 各指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis results of indexes

3 討論與結(jié)論

3.1 短期氮添加對AMF侵染特征的影響

大量研究表明，氮沉降會顯著降低根系A(chǔ)MF侵染率、生物量并影響群落結(jié)構(gòu)[15-17]，僅有少數(shù)學(xué)者發(fā)現(xiàn)氮沉降能促進(jìn)AMF的侵染，這種差異與土壤初始養(yǎng)分狀況和不同AMF功能類群的氮素需求有關(guān)。AMF的根外菌絲能吸收各種形態(tài)的氮源（尤其是銨態(tài)氮），以供自身需求并傳輸給寄主植物，促進(jìn)寄主生長[18]。若植物和AMF菌絲生長均受到氮限制，氮添加通常會促進(jìn)AMF的繁殖；若僅植物生長受到氮限制，氮添加會抑制AMF侵染和繁殖[19]。本研究中，氮添加條件下，AMF侵染率隨氮沉降量的增加呈低促高抑趨勢，AMF菌根真菌（菌絲、泡囊和總的侵染率）的侵染率受到氮添加的顯著影響。在生長季，LN處理使兩種年齡杉木根系A(chǔ)MF侵染率顯著增加，可能是因?yàn)樘幱谏L旺季的杉木和AMF的生長均受到了一定程度的氮限制，低氮添加緩解了它們生長的氮限制，促進(jìn)了AMF的侵染。在HN處理下，氮添加對AMF的侵染率并沒有顯著的促進(jìn)作用，對18 a林分杉木細(xì)根的侵染率甚至表現(xiàn)出抑制作用。這可能是HN條件下，杉木和AMF的生長均不受氮限制，杉木地下碳分配下降，AMF的生長受碳限制，導(dǎo)致AMF的侵染率和豐度降低[20-22]。此外，泡囊和菌絲的侵染率受到生長季節(jié)的顯著影響，生長季與氮添加處理對杉木AMF侵染率產(chǎn)生顯著的交互效應(yīng)。通常情況下，植物在生長季會有更高的AMF侵染率[23]。本研究中，總體來看，生長季杉木AMF的侵染率更低，這可能與區(qū)域降水特征和土壤類型相關(guān)，研究地位于華西雨屏區(qū)，年均降雨量高達(dá)1 435 mm，降雨集中在夏季，黃壤黏重，夏季土壤含水量很高，AMF作為好氧型微生物[24]，過度濕潤的土壤環(huán)境可能不利于AMF侵染和共生，抑制了菌絲的生長。

3.2 短期氮添加對根際土球囊霉素含量的影響

球囊霉素由AMF根內(nèi)和根外菌絲分泌產(chǎn)生，隨菌絲降解進(jìn)入土壤[25]。本研究中，生長季兩種年齡杉木根際土壤中易提取和總提取球囊霉素含量與根系菌絲侵染率的變化相似，均表現(xiàn)為氮添加濃度增加而呈低促高抑的現(xiàn)象；同時，總球囊霉素含量與菌絲侵染率呈顯著正相關(guān)，說明土壤中球囊霉素含量與AMF的侵染和菌絲生長狀況密切相關(guān)。這是因?yàn)?，氮添加引起的菌絲侵染率和生物量的增加，會伴隨菌絲的死亡、降解進(jìn)入土壤，引起土壤中易提取球囊霉素的增加。汪鷂雄等[26]也發(fā)現(xiàn)，6 g N/(m2·a)的氮添加在冬季提高了杉木根際土易提取球囊霉素含量，在春季會提高總球囊霉素含量。值得注意的是，在非生長季，18 a杉木林，HN處理不同程度降低了菌根真菌的侵染率，但總球囊霉素含量卻顯著增加，這可能是因?yàn)榭偳蚰颐顾刈鳛橄鄬Ψ€(wěn)定的球囊霉素，不易被微生物降解，在根際具有一定的富集作用，其變化特征與該階段的侵染率沒有表現(xiàn)出一致的變化規(guī)律。

3.3 短期氮添加對杉木細(xì)根錳和鎘含量的影響

錳元素是植物的必需元素，不但影響著植物的生理生化過程，還顯著影響著凋落物的生物化學(xué)地球循環(huán)。凋落物內(nèi)錳含量的變化對錳過氧化物酶的活性起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，影響著凋落物難分解組分的分解[27-28]，調(diào)控著土壤的碳、氮循環(huán)。通常而言，長期的氮沉降會引起土壤酸化和鹽基陽離子的淋溶，促進(jìn)土壤中鋁、錳等金屬元素的活化[6,29]，增強(qiáng)根系的吸收，引起鋁毒和錳毒的發(fā)生。但本研究中，短期氮添加沒有顯著影響林地土壤的pH值，卻降低了各級根的錳含量，這可能是因?yàn)榈砑犹岣吡松寄镜募?xì)根生產(chǎn)量[30]，稀釋了所吸收元素。同時，各根級的錳含量與根際土中的易提取球囊霉素呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與可提取球囊霉素吸附、絡(luò)合和螯合錳離子密切相關(guān)。

鎘作為植物的非必需元素，通常隨著根系分枝等級的降低而逐漸下降[31]，并受到AMF侵染的顯著影響[10]。本研究中，杉木細(xì)根中的鎘含量隨著根系等級的增加而顯著下降，而錳的這種根級間的差異并不明顯，這與兩種元素在根級間轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑和機(jī)制存在差異有關(guān)。陳冠陶等[32]發(fā)現(xiàn)不同的金屬元素在根級間的分配模式不同，對氮沉降的響應(yīng)也存在差異。我們的研究中，各級根中的鎘含量均與AMF侵染特征（叢枝、泡囊和菌絲侵染率）存在顯著的正相關(guān)，并隨氮添加量的增加表現(xiàn)出低出高抑的趨勢。這是因?yàn)椋珹MF發(fā)達(dá)的根外菌絲極大地?cái)U(kuò)展了根系與土壤的接觸面積，介導(dǎo)了鉛、鎘等重金屬元素由土壤向植物根系細(xì)胞的遷移、儲存和運(yùn)輸[33-34]。AMF的菌絲及孢子的細(xì)胞壁富含幾丁質(zhì)、胞壁酸、球囊霉素、羧基和羥基等基團(tuán)，能夠吸附、絡(luò)合、沉淀并滯留大量的重金屬[35-36]。此外，杉木根系中鎘的含量受到林分年齡和生長季的顯著影響，可能與不同年齡和生長季條件下林下植被存在顯著差異有關(guān)。經(jīng)歷了透光伐和疏伐之后，18 a杉木林分林下植被比11 a林分豐富得多，杉木作為淺根系物種，與灌草植被存在很強(qiáng)的競爭作用。種間競爭調(diào)控著根際生理生態(tài)過程、微生物群落結(jié)構(gòu)[37]，從而影響了杉木富集重金屬的策略和效率。

3.4 結(jié)論

總體來看，杉木細(xì)根的AMF侵染狀況對短期氮添加非常敏感，LN處理有利于AMF的侵染，杉木年齡沒有作為獨(dú)立因子顯著影響AMF的侵染率。11 a杉木根際土壤中易提取和總提取球囊霉素含量與根系菌絲侵染率的變化基本一致。錳和鎘兩種重金屬元素在根級中的富集模式不同，各級根系中錳的含量受到易提取球囊霉素的顯著影響，而各級根的鎘含量受到AMF侵染特征的顯著影響。