棗和酸棗果實有機酸代謝差異研究

鄧 倩，王 羊，鄧群仙*，張慧芬，夏 惠，梁 東，王 全

（1.四川農業(yè)大學園藝學院，成都 611130；2.四川省廣安市鄰水縣經果技術推廣所，四川 鄰水 638500；3.四川農業(yè)大學果蔬研究所，成都 611130）

棗起源于中國，不僅是中國最古老的果樹之一[1]，也是我國特有的果樹資源和獨具特色的優(yōu)勢果樹樹種[2]。

有機酸，產生水果重要的口味感覺“酸”，是果實品質及風味物質的主要成分之一[3]。果實的酸味是由有機酸的種類、含量和比例共同決定的。同一種但不同品種的水果，其有機酸組成都可能存在差異，蘋果酸或檸檬酸為多數水果的主要有機酸[4]。黃果柑中總酸含量的90%以上為檸檬酸[5]。Y.Soyer等[6]研究結果顯示葡萄中的酒石酸含量最高，約為4.98～7.48 g/L。趙愛玲等[7]研究發(fā)現酸棗的總酸含量是棗種質的3～5倍，且酸棗以檸檬酸和蘋果酸為主，棗果實以蘋果酸和奎寧酸為主。

目前果實中有機酸代謝的研究多集中在蘋果、柑橘、葡萄及梨等樹種上，‘冬棗’和‘駿棗’為北方栽培棗品種，其有機酸代謝研究和全基因組測序已見報道[8-11]。但南方栽培棗品種的有機酸積累規(guī)律、相關基因表達等研究較少，而且由于南方陰雨天多、光照弱以及積溫不足，導致南方栽培棗果實中有機酸的積累量高于北方栽培棗[12]，對南方栽培棗的鮮食風味影響較大。因此，本試驗以原產四川德陽市羅江區(qū)，果實長圓柱形，低含酸量的‘羅江調元棗’為材料，以高含酸量的‘圓形小酸棗’為對照[13]，通過測定各發(fā)育時期有機酸含量、組分以及相關代謝基因的表達量，進而分析‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’的有機酸代謝差異，為進一步調控南方栽培棗品種中有機酸代謝及棗果實品質與風味的提高提供理論參考依據。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于四川省德陽市羅江區(qū)白馬關鎮(zhèn)萬佛村五組（N 31°26'34''，E 104°46'18''，海拔約660 m），屬于亞熱帶濕潤地區(qū)，四季分明，氣候溫和，年平均氣溫16.5℃，最高氣溫為36.6℃，最低氣溫為-6.7℃；平均年降水量910 mm，無霜期278 d，年平均日照時數1 260 h。

1.2 試驗材料

以‘羅江調元棗’（用TYZ表示）和‘圓形小酸棗’（用SZ表示）作為試驗材料，皆為露地栽培的根蘗苗，株行距為2 m×3 m。其中‘羅江調元棗’是低酸鮮食棗品種，‘圓形小酸棗’是高酸砧木酸棗品種。棗樹樹勢健壯，生長及結果正常，栽培管理基本一致。

掛牌、采樣等采用鄧倩等[14]的方法，共采樣9次。

1.3 有機酸的測定

有機酸提取以及測定參照孫延芳的方法[15]，并略有改動。取適量樣品放入研缽用液氮將其研磨成粉末，準確稱取0.5 g充分研磨的樣品放入離心管中，再加入3 mL的0.04 mol/L的KH2PO4提取液，搖勻并配平。超聲20 min后，常溫6 000 r/min離心20 min，取上清液過0.22 μm濾膜過濾待測。色譜柱選用 MZ PerfectSil Target C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為4%甲醇水溶液；流速0.5 mL/min；柱溫25℃；檢測波長210 nm；進樣量10 μL。

1.4 總RNA的提取及cDNA合成

總RNA的提取參照改良CTAB法，并略有改動。cDNA的合成根據TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒說明書進行操作。

1.5 PCR引物設計和反轉錄產物檢測

有機酸代謝相關基因根據NCBI上棗全基因組測序結果，利用Primer Premier 5.0設計定量引物，內參基因引物序列參考張春梅[10]報道的，序列見表1。擎科生物技術（成都）有限公司完成引物的合成。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers for quantitative real-time PCR

以cDNA為模板，經PCR擴增檢測反轉錄產物質量及特異性。PCR體系為2×Taq Mix 10 μL，模板1 μL，上下游引物各0.8 μL，dd H2O 7.4 μL。反應程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)。所得PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 熒光定量PCR分析

利用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix without ROX試劑盒（TOYOBO）在CFX Connect型實時定量PCR儀（Bio-Rad，USA）上進行熒光定量PCR。反應總體系10 μL，包含5 μL的THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix without ROX，10 μM 的上下游引物各0.4 μL，1 μL的cDNA模板和3.2 μL的無RNA酶水。反應程序：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。采用相對表達量2-ΔΔCT表示基因表達水平。以上每個樣品均設3次重復，每次試驗設置陰性對照。內參基因為UBQ。以‘圓形小酸棗’花后20 d的表達量為對照，其表達量為1。

