毛蕊異黃酮對(duì)肝硬化大鼠腸黏膜屏障功能的影響及其機(jī)制

劉 琦, 徐 新, 王正根

（南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001）

肝硬化常見(jiàn)于慢性肝病的終末期，由多種因素長(zhǎng)期干預(yù)引起肝臟變形變硬、肝細(xì)胞壞死和假小葉形成，進(jìn)而造成彌漫性肝損傷［1］。肝硬化晚期會(huì)導(dǎo)致多器官或組織的受累，出現(xiàn)消化道出血、繼發(fā)性感染、肝性腦病和肝癌等主要并發(fā)癥。多項(xiàng)研究［2-5］顯示：肝硬化可使腸組織處于缺血缺氧狀態(tài)，引起腸組織部分壞死，細(xì)菌移位，導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷，而腸道生態(tài)失調(diào)會(huì)再次引起免疫刺激加速肝硬化，表明肝硬化與腸黏膜屏障損傷存在相互影響的關(guān)系［2-3］。炎癥是造成腸黏膜屏障損傷的主要 因 素，而Toll 樣 受 體4/核 因 子-κB （Toll-like receptor 4/nuclear factor kappa B，TLR4/NF-κB）信號(hào)通路是調(diào)控炎癥最常見(jiàn)的信號(hào)通路之一［4］。在炎癥性腸病中，TLR4/NF-κB 信號(hào)通路在腸組織中高度活化，并且阻斷該信號(hào)通路可改善腸道炎癥反應(yīng)［5］。毛蕊異黃酮是中藥黃芪的主要成分，具有抗菌效果［6］。研究［7］顯示：毛蕊異黃酮可通過(guò)調(diào)控整合素β1/NF-κB 通路，抑制NF-κB 表達(dá)，從而達(dá)到抗炎效果，對(duì)胃黏膜損傷起到保護(hù)作用。然而，毛蕊異黃酮能否對(duì)肝硬化致腸黏膜屏障功能損傷具有改善作用，尚不明確。因此，本研究擬構(gòu)建肝硬化大鼠模型，觀察毛蕊異黃酮對(duì)肝硬化大鼠腸黏膜屏障功能的影響，并探討其作用機(jī)制，為在臨床上應(yīng)用毛蕊異黃酮治療肝硬化致腸損傷提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器SPF 級(jí)雄性SD大鼠80 只，鼠齡6 周，體質(zhì)量200～230 g，由廣東至遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2021-0057；在無(wú)特定病原體條件下飼養(yǎng)，溫度21 ℃～24 ℃，相對(duì)濕度50%～55%，明暗光照各12 h，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。毛蕊異黃酮［ 高 效 液 相 色 譜 法 （high performance liquid chromatography，HPLC）］ ≥98%，貨號(hào)：JOT-10389］購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，四氯化碳（CCl4，0.3 mg·L－1，貨號(hào)：C119833） 購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，大鼠白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）（貨號(hào)：CSB-E08055r）、大鼠白細(xì)胞介素6 （interleukin-6，IL-6）（貨號(hào)：CSB-E04640r） 和 大 鼠 腫 瘤 壞 死 因 子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）（貨 號(hào)：CSB-E11987r）購(gòu)自武漢華美生物有限公司，D-乳酸（d-lactate，D-LA）（貨號(hào)：SBJ-R0031）、二胺氧化酶（diamine oxidase， DAO）（貨 號(hào)： SBJ-R0162）、 內(nèi) 毒 素（endotoxin，ET）（貨號(hào)：SBJ-R0392） 和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司，TLR4 （編號(hào)：sc-293072）、NF-κB p65 （編號(hào)：sc-8008）、NF-κB 抑 制 因 子α （IκBα，編 號(hào)：sc-1643） 和GAPDH （編號(hào)：sc-365062） 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。電泳儀（型號(hào)：164-5056）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，正置顯微鏡（型號(hào)：CX23）購(gòu)自日本Olympus 公司，全自動(dòng)生化分析儀（型號(hào)：BK-200）購(gòu)自濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模和分組將80 只SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=12）和造模組（n=68），造模組大鼠采用CCl4聯(lián)合乙醇復(fù)合法誘導(dǎo)肝硬化大鼠模型［8］：造模組大鼠以10%乙醇溶液作為唯一飲用水，并根據(jù)大鼠體質(zhì)量，首次皮下注射劑量為5 mL·kg－150%CCl4- 橄 欖 油 溶 液， 后 續(xù) 劑 量為3 mL·kg－1，每4 d 1 次，連 續(xù)9 周。9 周 內(nèi) 共18 只大鼠死亡，隨機(jī)從造模組中抽取3 只大鼠用于病理組織學(xué)檢測(cè)，以肉眼可見(jiàn)肝臟組織結(jié)節(jié)及病理顯示假小葉形成即視為造模成功［9］。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量毛蕊異黃酮組和高劑量毛蕊異黃酮組，每組12 只。分組后，低和高劑量毛蕊異黃酮組大鼠分別給予5 和20 mg·kg－1毛蕊異黃酮灌胃，對(duì)照組和模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，每天1 次，連續(xù)4 周。

