抗黑斑病核桃SSR標記篩選與應(yīng)用研究

阮若玉，王 明，朱天輝，李姝江，韓 珊*

（1.四川省森林和草原防火監(jiān)測中心，成都 610081；2.四川省林業(yè)和草原調(diào)查規(guī)劃院，成都 610081；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，成都 611130）；

核桃黑斑病系核桃黃單胞桿菌(Xanthomonas campestris pv.Juglandis(Pierce)Dye)引起的細菌性病害[1]。該病害潛伏期長、發(fā)病迅速，導(dǎo)致核桃果實腐爛、早落，從而引起減產(chǎn)，出仁率和含油量降低等，對核桃品質(zhì)和產(chǎn)量造成巨大影響。

我國在黑斑病防控方面主要采取單一的化學(xué)防治方法，長期使用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗藥性，且對環(huán)境造成污染，因此核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重心是培育抗病優(yōu)良品種。目前普遍采用田間鑒定和人工接種病原物方法評價核桃黑斑病抗性，但田間鑒定面臨核桃生長周期較長、黑斑病發(fā)病受環(huán)境影響較大等限制，人工接種病原物不能完全模擬自然條件下核桃發(fā)病情況，其結(jié)果不完全準確?？剐澡b定上存在的這些困難阻礙了抗性遺傳改良的發(fā)展。尋找準確快速的鑒定方法成為核桃抗黑斑病育種研究中亟待解決的關(guān)鍵問題。

SSR分子標記技術(shù)由于在篩選目標性狀的連鎖標記方面靈敏、關(guān)聯(lián)程度高和穩(wěn)定性好等優(yōu)點，廣泛運用于植物種植資源抗病性的研究，近年來取得了較大進展。羅登杰等[2]利用11對多態(tài)性SSR引物對以普通野生稻DY19與秈稻9311為親本構(gòu)建的BC3F2群體進行單株基因型檢測，并結(jié)合單株抗性表型值篩選出與細條病抗性基因bls2緊密連鎖的RM13592和RM13599。徐志軍等[3]利用72對多態(tài)性SSR引物對57份不同青枯病抗性的花生品種檢測，結(jié)合接種病菌結(jié)果，篩選出10個與花生青枯病抗性連鎖的SSR標記。不受時間空間限制的分子標記輔助選擇技術(shù)的廣泛運用為核桃黑斑病抗性鑒定提供了新的思路，但使用傳統(tǒng)方法開發(fā)SSR分子標記工序復(fù)雜，費用昂貴，且獲得多態(tài)性引物的成功率不高[4]。近年來，高通量測序技術(shù)發(fā)展迅速，測序成本顯著降低，為SSR分子標記開發(fā)提供了海量數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）是利用第二代高通量測序技術(shù)進行cDNA測序，能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本[5]，是篩選抗性基因的重要研究技術(shù)，在大量非模式生物中得到了廣泛的應(yīng)用[6]，可以根據(jù)測序結(jié)果開發(fā)與抗性相關(guān)的SSR分子標記。核桃分子生物學(xué)進展相對其他林木緩慢，目前尚未見到開發(fā)篩選與核桃黑斑病抗性基因相關(guān)的SSR分子標記的報道。

本研究根據(jù)前期田間鑒定和接種病原物鑒定結(jié)果，基于健康和發(fā)病的抗性種和易感品種核桃轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，通過分析抗病及感病核桃品種（無性系）中差異基因表達情況，篩選可能與抗性直接相關(guān)的基因并開發(fā)SSR標記，以期為核桃黑斑病抗性種質(zhì)的篩選和鑒定提供快速準確的分子生物學(xué)方法。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株：核桃黃單胞桿菌保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護學(xué)林木病理實驗室。