1.7 數據處理方法

采用Microsoft Excel及SPSS Statistics 17.0進行數據處理與統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)育時期果實中有機酸組分及含量的動態(tài)分析

由不同發(fā)育時期棗和酸棗果實的有機酸含量動態(tài)變化可知（圖1），‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’的主要有機酸為檸檬酸和蘋果酸。果實發(fā)育前期（花后20～55 d），蘋果酸為‘圓形小酸棗’的主要有機酸組分，占總酸含量的50%～60%，果實發(fā)育后期（花后76～90 d）則蘋果酸和檸檬酸各占總酸含量的40%左右。‘羅江調元棗’果實在整個發(fā)育時期占主導地位的都是蘋果酸，蘋果酸含量占總酸含量的50%～90%。

圖1-A、1-B和1-E中，從酸含量整體變化趨勢來看，‘圓形小酸棗’中蘋果酸、檸檬酸和總酸含量呈現上升-下降-上升-下降的變化趨勢，檸檬酸和總酸含量在花后62 d達到最大值，而蘋果酸含量在花后76 d達到最大值?！_江調元棗’中蘋果酸、檸檬酸和總酸含量呈現上升-下降的變化趨勢，蘋果酸和總酸含量在花后62 d達到最大值，而檸檬酸含量的最大值在花后55 d出現?！畧A形小酸棗’和‘羅江調元棗’果實中酒石酸含量變化無明顯規(guī)律（圖1-C），而兩個品種果實中琥珀酸均從花后69 d開始積累（圖1-D）。

圖1 棗和酸棗果實不同發(fā)育時期有機酸含量變化Figure 1 Changes of organic acid during development in jujube fruits

2.2 不同發(fā)育時期果實中有機酸代謝相關基因的表達分析

2.2.1 蘋果酸代謝途徑中相關基因的表達分析

由圖2-A可知，‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’中MS的表達量隨著果實的發(fā)育急劇上調。圖2-B中‘圓形小酸棗’果實中FUM的表達呈上調趨勢，‘羅江調元棗’果實中FUM的表達則隨果實的發(fā)育逐漸上調但在果實成熟期下調。圖2-C～D中，‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’果實中PEPC1主要在果實發(fā)育前中期表達，后期則表達量較低，PEPC4的表達則隨著果實的發(fā)育逐漸上調，于成熟期表達量最高。圖2-E～H中，‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’果實中的MDH1、MDH4和MDH11的表達都隨著果實的發(fā)育呈上調趨勢，且在花后76～90 d表達量迅速上調。而‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’果實中MDH6的表達則隨著果實的發(fā)育逐漸下調。圖2-I～K中，‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’果實中NADP-ME1主要在幼果期有高表達，NADP-ME3和NADP-ME4的表達量變化呈“M”型。

圖2 棗和酸棗蘋果酸代謝途徑中相關基因的表達分析Figure 2 The relative expression level of malic acid metabolism genes during developmental stages of jujube fruit

2.2.2 檸檬酸代謝途徑中相關基因的表達分析

由圖3-A～D可知，‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’中CS1、CS3、Aco2-1和Aco4的表達隨著果實的發(fā)育逐漸上調。圖3-E～G中，‘圓形小酸棗’中NAD-IDH1-2的表達呈現先上調后下調的趨勢，而NAD-IDH1-1和NAD-IDH5的表達則隨著果實的成熟而波動上調?！_江調元棗’中NAD-IDH1-1和NAD-IDH1-2的表達都隨著果實的成熟先上調后下調，NAD-IDH5的表達則逐漸上調。圖3-H～J中，‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’中NADP-IDH1主要在果實成熟期表達。圖3-I中，‘圓形小酸棗’中NADP-IDH2隨著果實的成熟表達逐漸上調，‘羅江調元棗’中NADP-IDH2在花后20～76 d表達逐漸上調，76～90 d表達量下調。圖3-J中，‘圓形小酸棗’中NADP-IDH3的表達在花后20～69 d變化不大，花后69 d開始隨著果實的成熟逐漸上調；而‘羅江調元棗’中NADP-IDH3的表達量在花后69～83 d開始隨著果實的成熟迅速上調，花后90 d下調。

3 討論

3.1 棗和酸棗果實有機酸組分與含量

有機酸代謝是一個復雜的過程，自然環(huán)境[16]、栽培措施[17]和種質[7]均可影響果實有機酸的積累與含量。本試驗采用HPLC法檢測了棗和酸棗果實中的有機酸組分及含量，發(fā)現‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’果實的主要有機酸為蘋果酸和檸檬酸。趙愛玲等[7,18]用HPLC法檢測出酸棗果實中檸檬酸和蘋果酸含量相當，而棗果實中蘋果酸含量最高，與本試驗結果相似。隨著果實發(fā)育，‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’果實中蘋果酸占總酸的比例逐漸下降，檸檬酸占總酸的比例逐漸增大。花后90 d，‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’中檸檬酸含量分別是2.92和0.72 mg/g，蘋果酸含量分別是3.26和3.12 mg/g，由此可見‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’之間總酸含量的差異是由檸檬酸含量的差異造成的。

