miR-200家族及侵襲相關基因ZEB1、ZEB2和CTNNB1在顱咽管瘤組織中的表達及意義

張道寶，徐建國

顱咽管瘤(craniopharyngioma,CP)是常見的中樞神經系統(tǒng)腫瘤，任何年齡均可發(fā)病，但其常見的發(fā)病年齡呈雙峰分布，即主要有6～14歲和50～70歲兩個高發(fā)年齡段，同時CP是兒童最常見的鞍區(qū)占位性病變[1--2]。CP在病理學上可分為兩種亞型，即造釉細胞型顱咽管瘤(adamantinomatous craniopharyngioma，ACP)和鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤(papillary craniopharyngioma，PCP)[3]。CP的侵襲性研究已成為近年來的研究熱點，目前取得了一定進展，但是仍有很多不足。已有研究證實miR-200家族在腫瘤侵襲中起到重要作用，本研究初步探討了miR-200家族在CP組織中的表達情況及其意義。

1 材料和方法

1.1 材料 收集四川大學華西醫(yī)院2017年6月—2018年12月經手術切除的ACP、PCP新鮮標本各30例作為研究對象，并且選取同時期在華西醫(yī)院神經外科因顱腦外傷而行開顱手術切除的30例失活腦組織作為對照組。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審核批準，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法 HE染色觀察各組組織的病理變化；免疫組化法檢測各組組織中E-cadherin和β-catenin的變化；qRT-PCR測定各組組織中miR-200b-3p、miR-200a-3p、miR-200c-3p、miR-429-3p、miR-141-3p及ZEB1、ZEB2、CTNNB1相對表達水平。

2 結 果

2.1 各組HE染色情況 首先，對照組、PCP組和ACP組均有各自明顯的組織特征:對照組細胞分布均勻，無異常增生；PCP組由單一的多邊形密集排列的鱗狀上皮細胞(黃色箭頭指示)構成；而ACP組具有呈柵欄狀排列的上皮細胞(紅色箭頭指示)，有漩渦狀細胞簇(藍色箭頭指示)等特點。再次是腫瘤與周圍組織交界的特點：PCP組細胞與周圍組織交界線比較平整，沒有見到明顯向周邊組織延伸的跡象；而ACP組呈“指樣”或“島樣”深入周圍腦組織，呈浸潤性生長，侵襲性明顯(如黑色箭頭所示)。見圖1。

圖1 各組HE病理染色結果

2.2 免疫組化法檢測各組E-cadherin和β-catenin變化 根據鏡下染色深淺，與PCP相比，ACP的β-catenin的表達略有升高，且分布在細胞質或者細胞核，而PCP中β-catenin偏向于分布在細胞膜上(圖2A), 與之相反的是，ACP相對于PCP，E-cadherin的表達下降了(圖2B)。

A：β-catenin在ACP主要在細胞質或者細胞核內表達(黑色箭頭)，且表達較正常神經組織(藍色箭頭)及PCP(紅色箭頭)中升高； B：E-cadherin在ACP(黑色箭頭)的表達較在PCP(紅色箭頭)的表達降低

2.3 各組中miR-200家族成員相對表達水平 各組miRNA-200a的相對表達水平比較，ACP組低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組miRNA-200b的相對表達水平比較，ACP組低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組miRNA-200c的相對表達水平比較，ACP組低于對照組，也低于PCP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組miRNA-429的相對表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組miRNA-141的相對表達水平比較，ACP組低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

*/#表示P<0.05，**/##表示P<0.01，***/###表示P<0.001；*：normal vs ACP，#：PCP vs ACP

2.4 qRT-PCR測定各組侵襲相關基因相對表達水平 各組ZEB1、ZEB2、CTNNB1的相對表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，ACP組高于對照組，也高于PCP組。見圖4。

*：與normal相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；#：與PCP相比；#表示P<0.05，##表示P<0.01

3 討 論

多數(shù)CP在組織學上為良性腫瘤，惡性CP罕見，但在臨床病程中卻有著與惡性腫瘤相似的特征。術后易復發(fā)是CP，特別是ACP的一個重要特點。有文獻報道，CP術后患者經過10年隨訪，其復發(fā)率可高達到90%[4]。本研究對3組標本分別進行HE染色發(fā)現(xiàn)，正常腦組織細胞分布均勻，無異常增生；PCP組織由單一的多邊形密集排列的鱗狀上皮細胞構成，與周圍組織交界線比較平整，沒有見到明顯向周邊組織延伸的跡象；而ACP組織具有呈柵欄狀排列的上皮細胞，具有漩渦狀細胞簇等特點，呈“指樣”或“島樣”深入周圍腦組織，呈浸潤性生長，侵襲性明顯。