供試植物：2a生健康核桃來自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)崇州基地。經(jīng)過2016—2018年連續(xù)多年的田間鑒定及前期人工接種鑒定，其中‘鐵核桃’‘清香’‘86’‘199’‘64’和‘71’表現(xiàn)為抗病，‘65’‘遼核 1 號’‘川早1號’‘蜀江1號’‘香玲’和‘川早2號’表現(xiàn)為感病，核桃抗感差異材料12個品種（無性系），由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地選育（表1）。進行分子標記抗性鑒定應(yīng)用的供試核桃材料均采自德昌縣核桃山核桃國家林木種質(zhì)資源庫，共25個品種。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源：采用多糖多酚類植物RNA提取試劑盒（華越洋生物）進行健康和發(fā)病的抗性種和易感品種核桃總RNA提取，提取流程參照試劑盒說明書。反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，利用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)評估文庫質(zhì)量?；贗llumina HiSeq平臺對文庫進行雙末端測序獲得相關(guān)數(shù)據(jù)。構(gòu)建文庫和測序工作委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.2 SSR引物設(shè)計與篩選

根據(jù)核桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，基于健康‘鐵核桃’、發(fā)病‘鐵核桃’、健康‘香玲’和發(fā)病‘香玲’4個轉(zhuǎn)錄本中基因表達水平分析，篩選出有顯著差異的Unigenes，篩選閾值為padj<0.05。檢測其中有SSR位點的Unigenes，比對在 Nr，Nt，Pfam，KOG/COG，Swissprot，KEGG和GO七大數(shù)據(jù)庫中基因功能注釋結(jié)果。用MISA軟件在可能與抗病相關(guān)聯(lián)的Unigenes上檢索SSR位點，Primer 6.0引物批量設(shè)計程序設(shè)計引物。引物命名為RJR加序號，如RJR-1。

1.3 DNA的提取及SSR引物有效性檢測

采用天根植物組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，并結(jié)合核桃自身富含多酚和多糖的特性進行方法改良，采用超微分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和純度，稀釋至30 ng/μL，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

SSR引物有效性檢測以‘鐵核桃’基因組DNA為模板。采用的25 μL反應(yīng)體系，包括1×T3 Super PCR Mix 22.0 μL，30 ng/μL 模 板 DNA1.0 μL，10 μmol/L上下游引物各1.0 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性 120 s；98℃變性10 s，50/55/60℃退火10 s，72℃延伸10 s，循環(huán)29次；72℃延伸120 s。擴增產(chǎn)物使用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 多態(tài)性SSR標記開發(fā)

以抗病材料組成的抗病基因池和感病材料組成的感病基因池基因組DNA為模板，對經(jīng)檢測能夠有效擴增的SSR引物進行多態(tài)性篩選。采用的25 μL 反應(yīng)體系，包括2×T5 Super PCR Mix 12.5 μL，30 ng/μL模板DNA 1.0 μL，10 μmol/L上下游引物各1.0 μL，ddH2O補足至25 μL。反應(yīng)程序同上步。擴增產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯影后進行統(tǒng)計分析。

1.5 抗病相關(guān)SSR引物驗證

以不同品種（系）抗病材料和感病材料基因組DNA為模板，對在抗感差異材料具有多態(tài)性的引物進行進一步的驗證。分子標記檢測時，擴增條帶與‘鐵核桃’帶型一致的表示該品種（系）可能為抗病，與‘香玲’帶型一致的表示該品種（系）可能為感病?？共☆愋陀谩?”表示，感病類型用“0”表示，抗性相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析(P≤0.05，P≤0.01)，對核桃SSR標記基因型與黑斑病抗病性進行相關(guān)分析，利用Pearson相關(guān)系數(shù)判斷SSR標記與黑斑病抗性關(guān)聯(lián)度是否達到顯著水平，并計算標記對核桃黑斑病抗性鑒定的符合率=(核桃黑斑病抗性正確鑒定的個數(shù)/品種總數(shù))×100%。