1.3 生物化學(xué)檢測(cè)各組大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（asportate transaminase，AST）活性末次灌胃24 h 后，取各組大鼠腹主動(dòng)脈血，室溫放置30 min，2600 r·min－1離心10 min，分離血清，按照說(shuō)明書使用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清中ALT（U·L－1）和AST（U·L－1）的活性。

1.4 HE 染色觀察各組大鼠肝臟和回腸組織病理形態(tài)表現(xiàn)取各組大鼠肝臟和回腸組織，將已固定好的組織進(jìn)行修剪，流水沖洗30 min，置于70%、80%、90%、95%和100%酒精中脫水，二甲苯中透明，浸蠟包埋及切片、熱水展片、45 ℃烤片后制備石蠟切片（厚度為6 μm）。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、入100% （Ⅰ和Ⅱ）、90%、80%、70%和50%酒精并至水、蒸餾水漂洗，再將切片放入蘇木精水溶液中染色10 min，流水沖洗1 min，1%鹽酸酒精2 s，流水過(guò)洗2 s，0.5% 伊紅溶液染色3 min，蒸餾水稍洗2 s，入80%、95%和100%酒精中脫水15 s，二甲苯透明，中性樹膠封固后，觀察大鼠肝臟和回腸組織病理形態(tài)學(xué)。其中回腸組織置于顯微鏡（×100）下隨機(jī)選取5 個(gè)視野參考Nadler 標(biāo)準(zhǔn)［10］進(jìn)行雙盲評(píng)分，取其平均值，病理評(píng)分≥3 分視為腸損傷。

1.5 ELISA 法檢測(cè)各組大鼠血清中D-LA、DAO和ET 水平及回腸組織中炎癥因子水平取0.2 g大鼠回腸組織加入1.8 mL 生理鹽水研磨制備組織勻漿，3800 r·min－1離心20 min，取上清凍存。取50 μL 回腸組織上清和血清，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明 書 進(jìn) 行 操 作，測(cè) 定 血 清 中D-LA （mg·L－1）、DAO （U·mL－1） 和ET （EU·mL－1） 水平 及回腸組 織中炎癥因子IL-1β、TNF-α 和IL-6（均為μg·L－1）水平。

1.6 Western blotting 法檢測(cè)各組大鼠回腸組織中TLR4/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平取各組大鼠0.1 g 回腸組織，加入預(yù)冷的RIPA 裂解液提取總蛋白，采用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。取30 μg（20 μL） 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)PVDF 膜，5%的脫脂奶粉常溫封閉1.5 h，分別加入TLR4（1∶1000）、NF-κB p65（1∶1000）、NF-κB 抑 制 因 子（NF-κB inhibitor α， IκB α）（1∶1000） 及內(nèi)參GAPDH （1∶1000） 抗體，4 ℃孵育一夜。次日，加入相應(yīng)二抗（1∶10000）常溫孵育1 h，TBST 緩沖液清洗3 次，ECL 試劑發(fā)光顯影。應(yīng)用Image J 進(jìn)行條帶灰度掃描分析，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠血清中ALT 和AST 活性，D-LA、DAO 和ET 水平，回腸組織病理評(píng)分，回腸組織中IL-1β、 TNF-α 和IL-6 水 平， TLR4、NF-κB p65 和IκBα 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中ALT 和AST 活性與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中ALT 和AST 活性明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，高劑量毛蕊異黃酮組大鼠血清中ALT 和AST 活性明顯降低（P＜0.05），而低劑量毛蕊異黃酮組ALT 和AST活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與低劑量毛蕊異黃酮組比較，高劑量毛蕊異黃酮組大鼠血清中ALT 和AST 活性明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清中ALT 和AST 活性Tab. 1 Activities of ALT and AST in serum of rats in various groups [n=12,±s,ρβ/(U·L-1)]

表1 各組大鼠血清中ALT 和AST 活性Tab. 1 Activities of ALT and AST in serum of rats in various groups [n=12,±s,ρβ/(U·L-1)]

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of calycosin group.

