獼猴桃褪黑素合成相關(guān)基因AcTDC、AcT5H和AcSNAT的克隆與表達分析

呂曉雨，劉芯伶，張雪峰，梁 東，夏 惠

（四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院，成都 611130）

褪黑素（melatonin，MT），化學名稱為N-乙酰-5-甲氧基色胺，是色氨酸的吲哚衍生物。褪黑素最早從奶牛的松果體中被分離，并長期被認為只存在于動物體內(nèi)，直到1995年在高等植物中被發(fā)現(xiàn)[1]。此后褪黑素在植物中的研究熱度持續(xù)升高。褪黑素作為一種生長激素，能夠促進種子萌發(fā)[2]、側(cè)根生長[3]以及提高光合作用效率[4]等。在抗逆性方面，外源褪黑素處理在高溫[5]、干旱[6]、重金屬[7]以及鹽害[8]等非生物脅迫下對植物有積極作用，還可以調(diào)控花的開放[9]、提高果實品質(zhì)[10]。隨著對褪黑素的研究不斷深入，其合成被發(fā)現(xiàn)存在著多條途徑。當起始產(chǎn)物為色氨酸時，色氨酸通過色氨酸脫羧酶（Tryptophan decarboxylase，TDC）生成色胺，接著在色胺-5-羥化酶（Tryptophan-5-hydroxylase，T5H）的作用下羥基化生成5-羥色胺，5-羥色胺-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（Serotonin N-acetyltransferase，SNAT）將其乙酰化生成N-乙酰-5-羥色胺，最后通過N-乙酰-5-羥色胺甲基轉(zhuǎn)移酶（N-acetyl-serotonin methyltransferase，ASMT）或咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（Caffeic acid O-methyltransferase，COMT）甲基化生成褪黑素，而后兩步順序是可變的[11]。目前，褪黑素合成途徑中的相關(guān)基因多在模式植物中被克隆，如在水稻中，抑制T5H的表達會增加褪黑素水平[12]；但在番茄中，SNAT的表達下調(diào)后，褪黑素水平相應減少[13]。

獼猴桃為獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia Lindl.）多年生藤本落葉果樹。我國是獼猴桃的原產(chǎn)地，獼猴桃種質(zhì)資源極為豐富，經(jīng)濟栽培價值較高?！吨袊J猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展報告》數(shù)據(jù)顯示，截至2019年底，我國的獼猴桃栽培面積達29萬hm2，總產(chǎn)量達300萬t，均位居世界第一。被譽為“水果之王”的獼猴桃，有豐富的糖、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)及有機物，其抗氧化性能在水果中位居前列，在抗癌、治療心血管疾病方面也有一定療效[14]。獼猴桃為肉質(zhì)根，葉片被毛大而稠密，莖部髓質(zhì)較大，對水分要求高且蒸騰作用強，不宜強光直射，目前主要用于商業(yè)種植的中華獼猴桃、美味獼猴桃和軟棗獼猴桃有著較弱的耐旱性、耐澇性和抗風能力，此外在對耐鹽害能力的研究中獼猴桃也表現(xiàn)出明顯的鹽害癥狀[15]。

此前已有研究報道，施加外源褪黑素可以提高獼猴桃在干旱[16]、高溫[17]和鹽脅迫[18]下的抗逆性，但具體機制尚不明晰，且獼猴桃中褪黑素合成的相關(guān)基因也未見報道。本試驗克隆了獼猴桃中褪黑素合成途徑的AcTDC、AcT5H和AcSNAT基因并對其進行表達分析，為深入研究褪黑素在獼猴桃抗逆性中的作用機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理