目前在人類基因組中，已發(fā)現(xiàn)一千多種miRNA，通過基因調控調著大約30%以上的人類基因[5]。miRNA參與對細胞各種生命活動的調節(jié)，包括正常細胞的增殖分化、凋亡，并和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的關系[6-8]。miRNA-200家族與許多腫瘤的進展和轉移密切相關，miRNA-200家族共有5個成員組成，根據其“種子序列”不同又可分為兩個亞族：miRNA-200c、miRNA-141和miRNA-200a、miRNA-200b及miRNA-429，前者共同序列“AAUACU”；后者為“AACACU”, 兩者之間相差一個核苷酸(C和U)，因它們擁有不同的“種子序列”，所以具有不同的結合特異性，調節(jié)的靶基因也有細微的差別，但它們仍有許多共同的靶基因。研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌、子宮內膜癌、前列腺癌等多種腫瘤中，miRNA-200家族的表達明顯低于腫瘤附近的正常組織[9-16]。本研究利用qRT-PCR測定各組miRNA-200家族的表達水平發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織組相比，ACP組中miRNA-200家族表達整體趨勢是下降的，其中miRNA-200c的下降最為明顯，差異性顯著。而PCP相比于正常腦組織，其miRNA的表達雖然略有下降，但是并不明顯，也沒有特別突出的亞型。與PCP相比，ACP中miRNA-200家族整體也是下降的，同樣是miRNA-200c這個亞型下降最為明顯。本研究結果說明miRNA-200家族在CP，特別是ACP中表達明顯下降，可能起到類似于抑癌基因的作用。

miRNA-200家族主要在上皮細胞中表達，是上皮細胞的標志物[17]，同時在上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的過程中扮演了重要角色。E盒結合鋅指蛋白(zinc finger E-box binding homeobox，ZEB)是重要的細胞核轉錄因子，包括ZEB1/ZEB2，可以直接抑制E-鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)的表達[18]。miRNA-200家族可直接抑制ZEB1/ZEB2，進而調控EMT[19]。Oba等[20]通過miRNA與ZEB-2的mRNA3′UTR互補序列分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-200家族對ZEB-2作用顯著，與對照組相比，能抑制ZEB-2 80%的活性。miRNA-200家族過表達后，可結合在ZEB1/ZEB2的3′UTR區(qū)使其靶向降解，并使E-cadherin表達上調，從而抑制EMT的發(fā)生，降低腫瘤的侵襲性和轉移性。同時，ZEB1/ZEB2也能直接抑制miRNA-200家族的轉錄，兩者之間形成一個負反饋環(huán)路，起到相互抑制的作用。本研究利用qRT-PCR技術測定各組ZEB1/ZEB2的表達水平發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，ACP組中ZEB1/ZEB2表達整體趨勢是上調的，其中ZEB2的上調最為明顯，差異性顯著；而PCP相比于正常組織，ZEB1/ZEB2變化不顯著；與PCP相比，ACP的組織中ZEB1/ZEB2表達整體也是上調的；由此可知，在ACP中ZEB1/ZEB2的表達明顯上調。利用免疫組化技術檢測CP中E-cadherin的表達，結果表明ACP組相對于PCP組，E-cadherin的表達下降了。綜上，在ACP中，存在這樣一個通路，隨著miRNA-200家族表達明顯下調，導致ZEB1/ZEB2表達上調，進而使E-cadherin的表達受到了明顯抑制。

β-連環(huán)蛋白(β-catenin)由原癌基因CTNNB1編碼，是一種多功能、高度保守的細胞骨架蛋白。β-catenin可以存在細胞質、細胞膜和細胞核中，研究發(fā)現(xiàn)正常神經細胞中的β-catenin主要在細胞膜中表達，而ACP中β-catenin在細胞膜內低表達，在細胞質及細胞核內過表達，并且這些細胞多位于實體瘤邊緣浸潤性較強的位置[21]。本研究利用qRT-PCR技術測定各組CTNNB1的表達水平發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，ACP組中CTNNB1表達整體趨勢是上調的，差異性顯著；而PCP相比于正常組織，CTNNB1變化不顯著；與PCP相比，ACP的組織中CTNNB1表達整體也是上調的；由此可知，在ACP中CTNNB1的表達明顯上升。通過免疫組化測定，與PCP相比，ACP的β-catenin的表達有升高，且分布在細胞質或者細胞核，而PCP中β-catenin偏向于分布在細胞膜上。綜上，在ACP中，隨著miRNA-200家族表達的明顯下調，其與靶基因CTNNB1的結合減少，導致CTNNB1表達上調，使其編碼蛋白β-catenin的表達升高。

相對于正常腦組織，ACP組中miRNA-200家族表達整體下降，其中miRNA-200c的下降最為明顯，mRNA(ZEB1/ZEB2,CTNNB1)表達整體上調，其中ZEB2的上調最為明顯；PCP相比于正常腦組織，miRNA-200家族的表達略有下降，但是并不明顯，也沒有特別突出的亞型，mRNA(ZEB1/ZEB2,CTNNB1)變化不顯著；與PCP相比，ACP組織中miRNA-200家族整體下降，同樣是miRNA-200c這個亞型下降最為明顯，mRNA(ZEB1/ZEB2,CTNNB1)的表達整體上調。ACP的β-catenin的表達升高，且分布在細胞質或者細胞核，而PCP中β-catenin偏向于分布在細胞膜上。ACP相對于PCP，E-cadherin的表達下降。綜上所述，miRNA-200家族在CP中可能起到類似于抑癌基因的作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。