Group Control Model Calycosin Low dose High dose FP ALT 32.93±3.7493.86±6.49*92.10±3.6750.99±5.23△#190.461＜0.01 AST 63.46±2.98128.14±7.66*131.07±6.8879.36±4.77△#170.394＜0.01

2.2 各組大鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)HE 染色結(jié)果顯示：對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列分布正常，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠彌漫性纖維化形成纖維間隔致肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，形成假小葉，并伴隨著大量炎性細(xì)胞和脂肪變性。與模型組比較，高劑量毛蕊異黃酮組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，無(wú)明顯纖維增生，可見(jiàn)部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和脂肪變性；而低劑量毛蕊異黃酮組大鼠肝組織病變情況與模型組一致。與低劑量毛蕊異黃酮組比較，高劑量毛蕊異黃酮組大鼠肝臟損傷情況明顯改善。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×100）Fig.1 Pathomorphology of liver tissue of rats in various groups (HE, ×100)

2.3 各組大鼠血清中D-LA、DAO 和ET 水平與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中D-LA、DAO 和ET 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，高劑量毛蕊異黃酮組大鼠血清中D-LA、DAO 和ET水平明顯降低（P＜0.05），而低劑量毛蕊異黃酮組上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與低劑量毛蕊異黃酮組比較，高劑量毛蕊異黃酮組大鼠血清中D-LA、DAO 和ET 水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清中D-LA、DAO 和ET 水平Tab. 2 Levels of serum D-LA, DAO, and ET of rats in various groups (n=12，±s）

表2 各組大鼠血清中D-LA、DAO 和ET 水平Tab. 2 Levels of serum D-LA, DAO, and ET of rats in various groups (n=12，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of calycosin group.

Group Control Model Calycosin Low dose High dose FP D-LA[ρB/（mg·L-1）]3.46±0.6413.38±1.47*12.54±1.697.07±0.93△#70.057＜0.01 DAO[λB/（U·mL-1）]0.59±0.112.49±0.45*2.50±0.361.30±0.26△#40.386＜0.01 ET[λB/（EU·mL-1）]0.55±0.040.98±0.05*0.96±0.040.76±0.02△#354.622＜0.01

2.4 各組大鼠回腸組織病理形態(tài)表現(xiàn) HE 染色結(jié)果顯示：對(duì)照組大鼠回腸組織固有層無(wú)水腫現(xiàn)象，絨毛排列整齊，病理結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠回腸組織固有層聚集大量淋巴細(xì)胞，間質(zhì)水腫，上皮結(jié)構(gòu)紊亂，大量絨毛及腺體壞死。與模型組比較，高劑量毛蕊異黃酮組大鼠回腸組織結(jié)構(gòu)有所改善，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和固有層水腫等現(xiàn)象減輕，部分絨毛壞死或斷裂；而低劑量毛蕊異黃酮組大鼠回腸組織病理形態(tài)表現(xiàn)與模型組一致。見(jiàn)圖2。對(duì)照組、模型組、低劑量毛蕊異黃酮組和高劑量毛蕊異黃酮組大鼠回腸組織病理學(xué)評(píng)分分別為（0.33±0.20）、（3.74±0.32）、（3.18±0.35）和（1.79±0.38）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=114.702，P＜0.01）。與對(duì)照組比較，模型組大鼠回腸組織病理學(xué)評(píng)分明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，高劑量毛蕊異黃酮組大鼠回腸組織病理學(xué)評(píng)分明顯降低（P＜0.05），而低劑量毛蕊異黃酮組大鼠回腸組織病理學(xué)評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與低劑量毛蕊異黃酮組比較，高劑量毛蕊異黃酮組大鼠回腸組織病理學(xué)評(píng)分明顯降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠回腸組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×100）Fig.2 Pathomorphology of ileum tissue of rats in various groups (HE, ×100)

2.5 各組大鼠回腸組織中炎癥因子水平與對(duì)照組比較，模型組大鼠回腸組織中IL-1β、TNF-α 和IL-6 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，高劑量毛蕊異黃酮組大鼠回腸組織中IL-1β、TNF-α 和IL-6 水平明顯降低（P＜0.05），而低劑量毛蕊異黃酮組大鼠回腸組織中上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與低劑量毛蕊異黃酮組比較，高劑量毛蕊異黃酮組大鼠回腸組織中IL-1β、TNF-α 和IL-6 水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠回腸組織中IL-1β、TNF-α 和IL-6 水平Tab. 3 Levels of IL-1β、TNF-α and IL-6 in ileum tissue of rats in various groups [n=12,±s, ρβ/(μg·L-1)]

表3 各組大鼠回腸組織中IL-1β、TNF-α 和IL-6 水平Tab. 3 Levels of IL-1β、TNF-α and IL-6 in ileum tissue of rats in various groups [n=12,±s, ρβ/(μg·L-1)]

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of calycosin group.