試驗材料取于‘金實1號’獼猴桃盆栽實生苗，種植于四川農(nóng)業(yè)大學大棚內(nèi)?！饘?號’是四川省自然資源與科學研究院從野生獼猴桃實生后代中選育出的四倍體中華黃肉獼猴桃品種，對潰瘍病有較強的抗性。于2019年1月選取‘金實1號’的飽滿種子4℃層積2個月后進行4℃、12 h與25℃、12 h交替的變溫催芽處理。待種子露白后播入穴盤（基質(zhì)為草炭土∶椰殼∶珍珠巖=2∶2∶1），放于溫度為(25±2)℃、光強為4 860 μmol/（m2/s）（12 h/12 h）的培養(yǎng)室中生長。待第1片真葉展開后，開始澆1/2Hoagland營養(yǎng)液，每周澆一次，其間補充清水。待幼苗長至6片真葉后，將其移至營養(yǎng)缽（20 cm×20 cm）中(基質(zhì)為草炭土∶椰殼∶珍珠巖=2∶2∶1)，每個營養(yǎng)缽植入3株幼苗，轉(zhuǎn)移到室外避雨棚內(nèi)常規(guī)管理。2周后待幼苗適應遮雨棚環(huán)境，選取長勢一致的實生苗90盆，平均分為5組：①正常生長組（CK）、②干旱脅迫組（DCK）、③褪黑素處理組（MT+D）、④脫落酸處理組（ABA+D）、⑤褪黑素和脫落酸處理組（MT+ABA+D）進行處理，每組重復6盆，重復3次。干旱處理前，對MT+D處理、MT+ABA+D處理用100 μmol/L褪黑素溶液進行根灌，每2 d一次，共4次，每次200 mL；其他處理組根灌等量清水。第4次根灌褪黑素的次日（設(shè)為干旱處理0 d），除CK組則正常澆水外，其余組均進行干旱處理，控制澆水，保持土壤水勢為-1.5 MPa左右。于干旱的第0、2、4、6、8和10天對ABA+D和MT+ABA+D處理組葉面噴施10 mL ABA溶液，濃度為25 μmol/L，其余處理組則葉面噴施等量清水。在干旱處理的第20天對各處理的獼猴桃從下往上數(shù)第4～8節(jié)位的葉片進行取樣。采樣后現(xiàn)場將樣品放入液氮進行速凍，在-80℃冰箱保存。

1.2 RNA提取與cDNA第一鏈合成

將-80℃保存的材料剪碎到研缽中，加入液氮研磨至粉末，利用改良的CTAB法[19]進行總RNA的提取。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。核酸蛋白測定儀測定其濃度，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.3 基因克隆

在獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫（http：//kiwifruitgenome.org/）檢索TDC、T5H和SNAT的序列信息，使用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計基因引物（表1）。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR反應體系如下：1 μL cDNA、2.5 μL Buffer、2.5 μL MgCl2、0.5 μL dNTPs（10 mmol/L）、0.5 μL Taq酶、1 μL引物（10 mmol/L）和16 μL ddH2O。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94 ℃變性45 s；退火，45 s；72 ℃延伸1 min，循環(huán)34次；72℃修復延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶切膠回收?；厥债a(chǎn)物與克隆載體pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中；挑取陽性菌落進行菌液PCR鑒定，凝膠電泳檢測后選取有目標條帶的菌液送成都擎科生物有限公司測序。

表1 引物序列及用途Table 1 Primer sequences and usage

1.4 克隆基因的生物信息學分析

利用Lasergene 7.1中的Editseq預測基因的開放閱讀框并將其翻譯為氨基酸序列；通過ProtParam對蛋白理化性質(zhì)進行分析；利用Prot Scale分析蛋白親疏水性；TMHMM Server v.2.0分析氨基酸的跨膜域結(jié)構(gòu)，SignalP-4.0 Server進行信號肽預測；SOPMA和SWISS-MODEL分別預測蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)；Cell-PLoc 2.0進行亞細胞定位預測；NCBI推測其保守結(jié)構(gòu)域；用Jalview進行多重序列比對，MEGA 7.0構(gòu)建進化樹。

1.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

CTAB法分別提取‘金實1號’根、莖、葉和幼果4個組織的RNA以及不同處理后葉片的RNA，參照寶生物工程（大連）有限公司的PrimeScript?RT reagent kit with gDNA eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，使用CFX96實時系統(tǒng)C1000熱循環(huán)儀（Bio-RAD，Hercules，CA，美國）進行qRT-PCR，每個樣品設(shè)3次技術(shù)重復。熒光定量PCR反應體系：TB Green 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 6.9 μL。擴增條件如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；退火30 s，循環(huán)40次；95℃ 10 s；65℃ 5 s；95℃ 0.5℃。相對表達水平使用2-ΔΔCT方法計算。反應所用引物見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 AcTDC、AcT5H和AcSNAT基因克隆及ORF序列分析