1.6 SSR標記用于核桃抗黑斑病品系的鑒定

選取與核桃黑斑病抗性相關(guān)的SSR引物，以從德昌縣核桃、山核桃國家林木種質(zhì)資源庫采集的25個品種基因組DNA為模板，進行SSR-PCR擴增，6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。SSR反應(yīng)體系及程序同1.4，用銀染法檢驗。統(tǒng)計分子標記抗性鑒定結(jié)果，用于不同核桃品種對核桃黑斑病抗性的早期篩選和鑒定。

1.7 核桃接種驗證

從25份進行分子標記抗性鑒定的核桃材料中隨機選取5份，采用離體葉片室內(nèi)人工接種鑒定，每個品種選取30片長勢一致的健康葉片，重復(fù)3次。實驗室保存的核桃黃單胞桿菌活化后，用接種環(huán)挑取單菌落轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中制成2×108CFU/mL細菌懸浮液，使用針刺涂抹法接種，用無菌針在葉背面輕刺，用毛刷將菌液均勻涂抹于傷口處。接種后覆上一層保鮮膜，置于鋪有無菌水浸濕的滅菌紗布的白盤中，并噴灑無菌水以保持90%以上相對濕度，在28℃下在16 h/d的條件下培養(yǎng)，以無菌的LB液體培養(yǎng)基和無菌水噴霧為對照。第7天時統(tǒng)計發(fā)病率，評價各品種（系）的抗病性。采用十字交叉法測量黑斑病的病斑直徑并分級[7]：0級病斑癥狀不明顯甚至無癥狀；1級病斑直徑≤2.0 mm；2級病斑直徑2.1～4.0 mm；3級病斑直徑4.1～6.0 mm；4級病斑直徑≥6.1 mm，共5個等級。病情分級標準參照方中達[8]的方法：免疫（I）病情指數(shù)為0；高抗（HR）病情指數(shù)為0.1～5.0；抗病（R）病情指數(shù)為5.1～25.0；感?。⊿）病情指數(shù)為 25.1～50；高感（HS）病情指數(shù)為50.1～100。病情指數(shù)=[∑(病點數(shù)×病級)/(調(diào)查總點數(shù)×病情指數(shù)最高級別)]×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR分析

2.1.1 核桃轉(zhuǎn)錄組中SSR序列總體特點及出現(xiàn)頻率

核桃轉(zhuǎn)錄組測序后，進行序列組裝，共獲得Unigenes 162 310條，測序序列總長152 224 996 bp，N50值為1 311 bp，N90值為271 bp，組裝效果較好，Unigenes的平均長度為928 bp，最大長度為14 851 bp，最小長度為201 bp。

基于上述Unigenes發(fā)掘核桃轉(zhuǎn)錄組SSR功能性標記。在這些序列中共搜索出34 265個SSRs，總長度為92 519 376 bp，分布于5 097條Unigenes中，SSR發(fā)生頻率（含SSR的Unigenes數(shù)與Unigenes總數(shù)之比）為3.13%，出現(xiàn)頻率（檢出SSR數(shù)與Unigenes總數(shù)之比）為21.11%。其中包含片段的SSR數(shù)為28 047條，包括至少一段SSR的片段數(shù)5 097條，表現(xiàn)出化合物合成功能的SSR數(shù)為1 800條。

核桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，不同SSR序列出現(xiàn)的數(shù)量與比例有較大差異（表2），其中單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復(fù)出現(xiàn)頻率占優(yōu)勢(占總SSR的58.81%，30.92%和9.22%)；四核苷酸，五核苷酸和六核苷酸重復(fù)類型數(shù)量很少(占總SSR的0.88%，0.09%和0.07%)。

表2 核桃SSR類型、數(shù)量及分布頻率Table 2 Repeat type,number and frequency of SSRs in Juglans regia