Group Control Model Calycosin Low dose High dose FP IL-1β 350.44±16.74635.68±19.87*634.93±17.03477.24±15.14△#764.723＜0.01 TNF-α 49.67±3.53157.19±4.59*158.10±5.2689.52±5.40△#630.948＜0.01 IL-651.31±7.19123.98±10.40*125.68±10.7676.28±7.38△#195.623＜0.01

2.6 各組大鼠回腸組織中TLR4/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，模型組大鼠回腸組織中TLR-4 和NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），IκBα 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，高劑量毛蕊異黃酮組大鼠回腸組織中TLR-4 和NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），IκB α 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），而低劑量毛蕊異黃酮組大鼠回腸組織中上述各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與低劑量毛蕊異黃酮組比較，高劑量毛蕊異黃酮組大鼠回腸組織中TLR-4 和NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），IκBα 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖3 和表4。

表4 各組大鼠回腸組織中TLR4/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平Tab. 4 Expression levels of TLR4/NF-κ B signaling pathway related proteins in ileum tissue of rats in various groups (n=12，±s）

表4 各組大鼠回腸組織中TLR4/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平Tab. 4 Expression levels of TLR4/NF-κ B signaling pathway related proteins in ileum tissue of rats in various groups (n=12，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of calycosin group.

Group Control Model Calycosin Low dose High dose FP TLR-40.47±0.131.13±0.24*1.09±0.200.64±0.18△#14.837＜0.01 NF-κB p650.25±0.101.34±0.29*1.31±0.270.50±0.19△#30.726＜0.01 IκBα 0.63±0.090.21±0.11*0.22±0.100.49±0.05△#27.314＜0.01

圖3 各組大鼠回腸組織中TLR4/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖Fig. 3 Electrophoregram of expressions of TLR4/NFκB signaling pathway related proteins in ileum tissue of rats in various groups

3 討論

前期研究［8-10］顯示：在中醫(yī)學(xué)中肝硬化由濕熱所致，肝氣郁積，影響脾胃，致血行不暢、脈絡(luò)阻塞，造成積聚或癥癜，后期則出現(xiàn)水蠱，提示肝硬化引起消化不良，導(dǎo)致腸道內(nèi)細(xì)菌等有毒物質(zhì)堆積，導(dǎo)致腸黏膜損傷，機(jī)體免疫力下降。臨床研究［11-12］表明：50%的肝硬化患者表現(xiàn)出一種或多種癥狀，如腹水、因肝性腦病引起的不同程度的意識(shí)模糊和靜脈曲張或細(xì)菌感染引起的急性胃腸出血等。由于肝硬化發(fā)病機(jī)制多樣，臨床常通過(guò)檢測(cè)ALT 和AST 活性及組織活檢來(lái)確診疾病。且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，CCl4聯(lián)合乙醇復(fù)合法誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型在病理生理等方面可完全模擬人肝硬化誘發(fā)腸道疾病，結(jié)果顯示：血清中ALT 和AST 活性升高，肝組織出現(xiàn)假小葉，腸組織絨毛大量壞死，腸道內(nèi)炎癥和有毒物質(zhì)爆發(fā)，產(chǎn)生大量腹水［13］，與本研究中模型組結(jié)果一致，提示模型制備成功。研究［14-15］顯示：毛蕊異黃酮灌服單向腸灌流模型大鼠發(fā)現(xiàn)其吸收機(jī)制為主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，且在小腸中吸收最好，能夠在一定程度上保證腸道自然生理狀態(tài)。研究［14］證實(shí)：毛蕊異黃酮可上調(diào)IκBα 來(lái)抑制由缺血再灌注引起的NF-κB 信號(hào)通路的激活，降低腦組織炎癥因子，從而保護(hù)腦組織。但毛蕊異黃酮在肝硬化中能否發(fā)揮保護(hù)腸道的作用，目前還未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用高劑量毛蕊異黃酮干預(yù)后，肝組織和腸組織損傷減輕，肝酶含量降低，并且腸組織中有害物質(zhì)和炎癥因子減少，同時(shí)抑制了TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，初步表明毛蕊異黃酮對(duì)肝硬化引起的腸損傷有改善作用，可能與腸黏膜屏障、炎癥和TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。