3.2 棗和酸棗果實酸代謝基因與有機酸組分含量之間的關系

果實生長發(fā)育過程中有機酸的合成與降解共同決定了果實中有機酸的含量[4,16]?；ê?0～69 d，‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’果實中PEPC4表達量變化與蘋果酸含量變化趨勢一致?！畧A形小酸棗’和‘羅江調元棗’果實中FUM、PEPC4、MDH1、MDH4及MDH11在花后76～90 d皆有高表達，結合‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’果實中蘋果酸含量的變化推測，可能是FUM和PEPC4合成蘋果酸，MDH1、MDH4及MDH11降解蘋果酸達成平衡，從而導致花后76～90 d‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’果實中的蘋果酸含量變化不大。

Shi J.等[19]研究‘紅富士’蘋果果肉中PEPC的相對表達，發(fā)現其與果實中蘋果酸含量呈正相關；但馬倩倩等[11]認為在棗果實發(fā)育過程中ZjPEPC對酸棗中蘋果酸的代謝調控作用不大。張春梅等[10]推測MDH對于棗和酸棗中蘋果酸含量的增加起到一定的調節(jié)作用。根據NCBI上的Blast序列比對可知，MDH1主要定位在線粒體，MDH6主要定位在細胞質中，而MDH4和MDH11主要定位在乙醛酸體中。而有機酸主要在線粒體中產生[20]，由此可推測，FUM和PEPC4在‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’合成蘋果酸中起關鍵作用，MDH1在‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’降解蘋果酸中起關鍵作用。

本研究中，‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’檸檬酸含量的差異是導致總酸含量存在差異的主要因素?；ê?0～69 d，‘圓形小酸棗’果實中CS1表達量變化與檸檬酸含量變化相似，而Aco2-1、NADIDH1-1及NAD-IDH1-2表達量變化與檸檬酸含量變化相反。而在花后76～90 d，‘圓形小酸棗’果實中檸檬酸含量的變化不大，這可能是由于在此期間CS1合 成檸 檬 酸 ，Aco2-1、NAD-IDH1-1、NADIDH1-2及NAD-IDH5降解檸檬酸達到了一個較為平衡的狀態(tài)。Zhang G.等[21]研究發(fā)現椪柑中CitAco1的下調表達和CitCS1、CitCS2的上調表達可能與檸檬酸積累有關，這與本文研究結果相似。‘羅江調元棗’果實中檸檬酸含量在花后20～55 d的上升可能是由于CS1在此期間表達逐漸上調；花后62～90 d‘羅江調元棗’果實中檸檬酸含量逐漸下降可能是由于NAD-IDH1-2在花后55～90 d表達迅速上調，且Aco2-1、NAD-IDH1-1及NAD-IDH5在花后76～90 d表達迅速上調所致。

G.A.M.Mauricio等[22]在番荔枝中的研究結果和Gao L.等[23]在西瓜中的研究結果都顯示CS的表達量可能決定了果實中檸檬酸的積累。張春梅[10]認為CS3促進了棗和酸棗果實中檸檬酸的積累。M.J.Morgan等[24]發(fā)現轉基因番茄中Aco的表達量顯著低于野生型，且轉基因植株成熟后果實中檸檬酸和蘋果酸含量均增加了50%。楊瀅瀅等[25]認為臍橙果實中檸檬酸含量下降可能是由CitAco、CitIDH1和CitIDH3上調表達引起的。由此可以推測，CS1在‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’中合成檸檬酸起關鍵作用，而Aco2-1、NAD-IDH在‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’降解檸檬酸中起關鍵作用。結合檸檬酸含量與檸檬酸代謝相關基因表達量的變化可以得知栽培棗品種‘羅江調元棗’降解檸檬酸的能力高于‘圓形小酸棗’。

4 結論

本研究通過對棗和酸棗果實中的有機酸組分與含量進行HPLC法測定，發(fā)現‘圓形小酸棗’以積累檸檬酸和蘋果酸為主，‘羅江調元棗’以積累蘋果酸為主。FUM和PEPC4是‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’合成蘋果酸的關鍵基因，MDH1是‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’降解蘋果酸的關鍵基因。CS1是‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’檸檬酸合成的關鍵基因；Aco2-1、NAD-IDH1-1、NAD-IDH1-2及NAD-IDH5是‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’檸檬酸降解的關鍵基因。檸檬酸降解基因的差異表達是導致‘圓形小酸棗’和‘羅江調元棗’有機酸含量出現較大差異的原因。