2.1.2 核桃轉(zhuǎn)錄組中SSR序列基序種類及比例

從核桃轉(zhuǎn)錄組SSR核苷酸基序的類型結(jié)果分析，SSR位點共有34 265個，重復(fù)基序類型有99種，其中單、二、三、四、五和六核苷酸重復(fù)各有2、4、10、30、28和25種；核桃不同重復(fù)基序重復(fù)次數(shù)都在24次以內(nèi)，以6、7、9和10次重復(fù)為主，隨著重復(fù)次數(shù)增多，SSR的數(shù)量呈下降又上升趨勢，10次達到最多。從SSR重復(fù)頻率來看單核苷酸主要分布在10次，二核苷酸主要分布在6～9次，三核苷酸主要分布在5～7次，四核苷酸主要分布在5～6次，五核苷酸和六核苷酸主要在5次。

從核桃SSR基序分布頻率來看，單核苷酸的重復(fù)基序最多，占總SSR的58.81%，主要是A/T，占單堿基重復(fù)的95.94%；其次是二堿基重復(fù)，占總SSR的30.92%；在二核苷酸重復(fù)基序中又以AG/CT、AT/AT和AC/GT最多，分別占66.81%、23.06%和9.56%，CG/CG僅占0.57%。再次是三核苷酸重復(fù)基序，占總SSR的9.22%，其中以AAG/CTT、AAT/ATT、AGG/CCT和ACC/GGT為主，占三核苷酸重復(fù)的29.41%、15.92%、11.10%和9.84%。四、五和六核苷酸重復(fù)基序出現(xiàn)頻率均較低，分別占總SSR的0.88%、0.09%和0.07%（表3）。在四核苷酸基序中以AAAT/ATTT、AAAG/CTTT最多，分別占27.06%、14.85%。五核苷酸基序中以AAGAG/CTCTT、AAAAT/ATTTT和AATCG/ATTCG最多，分別占9.38%、6.25%和6.25%。六核苷酸每種重復(fù)均只出現(xiàn)一次。

表3 核桃轉(zhuǎn)錄組中SSR基序的分布Table 3 Disttibution of SSR motif in Juglans regia

2.2 基于核桃轉(zhuǎn)錄組的SSR引物設(shè)計結(jié)果

用Primer 6.0對含有34 265個SSR位點的28 047條Unigenes進行引物設(shè)計，共有15 876個位點成功設(shè)計出了引物，成功率為46.33%。這15 876對SSR引物的重復(fù)類型比較豐富，從單堿基到六堿基均有分布。其中單核苷酸重復(fù)引物最多，為9 734個，占總引物數(shù)的61.31%，其次為二核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)引物，分別為3 676和1 665個，占總引物數(shù)23.15%和10.49%，四、五和六核苷酸重復(fù)的最少，分別為127，22和10個，其余為復(fù)合型SSR引物。

根據(jù)核桃轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，將THT_JKvsTHT_FB（健康‘鐵核桃’和發(fā)病‘鐵核桃’）、XL_JKvsXL_FB（健康‘香玲’和發(fā)病‘香玲’）、THT_JKvsXL_FB（健康‘鐵核桃’和發(fā)病‘香玲’）進行聚類分析后，整合了組合之間共有與特有的差異基因數(shù)目，繪成維恩圖（圖1）。通過比較相同和不同品種核桃健康和發(fā)病時基因水平的不同，可以篩選出各自對黃單胞桿菌侵染的應(yīng)答過程的差異表達基因，這些基因可能與抗病相關(guān)聯(lián)。通過韋恩圖可知，在THT_JK、THT_FB、XL_JK和XL_FB中有顯著差異的基因共378個，檢索該基因上有無SSR位點，再比對其基因功能注釋結(jié)果是否與抗病相關(guān)聯(lián)，最終篩選并設(shè)計63對引物。對其進行有效性檢測，發(fā)現(xiàn)所有引物的擴增產(chǎn)物都能在凝膠上擴增出符合其預(yù)期產(chǎn)物大小的特異性條帶，有效擴增率為100%（圖2）。