腸黏膜屏障是阻止細(xì)菌和有害物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)及其他組織的第一道防線。腸黏膜屏障受損后，氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能及時(shí)被黏膜吸收，代謝產(chǎn)物堆積，引起腸道通透性的增加（漏腸）和細(xì)菌的易位，促進(jìn)微生物代謝產(chǎn)物通過(guò)腸腔穿過(guò)腸黏膜屏障到達(dá)肝臟，導(dǎo)致膽管酸代謝受損，促進(jìn)全身炎癥和腸道運(yùn)動(dòng)障礙［16］。研究［17-19］顯示：非酒精性脂肪性肝病小鼠攝入果糖，可引起D-LA 活性增加，導(dǎo)致腸道滲漏和內(nèi)毒素血癥；且在缺血性結(jié)腸炎患者血清中D-LA、DAO 和ET 水平升高。急性失代償性肝硬化中存在腸道炎癥，通過(guò)評(píng)估糞便細(xì)胞因子譜以及其他標(biāo)志物，如D-LA、脂肪酸結(jié)合蛋白-2和糞鈣保護(hù)素，從而確定腸道失調(diào)可影響腸道屏障完整性［20］。表明D-LA、DAO 和ET 是造成腸黏膜屏障損傷的標(biāo)志物。研究［21］顯示：毛蕊異黃酮對(duì)斷奶仔豬由于多種應(yīng)激源產(chǎn)生的胃腸道感染具有治療作用，可治療志賀氏菌和腸道致病菌大腸桿菌等細(xì)菌引起的疾病和感染，并且具有增強(qiáng)斷奶仔豬腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡的潛力。本研究結(jié)果顯示：高劑量毛蕊異黃酮組大鼠血清中D-LA、DAO 和ET 水平明顯降低，腸絨毛趨于正常，表明毛蕊異黃酮可減少體內(nèi)有害細(xì)菌和毒素蓄積，提高機(jī)體對(duì)有害物質(zhì)的消除能力，從而保護(hù)腸黏膜屏障。

TLR-4/NF-κB 信號(hào)通路是炎癥的調(diào)節(jié)通路［22］。 先天免疫系統(tǒng)通過(guò)病原體識(shí)別受體（PPRs） 特異性識(shí)別PAMPs，從而有效啟動(dòng)免疫反應(yīng)。TLR 作為PPRs 家族中的一員，是先天免疫系統(tǒng)中最重要的受體之一。TLR-4 是研究中最先發(fā)現(xiàn)的TLR，受到刺激后TLR-4 高表達(dá)，IκBα 降解，NF-κB p65 大 量釋放，從而誘導(dǎo)IL-1β、TNF-α 和IL-6 等 下 游 炎 癥 因 子 高 表 達(dá)［23］。研 究［24-25］顯 示：炎癥性腸病受多種分子機(jī)制調(diào)控，目前認(rèn)為引起炎癥級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)是導(dǎo)致腸黏膜損傷的核心原因，在膿毒癥誘導(dǎo)的腸屏障功能障礙大鼠腸組織中TLR-4/NF-κB 通路被明顯激活，促進(jìn)炎癥細(xì)胞釋放更多的炎癥介質(zhì)。此外，炎癥介質(zhì)進(jìn)一步加重了腸黏膜屏障功能的損傷，從而導(dǎo)致更多的致病菌和原發(fā)性血小板增多癥（ET）進(jìn)入血液。CHAO 等［26］研究顯示：毛蕊異黃酮明顯抑制促炎細(xì)胞因子mRNA 的表達(dá)，降低髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性，并且明顯抑制NF-κB 通路和JNK 的磷酸化，維持腸黏膜的完整，從而治療結(jié)腸炎。為進(jìn)一步探討毛蕊異黃酮對(duì)肝硬化大鼠腸黏膜保護(hù)作用的可能機(jī)制，本研究檢測(cè)TLR-4/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平及其下游炎癥因子，結(jié)果顯示：采用高劑量毛蕊異黃酮干預(yù)后，肝硬化大鼠回腸組織中TLR-4 和NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平及IL-1β、TNF-α 和IL-6炎癥因子水平明顯降低，IκBα 蛋白表達(dá)水平明顯升高，表明毛蕊異黃酮通過(guò)下調(diào)回腸組織中TLR-4/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)因子的活性，進(jìn)而降低炎癥因子的表達(dá)，從而減輕肝硬化大鼠腸黏膜屏障損傷。

綜上所述，毛蕊異黃酮能夠改善肝硬化大鼠腸黏膜屏障損傷并抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路。然而，毛蕊異黃酮是否對(duì)TLR4/NF-κB 信號(hào)通路靶向調(diào)控還不完善，后續(xù)研究還應(yīng)結(jié)合使用TLR4/NF-κB 信號(hào)通路抑制劑進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討。