根據(jù)獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫獲取TDC、T5H和SNAT序列，分別命名為AcTDC（Gene ID：Acc19037），AcT5H（Gene ID：Acc32774），AcSNAT（Gene ID：Acc31246）。以葉片cDNA為模板進行RT-PCR擴增，產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳分析后（圖1），進行載體連接、轉(zhuǎn)化和測序，AcTDC的ORF區(qū)長度為1 506 bp，編碼501個氨基酸；AcT5H的ORF區(qū)長度為618 bp，編碼205個氨基酸；AcSNAT的ORF區(qū)長度為579 bp，編碼192個氨基酸。

圖1 AcTDC、AcT5H和AcSNAT的PCR擴增產(chǎn)物Figure 1 PCR products of AcTDC、AcT5H and AcSNAT

2.2 AcTDC、AcT5H和AcSNAT的蛋白生物信息學分析

ProtParamd的蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果見表2。NCBI工具Conserved domains結(jié)果顯示AcTDC可能屬于AAT蛋白超級家族，AcT5H可能屬于P450超級家族，AcSNAT屬于GNAT超級家族。TMHMM Server v.2.0和SignalP-4.0 Server分別進行跨膜域結(jié)構(gòu)分析與信號肽預測，顯示3個蛋白均沒有跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，為非分泌性蛋白。利用在線網(wǎng)站Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）進行亞細胞定位預測，結(jié)果顯示AcTDC、AcT5H、AcSNAT分別位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體中。SOPMA對二級結(jié)構(gòu)的預測顯示，AcTDC蛋白中α螺旋（45.11%）和無規(guī)則卷曲（34.93%）為主，延伸鏈（14.17%）和β轉(zhuǎn)角（5.79%）占比較少；AcT5H蛋白中α螺旋（38.54%）和無規(guī)則卷曲（38.05%）為主，其次為延伸鏈（15.61%）和β轉(zhuǎn)角（7.8%）；AcSNAT蛋白以無規(guī)則卷曲（36.46%）、α螺旋（33.33%）和延伸鏈（20.83%）為主，β轉(zhuǎn)角占9.38%。

表2 AcTDC、AcT5H、AcSNAT的蛋白理化性質(zhì)分析Table 2 Physical and chemical properties of AcTDC，AcT5H and AcSNAT proteins

2.3 氨基酸結(jié)構(gòu)分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

將AcTDC、AcT5H和AcSNAT氨基酸序列分別通過NCBI上的Blastp進行比對后發(fā)現(xiàn)，AcTDC與大部分比對序列相似性在73%～80%之間，AcT5H與大多數(shù)序列相似性在65%～75%之間，AcSNAT在65%～78%之間，說明3個基因所編碼的蛋白都有較高的保守性。篩選相似性較高的氨基酸序列，運用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，其中AcTDC與桃的親緣關(guān)系較近（圖2）；AcT5H與咖啡、辣椒親緣關(guān)系較近（圖3）；AcSNAT與茶的親緣關(guān)系較近（圖4）。

圖2 AcTDC蛋白與其它植物TDC蛋白的多序列比對（A）和系統(tǒng)進化分析（B）Figure 2 Multiple sequence alignment(A)and phylogenetic analysis(B)of AcTDC with those other plant TDC proteins

圖3 AcT5H蛋白與其它植物T5H蛋白的多序列比對（A）和系統(tǒng)進化分析（B）Figure 3 Multiple sequence alignment(A)and phylogenetic analysis(B)of AcT5H with those other plant T5H proteins

圖4 AcSNAT蛋白與其它植物T5H蛋白的多序列比對（A）和系統(tǒng)進化分析（B）Figure 4 Multiple sequence alignment(A)and phylogenetic analysis(B)of AcSNAT with those other plant SNAT proteins

2.4 AcTDC、AcT5H和AcSNAT基因在不同部位中的表達分析

使用qRT-PCR技術(shù)檢測AcTDC、AcT5H和AcS?NAT基因在不同部位中的表達情況，由圖5可以看出AcTDC僅在果實中表達，在根、莖和葉中沒有表達；AcT5H在莖、幼果中表達量相對較高，根中極少；AcSNAT在葉片中表達量極高，莖、幼果次之，根中較低。