圖1 核桃轉(zhuǎn)錄組差異基因維恩圖Figure 1 Venn diagram of the transcriptome

圖2 引物有效性檢測瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 2 Agarose gel electrophoresis result of SSR markers

2.3 多態(tài)性SSR引物的篩選

將能夠有效擴增的63對SSR引物在抗病基因池和感病基因池中進行PCR擴增，結(jié)果表明，RJR-2、RJR-3、RJR-4、RJR-6、RJR-7、RJR-9、RJR-11、RJR-13、RJR-17、RJR-18、RJR-23、RJR-25 和RJR-27等24對引物在抗感基因池間具有多態(tài)性，多態(tài)性引物比例為39.3%。各引物的多態(tài)性條帶強弱和條帶大小有所差異，其中，RJR-2、RJR-3、RJR-6、RJR-7、RJR-11、RJR-13、RJR-17、RJR-18、RJR-23、RJR-25、RJR-45、RJR-46、RJR-50、RJR-55和RJR-60等15對引物在抗感基因池有較大差異，是理想的多態(tài)性引物（圖3）。

圖3 部分在抗感基因池中具有多態(tài)性SSR引物擴增結(jié)果Figure 3 Amplification results of some polymorphic SSR primers

2.4 SSR引物多態(tài)性驗證結(jié)果

分別以6份抗黑斑病和6份感黑斑病核桃品種（無性系）DNA為模板，對上述15對具有良好多態(tài)性的引物進行進一步驗證。經(jīng)驗證，15對引物中，僅有1對（RJR-18）與核桃抗病表型相關(guān)聯(lián)，其余引物在抗感材料間缺乏統(tǒng)一性和代表性。圖4表明，引物RJR-18在抗病材料中都能夠擴增出大小約為320 bp的條帶，而感病材料中除了‘遼核1號’，其余皆不能擴增出此大小條帶，符合率為91.7%。

圖4 RJR-18在抗感材料間擴增結(jié)果Figure 4 Amplified results of resistant cultivars and susceptible cultivars with primer RJR-18

Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，引物RJR-18與核桃黑斑病相關(guān)程度達到極顯著水平(P<0.01)，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.846，表明引物RJR-18與核桃黑斑病抗性高度相關(guān)，能夠用于之后不同核桃品種抗性早期篩選和鑒定。

RJR-18 SSR分子標記為四核苷酸重復(fù)（表4），在材料中能夠擴增11個多態(tài)性位點，所在Unigene對應(yīng)功能在七大數(shù)據(jù)庫中均注釋成功，結(jié)果都指向其可能為Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白基因（CAX3）。

表4 RJR-18序列位點信息、基因注釋及多態(tài)性情況表Table 4 Codes and sequences of RJR-18 SSR

2.5 SSR標記用于核桃抗黑斑病品系的鑒定

使用與核桃黑斑病相關(guān)的引物RJR-18，對從德昌縣核桃、山核桃國家林木種質(zhì)資源庫采集的25份的核桃材料進行抗性鑒定，結(jié)果顯示，‘雷溪核桃’‘石棉巨型核桃’和‘德昌3號’等16個品種能夠擴增出大小約為320 bp的條帶，初步判斷為抗病品種；‘川核早’‘石棉指核桃’和‘和田18號’等9個品種不能擴增出大小約為320 bp的條帶，初步判斷為感病品種（表5）。隨機選取5份材料進行抗性鑒定，‘普格優(yōu)’‘鹽源早’和‘河南6號’人工接種病情指數(shù)分別為12.83、14.19和17.44，為抗性品種，‘川香’‘華寧大白殼’人工接種病情指數(shù)分別為36.56、42.97，為感病品種，與引物RJR-18抗性鑒定結(jié)果一致。

表5 引物RJR-18抗性鑒定結(jié)果Table 5 Results of resistance identification amplificated by molecular markers

3 討論與結(jié)論

核桃屬于基因組較大的非模式生物，其共顯性標記的開發(fā)較為滯后。本研究以核桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，共獲得Unigenes 162 310條，從中檢測到34 265個SSRs，出現(xiàn)頻率為21.1%，遠遠高于三色堇（6.05%）[9]、茄子（18.32%）[10]；與柑橘（21.74%）[11]、薄殼山核桃（21.92%）相近[12]；但低于藍靛果忍冬(32.51%)[13]的出現(xiàn)頻率。出現(xiàn)這種差異的原因可能與不同物種的特異性、SSR位點搜索閾值、數(shù)據(jù)量大小不同等因素相關(guān)。這種差異的出現(xiàn)也表明了核桃轉(zhuǎn)錄組SSR較為豐富，是研究基因功能及遺傳信息的理想標記之一。SSR具有多態(tài)性的根本原因是基序重復(fù)次數(shù)發(fā)生變異[14]。研究表明，SSR基序重復(fù)次數(shù)多的具有更高的多態(tài)性，尤其當(dāng)重復(fù)次數(shù)大于12次時，多態(tài)性位點含量高[15]。核桃轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)次數(shù)的變異為5～24次，10次重復(fù)的頻率最高（21.54%），重復(fù)12次以上的頻率是30.31%，表明核桃轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)次數(shù)較高，由此推測出核桃轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)掘出的34 265個SSR位點大部分具有較高多態(tài)性，可以用于后續(xù)的分子標記研究以及核桃黑斑病相關(guān)聯(lián)的分子標記的開發(fā)。

利用高通量測序技術(shù)對核桃進行微衛(wèi)星分子標記的開發(fā)，不僅較傳統(tǒng)方法高效、成本低，更能在獲得SSR位點的同時查找到對應(yīng)Unigene的基因功能注釋，與基因關(guān)聯(lián)性較強。植物在受到病原物侵染時，一些與抗病性相關(guān)的基因表達量與表達情況會發(fā)生變化。植株染病后會促使相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄RNA合成，促進抗病相關(guān)蛋白質(zhì)合成，以起到提高自身抗病能力的作用，從而抵御病原物侵染。同一個細胞在不同時期和階段下，其基因表達情況不完全相同，因此通過對黑斑病抗病種‘鐵核桃’健康和發(fā)病時，感病品種‘香玲’健康和發(fā)病時4種不同狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果來進行分析，發(fā)現(xiàn)部分Unigenes的表達量出現(xiàn)差異，這些差異基因可能參與了核桃在黃單胞桿菌侵染時的抗逆過程。本研究結(jié)合不同抗性核桃轉(zhuǎn)錄組差異基因表達分析和基因功能注釋結(jié)果來進行抗病基因SSR引物的篩選和開發(fā)，獲得63個可能與黑斑病抗性相關(guān)的SSR位點，均能擴增出目的條帶，可見基于轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的SSR標記具有可靠性。

通過比較多態(tài)性SSR引物在抗感表型差異品種中擴增出對應(yīng)條帶的差異，獲得了與核桃黑斑病抗性顯著相關(guān)的1個SSR分子標記。該標記所在Unigene功能預(yù)測為Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白-3（Ca2+/H+antiporters 3，CAX3），屬于Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白（CAXs）家族。前人發(fā)現(xiàn)CAXs大多定位在液泡膜上[16]。在抗病相關(guān)研究中,番茄CAX3和CAX4與頂腐病的發(fā)生緊密相關(guān)[17]，目前尚未有開展研究核桃CAXs基因家族結(jié)構(gòu)和時空表達模式，從而探索其參與核桃抗逆機制中的過程。

本研究基于核桃轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，設(shè)計并合成了SSR引物，在對抗感差異顯著的不同核桃品種（系）進行驗證基礎(chǔ)上，獲得1對與核桃黑斑病抗性相關(guān)的SSR分子標記，并對25份德昌縣核桃種質(zhì)資源進行的抗性鑒定，所得結(jié)果可為抗病良種選育提供參考。