2.5 AcTDC、AcT5H和AcSNAT在逆境脅迫下的表達分析

測定不同處理后葉片中基因的表達情況，結(jié)果顯示逆境脅迫對基因表達量的影響較大。正常情況下未能檢測到葉片中AcTDC的表達，處理后AcTDC在葉片中仍不表達；AcT5H在ABA+D和MT+ABA+D處理后下調(diào)顯著大于MT+D處理，表明ABA對AcT5H表達的抑制作用更明顯；由圖6可知，AcS?NAT在處理后表達量相對正常葉片下調(diào)都較為顯著，但各處理之間差異不顯著。

圖5 AcTDC（A）、AcT5H（B）和AcSNAT（C）基因在不同部位中的表達Figure 5 The expression of AcTDC(A)、AcT5H(B)and AcSNAT(C)in different parts

圖6 AcT5H（A）和AcSNAT（B）基因在逆境脅迫下的表達Figure 6 The expression of AcT5H(A)and AcSNAT(B)in abiotic stress

3 討論

此前研究證明，外源褪黑素預處理在高溫脅迫下可提高獼猴桃抗氧化能力[17]，在鹽脅迫下能夠緩解過氧化氫的積累，提高清除活性氧的能力[20]，在干旱環(huán)境中可提高保水能力[16]。綜合來看，褪黑素對提高獼猴桃抗逆性有重要作用，因此本研究克隆了參與獼猴桃中褪黑素合成的AcTDC、AcT5H以及Ac?SNAT基因，為后續(xù)基因功能鑒定及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

長春花屬植物中TDC的分子量在54 000左右[21]，與本試驗較為一致，ORF區(qū)編碼500個氨基酸[22]。在探究長春花吲哚生物堿的合成時，TDC位于細胞質(zhì)[23]，而AcTDC蛋白定位預測顯示在線粒體中，其準確定位還有待進一步驗證。qRT-PCR結(jié)果顯示，AcTDC在獼猴桃根、莖和葉中不表達，但在幼果中有一定表達。研究表明，即使在誘導之后，TDC在總蛋白中僅有0.03%[21]。獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫（http：//kiwifruitgenome.org/）顯示，幼果中TDC有相對高的表達量。在褪黑素合成途徑中，TDC將色氨酸轉(zhuǎn)化為色胺，色胺在獼猴桃鮮果重中有較高的比例，同時發(fā)現(xiàn)，在開花后24 d的幼果中TDC的表達量高于其他時期果實中的表達量[24]。

通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)AcT5H蛋白有P450結(jié)構(gòu)域，并在亞細胞定位預測中顯示有可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。研究表明水稻SL蛋白是一種細胞色素P450酶，有T5H活性，從而推測就是催化色胺轉(zhuǎn)化為5-羥色胺的T5H，其亞細胞定位也位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[25]。獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫顯示，T5H在果實中的表達量高于葉片，與試驗結(jié)果相符。目前關(guān)于植物中褪黑素合成過程中T5H的相關(guān)研究較少，但已有試驗證明抑制T5H表達可以增加褪黑素含量[12]。水稻中T5H在根中的活性最強，這與根中的血清素含量高有關(guān)[26]，而血清素在獼猴桃幼果中含量也較為豐富[24]，推測與本試驗中T5H在幼果中的表達量相對較高相關(guān)聯(lián)。

AcSNAT蛋白顯示屬于GNAT超家族，該家族可以催化乙?；霓D(zhuǎn)移，從乙酰輔酶A到一系列分子，如氨基糖苷和芳基烷基胺[27]。AcSNAT蛋白的亞細胞定位預測顯示有可能在葉綠體中，Y.Byeon等[28]發(fā)現(xiàn)水稻SNAT在煙草葉片中表達時定位于葉綠體，而水稻SNAT2不止定位于葉綠體，在細胞質(zhì)中也有表達[29]，同時，番茄[13]和煙草[30]中SNAT也定位于葉綠體，并且Byeon的數(shù)據(jù)表明有多種SNAT基因參與了褪黑素的合成[29]，因此獼猴桃中SNAT的定位還有待進一步探究。水稻中，嫩枝的SNAT表達量高于根系[31]，擬南芥中莖、葉中SNAT表達量高于根[32]，而試驗結(jié)果也顯示SNAT在葉中有很高的表達，這可能與其定位和功能有關(guān)。

本研究對獼猴桃褪黑素合成相關(guān)基因AcTDC、AcT5H和AcSNAT的克隆與表達初步進行了分析，但其完整途經(jīng)中尚有基因未進行克隆，有關(guān)基因的功能機制及轉(zhuǎn)錄調(diào)控還有待進一步探究。